Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van de opname van glutamaat met behulp van radioactief gelabeld L-[3H]-glutamaat in acute transversale plakjes verkregen uit de gereseceerde hippocampus van knaagdieren

846 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62292

⸱

2 oktober 2021

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een betrouwbare en eenvoudige manier om ex vivo acute hippocampale transversale plakjes van muizen en ratten te verkrijgen met behulp van een weefselhakselaar. Plakjes verkregen uit gereseceerde hippocampi kunnen worden ingediend voor analyse van de functionele glutamaatopname om de homeostase van het glutamaterge systeem te onderzoeken.

Samenvatting

Verwijdering van glutamaat uit de extracellulaire ruimte door Na+-afhankelijke transporters met hoge affiniteit is essentieel om ervoor te zorgen dat de intrinsieke connectiviteitsmechanismen van de hersenen goed werken en de homeostase wordt gehandhaafd. De hippocampus is een unieke hersenstructuur die hogere cognitieve functies beheert en is het onderwerp van verschillende onderzoeken naar neurologische aandoeningen. Het onderzoek naar fysiologische en pathologische mechanismen in knaagdiermodellen kan baat hebben bij acute hippocampale plak (AHS) preparaten. AHS heeft het voordeel dat het betrouwbare informatie over de celfunctie biedt, aangezien de cytoarchitectuur en synaptische circuits behouden blijven. Hoewel AHS-preparaten vaak worden gebruikt in neurochemische laboratoria, is het mogelijk om enkele methodologische verschillen in de literatuur te vinden. Gezien het feit dat onderscheidende plakvoorbereidingsprotocollen de geanalyseerde hippocampusregio's kunnen veranderen, stelt dit huidige protocol een standaardtechniek voor voor het verkrijgen van transversale AHS van gereseceerde hippocampus. Dit eenvoudig uit te voeren protocol kan worden gebruikt in experimentele modellen van muizen en ratten en maakt verschillende ex vivo-benaderingen mogelijk voor het onderzoeken van neurochemische dynamiek (in dorsale, intermediaire en ventrale hippocampus) in verschillende achtergronden (bijv. transgene manipulaties) of na in vivo manipulaties (bijv. farmacologische behandelingen of geschikte knaagdiermodellen om klinische aandoeningen te bestuderen). Na het ontleden van de hippocampus van de hersenen van knaagdieren, werden transversale plakjes langs de septo-temporele as (300 μm dik) verkregen. Deze AHS bevatten verschillende delen van de hippocampus en werden onderworpen aan een individueel neurochemisch onderzoek (als voorbeeld: neurotransmittertransporters die hun respectievelijke substraten gebruiken). Aangezien de hippocampus een hoge dichtheid van excitatoire synapsen vertoont en glutamaat de belangrijkste neurotransmitter in de hersenen is, is het glutamaterge systeem een interessant doelwit voor in vivo waargenomen verschijnselen. Het huidige protocol biedt dus gedetailleerde stappen om de opname van glutamaat in ex vivo AHS te onderzoeken met behulp van L-[3H]-glutamaat. Het gebruik van dit protocol om de hippocampusfunctie te onderzoeken, kan helpen om de invloed van het glutamaatmetabolisme op mechanismen van neuroprotectie of neurotoxiciteit beter te begrijpen.

Inleiding

De hippocampus, een hersenstructuur die diep begraven ligt in de mediale temporale kwab van elk halfrond, waar hoge cognitieve functies liggen, is een van de meest bestudeerde entiteiten van het centrale zenuwstelsel (CZS). De functie van de hippocampus is sterk gerelateerd aan het declaratief en ruimtelijk geheugen. Deze structuur speelt ook een rol bij emotioneel gedrag en bij de regulatie van hypothalamische functies 1,2,3,4. Sinds het werd bevestigd, vinden belangrijke mechanismen van geheugenvorming en -opslag plaats in dit gebied en begon het veld het hippocampusgebied grondig te onderzoeken. Dienovereenkomstig blijft het gebruik van diermodellen die lijken op menselijke hersenaandoeningen die verband houden met hippocampusfuncties, zoals de ziekte van Alzheimer, epilepsie, ernstige depressie en stress, groeien.

