Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen

14.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62299

⸱

15 maart 2021

 ,  ,  , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor genbewerking in primaire menselijke T-cellen met behulp van CRISPR Cas-technologie om CAR-T-cellen te wijzigen.

Samenvatting

Adoptieve celtherapieën met behulp van chimere antigeenreceptor T-cellen (CAR-T-cellen) hebben een opmerkelijke klinische werkzaamheid aangetoond bij patiënten met hematologische maligniteiten en worden momenteel onderzocht voor verschillende solide tumoren. CAR-T-cellen worden gegenereerd door T-cellen uit het bloed van een patiënt te verwijderen en ze te manipuleren om een synthetische immuunreceptor tot expressie te brengen die de T-cellen omleidt om doeltumorcellen te herkennen en te elimineren. Genbewerking van CAR-T-cellen heeft het potentieel om de veiligheid van de huidige CAR-T-celtherapieën te verbeteren en de werkzaamheid van CAR-T-cellen verder te verhogen. Hier beschrijven we methoden voor de activering, uitbreiding en karakterisering van menselijke CRISPR-engineered CD19-gerichte CAR-T-cellen. Dit omvat transductie van de CAR lentivirale vector en het gebruik van single guide RNA (sgRNA) en Cas9 endonuclease om genen van belang in T-cellen te targeten. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen universeel worden toegepast op andere CAR-constructies en doelgenen die verder gaan dan de genen die voor deze studie worden gebruikt. Bovendien bespreekt dit protocol strategieën voor gRNA-ontwerp, lead gRNA-selectie en doelgen knock-out validatie om reproduceerbaar een hoog-efficiënte, multiplex CRISPR-Cas9-engineering van klinische kwaliteit menselijke T-cellen te bereiken.

Inleiding

Chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van adoptieve celtherapieën en kankerimmunotherapie. CAR-T-cellen zijn gemanipuleerde T-cellen die een synthetische immuunreceptor tot expressie brengen die een antigeenspecifiek antilichaamfragment met één keten combineert met signaaldomeinen afgeleid van de TCRzeta-keten en kostenimulatorische domeinen die nodig en voldoende zijn voor T-celactivering en co-stimulatie1,2,3,4 . De productie van CAR-T-cellen begint met het extraheren van de eigen T-cellen van de patiënt, gevolgd door ex vivo virale transductie van de CAR-module en uitbreiding van het CAR-T-celproduct met magnetische kralen die functioneren als kunstmatige antigeen presenterende cellen5. Geëxpandeerde CAR-T-cellen worden opnieuw in de patiënt geïnjecteerd, waar ze kunnen enten, doeltumorcellen kunnen elimineren en zelfs meerdere jaren na infusie kunnen aanhouden6,7,8. Hoewel CAR-T-celtherapie heeft geresulteerd in opmerkelijke responspercentages bij B-cel maligniteiten, is klinisch succes voor solide tumoren uitgedaagd door meerdere factoren, waaronder slechte T-celinfiltratie9, een immunosuppressieve tumor micro-omgeving10, antigeen dekking en specificiteit, en CAR-T cel disfunctie11,12 . Een andere beperking van de huidige CAR-T-celtherapie omvat het gebruik van autologe T-cellen. Na meerdere rondes chemotherapie en hoge tumorbelasting kunnen CAR-T-cellen van slechte kwaliteit zijn in vergelijking met allogene CAR-T-producten van gezonde donoren, naast de tijd en kosten die gepaard gaan met de productie van autologe CAR-T-cellen. Genbewerking van het CAR-T-celproduct door CRISPR/Cas9 vertegenwoordigt een nieuwe strategie om de huidige beperkingen van CAR-T-cellen te overwinnen13,14,15,16,17.

CRISPR/Cas9 is een tweecomponentensysteem dat kan worden gebruikt voor gerichte genoombewerking in zoogdiercellen18,19. De CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 kan plaatsspecifieke dubbelstrengsbreuken induceren geleid door kleine RNA's door base-pairing met de doel-DNA-sequentie20. Bij afwezigheid van een reparatiesjabloon worden dubbelstrengsbreuken gerepareerd door de foutgevoelige niet-homologe eindvoeging (NHEJ) -route, resulterend in frameshiftmutaties of voortijdige stopcodons door insertie- en deletiemutaties (INDELs)19,20,21. Efficiëntie, gebruiksgemak, kosteneffectiviteit en de mogelijkheid voor multiplex genoombewerking maken CRISPR/Cas9 tot een krachtig hulpmiddel om de werkzaamheid en veiligheid van autologe en allogene CAR-T-cellen te verbeteren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om TCR-gerichte T-cellen te bewerken door de CAR-constructie te vervangen door een TCR. Bovendien kunnen allogene CAR-T-cellen met een beperkt potentieel om graft versus host-ziekte te veroorzaken, ook worden gegenereerd door genbewerking van de TCR-, b2m- en HLA-locus.