Bij knaagdieren is de hippocampus een gebogen structuur die begint bij het mediale septum in de richting van de ventrale temporale cortex. Langs de lengteas kan de hippocampus worden onderverdeeld in drie verschillende regio's, elk gerelateerd aan specifieke circuits1. Het bovenste deel vormt de dorsale/septale hippocampus, het onderste deel vormt de ventrale/temporale hippocampus en het gebied ertussen wordt beschouwd als de intermediaire hippocampus. Er is uitgebreide literatuur over de verschillen in cellulaire projecties naar elk deel, evenals rapporten van specifieke cognitieve aspecten die door elk deel worden verwerkt 5,6. Wat de interne organisatie betreft, kunnen de hippocampusregio's worden gescheiden door hun functionele gebieden. Het gebied van de Cornu ammonis (CA) is onderverdeeld in CA1, CA2 en CA3 en strekt zich uit door het bovenste deel van de hippocampus, boven de gyrus dentatus (DG) en het subiculum, de meest interne hippocampale delen (Figuur 1). De synapsen in deze regio's ondergaan een continue herschikking en vertonen neurogene en plastische processen gedurende het hele leven3. Verschillende studies hebben al aangetoond dat verschillende experimentele manipulaties in de hippocampus resulteren in cognitieve invaliditeit7. Wat betreft de beoordeling van biochemische en moleculaire veranderingen, zijn technieken met behulp van acute hersenplakjes een uitstekend hulpmiddel om de kennis over verschillende aspecten van de hippocampus te verbeteren.

Vanwege de precisie en reproduceerbaarheid gebruikten veel onderzoeken die aspecten van neurotransmissiegerelateerde verschijnselen onderzochten (enzymactiviteit, opname of afgifte) transversale AHS van gereseceerde hippocampus verkregen door weefselhelikopter 8,9,10,11,12. Deze snijtechniek, gevolgd door een beoordeling van de opname, is geschikt voor geavanceerde neurochemische experimenten waarbij de transportactiviteit van hippocampusweefsel behouden moet blijven. Daarvoor heeft het gebruik van een weefselhakker de voorkeur, omdat deze sneller is dan de vibratoom en de AHS op het juiste moment voor experimenteel gebruik met de juiste nauwkeurigheid voorziet.

De prikkelende neurotransmissie in de hersenen wordt tot stand gebracht door glutamaat, de meest voorkomende neurotransmitter, ook in de hippocampus, die in grotere mate afhankelijk is van glutamaatsignalering13,14. Deze overvloed aan neurotransmitters wordt streng gecontroleerd in de extracellulaire omgeving. In intracellulaire blaasjes kan het echter oplopen tot 100 mM15. Eenmaal vrijgegeven in de synaptische spleet, wordt glutamaat niet gemetaboliseerd en moet het worden verwijderd om excitotoxiciteit te voorkomen, meestal veroorzaakt als reactie op een overbelasting van glutamaat 14,16. Het enige mechanisme dat toxiciteit scheidt van normale signalering is natriumafhankelijk transport door de activiteit van eiwitten die zich in de plasmamembranen van voornamelijk gliacellen bevinden 14,17,18,19. Deze transporters [GLAST (EAAT1) en GLT-1 (EAAT2)] reguleren de extracellulaire glutamaatniveaus strak en kunnen worden gemoduleerd door een breed scala aan factoren, zoals DNA-transcriptie, mRNA-splitsing en -afbraak, eiwitsynthese en targeting, aminozuurtransportactiviteit en ionkanaalactiviteiten 20,21,22,23. Dienovereenkomstig kan hun activiteit worden gemeten door het transport van radioactief gelabeld substraat, als glutamaat.

Het gebruik van radioactief gelabelde substraten is een voorkeursmethode voor het kwantificeren van transporteractiviteit, omdat ze het mogelijk maken om dynamische mechanismen zoals transport door celmembranen te traceren. Naast hun hoge gevoeligheid en specificiteit, zijn de voordelen van radiotracer-experimenten onder meer hun eenvoud en lage kosten in vergelijking met concurrerende technologieën zoals massaspectrometrie24. Door slechts kleine hoeveelheden tracer te gebruiken, worden de fysiologische niveaus van substraten ook niet veranderd, waardoor een representatiever beeld ontstaat van het werkelijke metabole activiteitsscenario.

De beschikbaarheid van ex vivo experimentele benaderingen is van cruciaal belang ter ondersteuning van fundamenteel onderzoek naar het identificeren van nieuwe moleculaire doelen en activiteiten op het gebied van het ontdekken van geneesmiddelen. Dus, gezien de relevantie van de glutamaatopname voor de homeostase van het glutamaterge systeem en het hoge overwicht van glutamaterge synapsen in de hippocampus, laat dit protocol zien hoe de glutamaatopnameactiviteit kan worden beoordeeld in een snelle en gemakkelijk te reproduceren methode met behulp van transversale AHS van de gereseceerde hippocampus. Deze test maakt gebruik van radioactief gelabeld L-[3H]-glutamaat, dat kwantitatieve vergelijkingen en duidelijke visualisatie van de resultaten mogelijk maakt, en kan worden aangepast voor gebruik met specifieke of aangepaste substraten, over een breed scala aan reactieomstandigheden25.

Acute hersenplakjes bieden veel voordelen en zijn gebruikt om functieverandering te ondersteunen onder farmacologische en genetische manipulaties 26,27,28. Het gebruik ervan heeft baat bij het volgende: (i) het behoud van de neurochemische functionaliteit en de cel-tot-cel interacties; (ii) de mogelijkheid om talrijke farmacologische en genetische manipulaties uit te voeren om routes te onderzoeken die aan de basis liggen van neuronale en gliale functies; (iii) nauwkeurige controle van de extracellulaire omgeving; en (iv) goede experimentele toegang tot verschillende hippocampusgebieden (zoals CA1, CA3 of DG), die afhankelijk van de snijmethode in dezelfde plak worden gehouden. Aangezien onderscheidende plakvoorbereidingsprotocollen de blootgestelde hippocampusregio's kunnen veranderen, stelt dit protocol een standaardtechniek voor voor het verkrijgen van transversale AHS van de gereseceerde hippocampus. Dit eenvoudig uit te voeren protocol kan worden gebruikt in knaagdiermodellen en kan verschillende ex vivo-benaderingen mogelijk maken die neurochemische dynamica onderzoeken in verschillende achtergronden of na in vivo manipulaties29,30 (Figuur 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (projectgoedkeuring # 33732/CEUA-UFRGS). Alles werd in het werk gesteld om het ongemak en het aantal dieren dat in de experimenten werd gebruikt tot een minimum te beperken.

1. Voorbereiding van Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)

  1. Voeg in een bekerglas van 1 l ongeveer 0,5 l steriel of dubbel gedestilleerd water toe en begin krachtig te roeren op een magnetische roerder. Voeg de volgende HBSS-componenten toe (in mM): 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-glucose (zie tabel 1).
  2. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH of HCl voordat u 1,26 mM CaCl2 toevoegt om neerslag te voorkomen. Voeg dit zout heel langzaam en onder roeren toe. Breng het op tot een volume van 1 L met steriel of dubbel gedestilleerd water. Deze buffer zal worden gebruikt om het weefsel te wassen en om de AHS tijdens het experiment in een levensvatbare staat te houden. Het levert anorganische ionen met behoud van een fysiologische pH en osmotische druk.
    OPMERKING: De toevoeging van tweewaardige kationen gebeurt na titratie van de pH om neerslag te voorkomen.
  3. Scheid twee verschillende fracties van HBSS: de ene wordt in een waterbad bij 37 °C bewaard en gebruikt tijdens het opnameparadigma, terwijl de andere ijskoud wordt gehouden (4 °C) en wordt gebruikt voor wasbeurten voor en na het experiment.
    OPMERKING: Het is mogelijk om van elk zout voorraadoplossingen te bereiden en deze bevroren te bewaren tot gebruik, in de vriezer te bewaren (-20 °C) en binnen enkele weken te gebruiken.