In dit protocol laten we zien hoe CRISPR-engineering van T-cellen kan worden gecombineerd met virale vectorgemedieerde levering van het CAR-Transgen om genoom-bewerkte CAR-T-celproducten te genereren met verbeterde werkzaamheid en veiligheid. Een schematisch diagram van het gehele proces is weergegeven in figuur 1. Met behulp van deze aanpak hebben we een zeer efficiënte gen knock-out aangetoond in primaire menselijke CAR-T-cellen. Figuur 2A beschrijft in detail de tijdlijn van elke stap voor het bewerken en vervaardigen van T-cellen. Strategieën voor gids RNA-ontwerp en knock-out validatie worden ook besproken om deze aanpak toe te passen op verschillende doelgenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke T-cellen werden verkregen via de University of Pennsylvania Human Immunology Core, die werkt volgens principes van Good Laboratory Practice met vastgestelde standaard operationele procedures en / of protocollen voor monsterontvangst, verwerking, bevriezing en analyse in overeenstemming met miata en de universiteit van Pennsylvania ethische richtlijnen.

1. Lentivirale vectorproductie

OPMERKING: De virale producten zijn replicatie-defect gemaakt door scheiding van verpakkingsconstructies (Rev, gag / pol / RRE, VSVg en transferplasmide) in vier afzonderlijke plasmiden, waardoor de kans op recombinatiegebeurtenissen die kunnen resulteren in replicatie-competent virus aanzienlijk wordt verminderd.

  1. Bereid HEK293T-cellen één dag voor de transfectie voor. Plaat ongeveer 6 x 106 cellen in T150 kweekvaten in 30 ml standaard kweekmedia (aangeduid als R10:RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 10 mM HEPES, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine) en incubate 's nachts bij 37 °C. 18-24 uur later moeten de cellen 60-70% confluent zijn en er gezond uitzien (dendritische projecties en uniforme verdeling over de kolf). Als cellen er gezond uitzien, ga dan verder met stap 1.2.
  2. Bereid het transfectiemengsel met lipofectiereagens (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) verpakkingsplasmiden en 15 μg expressieplasmide (CD19bbz scFv gekloond in pTRPE).
    1. Bereid voor elke transfectiereactie één buis met 1 ml minimaal essentiële media met gereduceerd serum plus de vier plasmiden beschreven in stap 1.2, evenals één buis met 2 ml minimaal essentiële media met gereduceerd serum plus 90 μL lipofectiereagens. Combineer deze twee oplossingen door druppelsgewijs het plasmidemengsel van 1 ml toe te voeg aan het 2 ml lipofectie-reagensmengsel. Zorg ervoor dat u de oplossing krachtig mengt door meerdere keren op en neer te pipetteren. Incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Spirateer ondertussen de media uit de HEK293T-celkolf en was de cellen voorzichtig met 10 ml minimaal essentiële media met gereduceerd serum en aspirateer opnieuw.
    3. Voeg voorzichtig het transfectiemengsel (3 ml) van stap 1.2.1 toe aan de benedenhoek van de celkweekkolf met behulp van een serologische pipet van 5 ml. Kantel de kolf voorzichtig om het transfectiemengsel gelijkmatig over de celkweekkolf te verdelen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat u de celmonolaag niet verstoort. Voeg na een incubatietijd van 10 minuten 35 ml R10-media toe en breng de kolf gedurende 24 uur terug naar de incubator.
  3. Verzamel na 24 uur het supernatant uit de HEK293T celkweekkolven en breng het over in conische buizen van 50 ml. Voeg verse R10 toe aan de HEK29T-cellen en plaats de cellen nog eens 24 uur terug in de couveuse. Draai het supernatant (300 x g) naar beneden om celresten te verwijderen en filter het supernatant door een filter van 0,45 μm.
  4. Concentreer het filtraat vanaf stap 1.3 met hoge snelheid ultracentrifugatie (25.000 x g gedurende 2,5 uur of 8000 x g 's nachts (O/N)). Bewaar de 24-uurs viruskorrel bij 4 °C terwijl u het 48-uursvirus poolt.
  5. Herhaal stap 1.3-1.4 voor de 48 uur-verzameling en combineer virusverzamelingen van 24 uur en 48 uur. Pellets uit de 48 h-collectie bevatten een gecombineerde oogst van het lentivirus.
  6. Resuspend virale pellet in ongeveer 1 ml koude R10 en aliquot in injectieflacons van 100 μL. Vries de aliquots onmiddellijk in met droogijs en bewaar bij -80 °C.
  7. Bereken functionele virale titer in transducerende eenheden/ml door een vaste hoeveelheid CD3/CD28 kraal-geactiveerde primaire menselijke T-cellen te transduceren met seriële verdunningen van het lentivirale supernatant. Meet CAR-transductie na 72 uur met flowcytometrie.
    1. Vlek voor de CD19-gerichte CAR met een anti-FCM63 scFv antilichaam. Voor andere chimere antigeenreceptoren, kleuring met behulp van fluorofoor-gelabeld recombinant eiwit dat specifiek is voor de CAR scFv. Virusverdunning die minder dan 20% CAR-positieve cellen genereert door flowcytometrie is de meest nauwkeurige verdunning om virale titer uit te berekenen. Boven de 20% CAR-positieve cellen neemt de kans dat elke positieve cel tweemaal wordt getransduceerd toe, wat resulteert in een onderschatting van het aantal transducerende deeltjes. Bereken de transducerende eenheden per ml (TU/ml) = (aantal getransduceerde cellen x procent CAR-positieve cellen x verdunningsfactor)/(transductievolume in ml).