2. Natriumvrije HBSS bereiden

  1. Voordat u de componenten voor natriumvrije HBSS mengt, moet u van tevoren twee andere oplossingen bereiden: Glucamine-HCl (137 mM) en Glucamine-HEPES (4,17 mM). Meng equimolaire concentraties van NMDG-base en HCl om de Glucamine-HCl-oplossing te verkrijgen. Voer dezelfde procedure uit met 2,0 M HEPES-vrij zuur om de NMDG-HEPES-oplossing te verkrijgen (zie tabel 2).
  2. Voeg in een bekerglas van 0,5 l ongeveer 0,2 l steriel of dubbel gedestilleerd water toe en begin krachtig te roeren in een magnetische roerder. Voeg de volgende buffercomponenten toe (in mM): 137 Glucamine-HCl, 4,17 Glucamine-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 en 5,55 D-glucose (zie tabel 2).
  3. Stel de pH in op 7,4 met KOH of HCl en blijf roeren. Voeg heel langzaam en onder roeren 1,26 mM CaCl2 toe. Breng de oplossing tot een volume van 0,3 l met steriel of dubbel gedestilleerd water.
    OPMERKING: Deze buffer wordt gebruikt om de niet-natriumafhankelijke glutamaatopname te meten, waardoor de passieve/niet-specifieke glutamaatopname kan worden gemeten. Na het experiment wordt deze parameter afgetrokken van de totale glutamaatopname om de natriumafhankelijke opname te bepalen.
  4. Na bereiding kan deze buffer in de vriezer (-20 °C) worden opgeslagen en daarna worden gebruikt in volgende experimenten. Hetzelfde geldt voor de NMDG-oplossingen.
  5. Houd tijdens het experiment de natriumvrije HBSS altijd ijskoud.

3. Organiseren van het materiaal voor hippocampus dissectie van ratten

  1. Organiseer het dissectiegebied naast de gootsteen voordat u met het experiment begint. Plaats een specifieke guillotine voor ratten (voor muizen is het mogelijk om een scherpe schaar te gebruiken) in de gootsteen om de bank schoon te houden.
  2. Plaats de chirurgische instrumenten en andere materialen voor het verwijderen van de hersenen en hippocampusdissectie in volgorde van gebruik en zo dicht mogelijk bij waar ze nodig zijn (zie Materiaaltabel). Plaats de petrischaal in een ijsemmer. Houd ook een plastic zak in de buurt voor het weggooien van het karkas.
  3. Bereid beide HBSS-oplossingen in de aanbevolen concentratie voor gebruik. De natriumvrije HBSS kan voor het experiment worden ingevroren en ontdooid.
    1. Scheid natriumhoudende HBSS in twee afzonderlijke porties, zoals eerder aanbevolen: een verwarmd bij 37 °C en een ander bij 4 °C die zal worden gebruikt voor dissectie. Ontdooi natriumvrije HBSS en bewaar bij 4 °C.
  4. Gebruik 3% isofluraan31 om anesthesie op te wekken. Voordat u met het experiment begint, moet u de afwezigheid van hoornvliesreflex en nociceptieve stimulatie van de achterpoot verifiëren.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het kiezen van het juiste verdovingsmiddel, aangezien dit niet mag interfereren met parameters die worden onderzocht. Voor dit protocol wordt het gebruik van inhalatie-anesthetica (bijv. isofluraan)32 aanbevolen.

4. Euthanasie van de rat

  1. Euthanaseer het knaagdier door gebruik te maken van de goedgekeurde methoden door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), evenals door de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicaties nr. 8023, herzien in 1978).
  2. Onthoofd de rat met behulp van een guillotine vlak voor de eerste halswervel.
  3. Leg het hoofd op een schone papieren handdoek die is bevochtigd met een koude zoutoplossing. Verwijder de hoofdhuid volledig met de chirurgische schaar maat S, evenals de huidspier met als doel de hechtingen op het bovenste oppervlak van de schedel volledig bloot te leggen. Start deze procedure voorzichtig, beginnend bij het achterhoofdsbeen en naar achteren naar het neusbeen.
    OPMERKING: Als het experimentele model uit muizen bestaat, gebruik dan een scherpe schaar om de kop te verwijderen. Zorg ervoor dat u net achter de schedel snijdt om overtollig weefsel buiten te sluiten.

5. Verwijdering van het rattenbrein

  1. Voer de hersenverwijdering zo snel mogelijk uit. Maak met een geschikte bottang een enkele snede tussen beide ooggaten die beide openingen in de schedel van de rat verbinden. Plaats daarna een punt van de chirurgische schaar maat S in het foramen magnum en maak een enkele snede zijdelings in de schedel. Herhaal dit voor de andere kant.
  2. Snijd de schedelplaten van de achterhoofdsplaat, vervolgens langs de middellijn van de pariëtale platen en ten slotte naar de frontale plaat naar de neus. Zorg ervoor dat de kop van het knaagdier stevig wordt vastgehouden en dat de druk van de hersenen wordt weggeleid om beschadiging van het onderliggende weefsel te voorkomen.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de druk wordt weggeleid van de hersenen om beschadiging van het onderliggende weefsel te voorkomen. Bij jonge ratten en muizen is het mogelijk om de schedel te knippen met een kleine chirurgische schaar.
  3. Verwijder voorzichtig de occipitale en pariëtale platen van beide hemisferen met behulp van een spatel of tang. Inspecteer zorgvuldig op dura-materie die aan de schedelbeenderen is gehecht en over het oppervlak van de hersenen is uitgerekt.
  4. Verwijder de hersenen onmiddellijk met de dunne spatel met twee uiteinden en plaats de hele hersenen voorzichtig op een ijskoud petrischaaltje bedekt met filterpapier. Met de kunststof pasteurpipet bevochtigen met een ijskoude zoutoplossing. Begin onmiddellijk met het ontleden van de hippocampi van beide hersenhelften zoals hieronder wordt uitgelegd.
  5. Snijd voorzichtig het cerebellum uit de hele hersenen met het #11 scalpelmes. Om de hersenhelften volledig te scheiden, loopt een scalpelmes door de intrahemisferische spleet. Bevochtig de plastic pasteurpipet met de plastic pasteurpipet regelmatig met ijskoude HBSS-buffer om het weefsel nat en geconserveerd te houden.
  6. Neem elke hersenhelft afzonderlijk, verwijder de hersenstam en de middenhersenen van de bovenliggende cortex met een irisschaar. Snijd voorzichtig met de chirurgische schaar de hersenstam/middenhersenen/thalamus door, terwijl u met een dunne borstel deze hersenstructuren naar beneden duwt en trekt. Hieronder is het mogelijk om de hippocampus (mediaal oppervlak) en de laterale ventrikel te observeren. De cortex met de hippocampus zou nu vrij moeten zijn van de hersenstam.

6. Hippocampi-dissectie van ratten

  1. Om de hippocampus te verwijderen, plaatst u een hersenhelft in het coronale vlak met de pariëtale cortex naar beneden gericht. Op dit moment is het mogelijk om de witte fimbriavezels te observeren die een ondiepe hyperbool vormen aan de onderkant van de hippocampus.
  2. Veranker heel voorzichtig, met de niet-dominante hand, het hersenweefsel met een dun pincet. Plaats met je dominante hand een ander pincet onder de caudale punt van de hippocampus.
  3. Veranker de mediale wittestofbanen en plaats het pincet volledig onder de hippocampus om het voorzichtig te scheiden van de rest van de hersenen. Oefen druk uit terwijl u de tweede punt iets naar voren en zijwaarts beweegt. Als het goed wordt gedaan, moet de hippocampus op het filterpapier terechtkomen.
  4. Om de hippocampusdissectie te voltooien, verwijdert u het reserveweefsel met hetzelfde pincet (meestal de resterende cortex, bloedvaten en witte stof). Herhaal dezelfde methodologie voor het tweede halfrond.
  5. Zodra beide hippocampi zijn verwijderd, brengt u deze over naar een petrischaal met HBSS op de ijsemmer en brengt u deze over naar de snijtafel boven het mes in de weefselhakselaar. Zorg ervoor dat u de dorsale en ventrale gebieden goed identificeert als het onderzoek vereist dat ze afzonderlijk worden geanalyseerd.
    OPMERKING: Het is belangrijk om tijdens dissectie altijd de ventrale en dorsale delen van de hippocampus te onderscheiden. Door dit te doen, zal het voorste uiteinde naar boven wijzen33. Dit deel van de hippocampus is iets dunner dan het achterste uiteinde.

7. Bereiding van plakjes

OPMERKING: Terwijl u het operatiemateriaal op de bank plaatst (sessie 2), bereidt u de weefselhakker voor om de transversale plak van de gereseceerde hippocampus te verkrijgen.

  1. Stel de parameters in de weefselhakmolen in voordat u deze gebruikt. De Chopper kan plakjes snijden van 100 tot 400 μm; Stel het in op 300 μm. Bovendien wordt een bereik van 60-80 slagen per minuut aanbevolen, omdat het de weefselintegriteit tijdens de snijprocedure behoudt.
  2. Na alle procedures die in sessie 2 zijn uitgevoerd, nadat de hippocampi uit de hersenen zijn verwijderd en op het filterpapier zijn geplaatst, bevochtigd met een koude zoutoplossing op een gladde polypropyleen steun, lijnt u elke hippocampus uit op het filterpapier voordat u ze onderwerpt aan de hakprocedure.
  3. Plaats de hippocampus tegelijk op de ronde roestvrijstalen snijtafel van de weefselhakselaar, loodrecht op de snijmessen om de transversale hippocampusplakjes langs de septo-temporele as te verkrijgen. Voordat u met het hakproces begint, bevochtigt u het mes licht met isopropylalcohol. Deze procedure zorgt ervoor dat het weefsel niet aan het mes blijft plakken, waardoor het snijden soepeler en preciezer kan worden.
  4. Nadat de apparatuur is ingeschakeld, wordt het mes in de hakarm omhoog en neergelaten, waardoor het weefsel in de geselecteerde dikte wordt gesneden. Dit is een snel proces en normaal gesproken wordt het weefsel na een minuut goed doorgesneden. Het is mogelijk om meer dan één hippocampus tegelijk te hakken als ze goed gescheiden op de snijtafel worden bewaard.
  5. Om de plakjes te scheiden, neemt u elk gesneden monster voorzichtig uit de weefselhakmolen met behulp van de spatel met twee uiteinden en dompelt u het in een petrischaaltje met ijskoude zoutoplossing. Knijp met twee dunne borstels voorzichtig in de hippocampus en scheid de plakjes. Zorg ervoor dat u tijdens dit proces de integriteit van de slice behoudt.
    1. Voer dit experiment uit in drievouden, selecteer daarom 6 plakjes uit elk monster: 3 plakjes voor de totale glutamaatopname en 3 voor de niet-specifieke opname.
  6. Breng met de borstel elk plakje voorzichtig over van de petrischaal naar een bord met 24 putjes met: (i) 1 ml HBSS; en (ii) 1 ml HBSS-natriumvrij. Identificeer de put/plaat met de corresponderende experimentele groepen en voer de analyse ten minste in drievoud uit.
    OPMERKING: Vanwege een in de tijd beperkt probleem, als het experiment in drievoud wordt uitgevoerd, wordt het aantal dieren/groepen beperkt tot slechts 6 tegelijk (één hippocampus per dier in 5 minuten opname). Dit betekent dat het L-[3H]-glutamaat elke 15 s wordt toegediend totdat alle plakjes zijn geïncubeerd. Om de reactie te stoppen, moet hetzelfde interval in acht worden genomen om ervoor te zorgen dat alle monsters worden blootgesteld aan een incubatietijd van 5 minuten.

8. Glutamaatopname test

  1. Bereid tijdens de stabilisatie van de plakjes in de respectieve buffer (HBSS of natriumvrij HBSS) de radioactieve oplossing voor door L-[3H]-glutamaat in steriel water te verdunnen tot een eindconcentratie van 4,5 μCi/ml in een eindvolume dat 20 μl per plak plus wat overmaat toelaat, waardoor het gebrek aan radioactieve input aan het einde van de batch wordt voorkomen; aangezien het nodig zal zijn om te kwantificeren hoeveel desintegraties per minuut (DPM) in het begin aan elk segment werden aangeboden.
    OPMERKING: Voor elke plaat met 24 putjes wordt aanbevolen om 500 μL 4,5 μCi/ml L-[3H]-glutamaat te bereiden vanwege de totale incubatietijd die nodig is voor de opname van L-[3H]-glutamaat (5 min) en de tijd om elke 20 μL aliquoot (0,33 μCi in elk putje) te pipetteren, zoals hieronder wordt uitgelegd. De voorraadconcentratie van L-[3H]-glutamaat is gewoonlijk 1,0 mCi/ml, dus bereid een verdunning van 1:200 voor om op de plakjes aan te brengen.
  2. Verwijder na 15 minuten pre-incubatie in HBSS de buffer volledig met een pasteurpipet en vervang deze door aan de plakjes 280 μl van een van de volgende stoffen toe te voegen: i) gewone HBSS (37 °C) voor de totale opname; of ii) natriumvrij HBSS (4 °C) voor niet-specifieke opname. Het is belangrijk op te merken dat de totale opname moet worden uitgevoerd op een verwarmingsplaat bij 37 °C, terwijl de niet-specifieke opname op ijs wordt uitgevoerd.
  3. Bereid een timer voor en stel het begin van het experiment in bij het toevoegen van 20 μL input in de eerste put met een plak. Wacht 15 - 20 s (afhankelijk van het aantal plakjes in de plaat) en voeg de radioactieve input toe aan de volgende put enzovoort tot het einde van de plakjeshoudende putjes. Verdeel 20 μL input over alle putjes, altijd rekening houdend met de totale incubatietijd (5 min).
  4. Zodra elk van de putjes met plakjes in de plaat is gevuld, wacht u tot de eerste plak 5 minuten incubatie met L-[3H]-glutamaat heeft voltooid. Verwijder vervolgens de incubatiemedia onmiddellijk in een geschikte kolf voor radioactief afval.
  5. Voeg direct na het verwijderen snel 300 μL ijskoude HBSS toe en verwijder deze voorzichtig. Herhaal deze procedure nog twee keer in elk putje en voltooi drie wasbeurten voor elke plak. Zorg ervoor dat u de natriumvrije HBSS gebruikt voor het wassen van de plakjes die zijn gewijd aan de niet-specifieke opnamemeting. Nadat u alle plakjes in de plaat hebt gewassen, voegt u 300 μL 0,5 M NaOH toe aan elk putje en bewaart u de plaat een nacht beschermd met parafilm bij 4 °C.

9. Het radioactieve L-[3H]-glutamaat tellen

  1. Label de volgende dag zoveel buisjes als plakjes in het experiment en verzamel de inhoud van het putje voor elk buisje. Zorg ervoor dat de plakjes volledig zijn opgelost in de lysisoplossing. Homogeniseer het monster indien nodig met behulp van een naald van 26 gauge die is gekoppeld aan een spuit van 1 ml.
  2. Voeg 1,2 ml scintillatievloeistof toe aan een eindvolume van ongeveer 1,5 ml en homogeniseer alle monsters in een vortex voordat u ze elk 60 s in een scintillatieteller afleest.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de detectieparameters zijn ingesteld op tritium en dat het resultaat in DPM wordt geleverd.

10. Berekeningen

  1. Zet de resultaten van de scintillatieteller om in de radioactiviteit die wordt uitgezonden door het reagens dat in het plakje is opgesloten en dat de opgenomen hoeveelheid glutamaat weergeeft. Trek de waarde voor de niet-specifieke opname af van het resultaat dat is verkregen met de reguliere HBSS. Eén μCi komt overeen met 2,22×106 DPM.
  2. Door de hoeveelheid μCi en de oorspronkelijke concentratie van [3H]L-glutamaat te kennen (informatie die gewoonlijk in de kolf of het gegevensblad van het reagens wordt verstrekt), berekent u het L-[3H]-glutamaat dat door elke plak wordt opgevangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De opname van glutamaat is een van de belangrijkste mechanismen die de neurotransmissie in de hersenen regelen. Met name de hippocampus is een kritieke plaats in glutamaatsignalering en is een belangrijk knooppunt dat geheugen, cognitie en emoties in de hersenen met elkaar verbindt. Volgens het protocol werden volwassen mannelijke Wistar-ratten gebruikt om representatieve resultaten te genereren. Dieren werden verdoofd met isofluraan 3% totdat ze bewusteloos waren. Na het ontleden van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde protocol toont een eenvoudig uit te voeren beoordeling van de opname van glutamaat met behulp van plakjes hippocampus. De resultaten tonen aan dat AHS regelmatig ongeveer 60 fmol radioactief gelabeld L-[3H]-glutamaat opneemt, dat de dikte van de plak (eiwithoeveelheid) geen invloed had op de opname van L-[3H]-glutamaat (gegevens niet getoond), en dat de dorsale, tussenliggende en ventrale delen van de hippocampus vergelijkbare prestaties vertoonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Auteurs ontvangen financiële steun van het Braziliaanse Nationale Instituut voor Wetenschap en Technologie op het gebied van Excitotoxiciteit en Neuroprotectie [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] en [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#11 scalpelbladSwann-Morton525
100 mm glazen petrischaalAlgemene leveranciers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42,5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-wells celkweekplaatFalcon353047
BeckerAlgemene leveranciers
Bladen voor de weefsel chopperWilkinson3241
BottangErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-AsparaginezuurPerkinElmerNET581001MC11,3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris schaarErwin Guth8,00,040
IsofluraanCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-GlutamijnzuurPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Kunststof Pasteur pijpjeAlgemene leveranciers
ScintillatievloeistofPerkinElmer1200.437 voor 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Kleine chirurgische schaarErwin Guth8,00,040
Kleine pincettenErwin Guth6,00,131
Reserve snijschijven voor de chopperAlgemene leveranciers
Standaard schaarErwin Guth8,00,010
Dunne borstels (maat 0 of 2)Algemene leveranciers
Dunne dubbelzijdige spatelErwin Guth470.260E
Weefsel ChopperTed Pella, Inc.10180

Referenties

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Radiogemarkeerd glutamaathippocampusplakjesknaagdierhippocampusneurotransmittertransporteursex vivo analyseglutamaattransporteurssynaptische circuitsneurochemische dynamiek

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.