2. Ontwerp van sgRNA's en genverstoring in primaire menselijke T-cellen

  1. Crispr-sgRNA's ontwerpen
    OPMERKING: Verschillende servers en programma's vergemakkelijken het ontwerp van doelspecifieke sgRNA's. In dit protocol zijn CRISPR-sgRNA's ontworpen met behulp van CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) en het gRNA-ontwerpportaal van het Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
    1. Ontwerp voor elk doelgen zes tot tien sgRNA-sequenties om vroege coderende exonsequenties te targeten.
      OPMERKING: sgRNA moet een hoge on-target werkzaamheid en een lage off-target werkzaamheid hebben. Elk machine learning-algoritme voor het bepalen van de werkzaamheid van sgRNA werkt iets anders. Daarom wordt aanbevolen om meerdere sgRNA-ontwerptools te vergelijken en een lijst van zes tot tien sgRNA samen te stellen voor screening.
  2. Genverstoring in primaire menselijke T-cellen
    1. Verkrijg autologe perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) van gezonde vrijwillige donoren. Een schematische tijdlijn van het protocol wordt beschreven in figuur 2A en hieronder beschreven.
    2. Isoleer CD4+ en CD8+ T-cellen met behulp van in de handel verkrijgbare CD4- en CD8-selectiekits.
    3. Combineer CD4+ en CD8+ T-cellen in een verhouding van 1:1 en incubeer 's nachts bij 3x106 cellen / ml in R10 aangevuld met 5 ng / ml huIL-7 en huIL-15 elk. Toevoeging van IL-7 en IL-15 wordt aanbevolen omdat bekend is dat ze een centraal geheugenfenotype bevorderen en CAR-T-cellen uitgebreid met IL-7 en IL-15 hebben superieure anti-tumor werkzaamheid in vergelijking met IL-2 uitgebreide CAR-T cellen22,23,24.
    4. Tel de volgende dag T-cellen en centrifugeer 5-10 x 106 cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten. Gooi al het supernatant weg en was de celkorrel in minimaal essentiële media met gereduceerd serum. Resuspend de pellet in 100 μL nucleofection-oplossing volgens de instructies van de fabrikant(Tabel met materialen).
    5. Bereid tijdens het wassen van de cellen ribonucleoproteïne (RNP) complex met Cas9 en gRNA door 10 μg Cas9-nuclease te incuberen met 5 μg sgRNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). De molaire verhouding van Cas9 tot sgRNA is 1:2,4. Een mock control die Cas9 en elektroporatieversterker bevat, maar geen sgRNA, wordt aanbevolen.
      OPMERKING: Multiplex-genbewerking kan bij deze stap worden uitgevoerd door RNP-complexen voor elk doelwit afzonderlijk te maken en deze te combineren met cellen op het moment van nucleofection zoals beschreven in de volgende stap. Het kiezen van de reagentia om het RNP-complex te assembleren is de sleutel tot een hoge KO-efficiëntie. Cas9-nucleasen van verschillende leveranciers hebben bijvoorbeeld verschillende off-target effecten en chemisch gemodificeerd gRNA vermindert de toxiciteit voor T-cellen, waardoor de KO-efficiëntie toeneemt.
    6. Combineer de geresuspendeerde cellen uit stap 2.2.4 met het RNP-complex uit stap 2.2.5 en voeg 4,2 μL 4 μM elektroporatieversterker (ssDNA oligonucleotide dat niet-homoloog is aan het menselijk genoom) toe. Meng goed en breng over in elektroporatie cuvetten. Vermijd bubbels omdat ze de elektroporatie-efficiëntie aantasten.
    7. Elektroporaatcellen met pulscode EH111. Na elektroporatie incuberen cellen in R10 aangevuld met 5 ng/ml huIL-7 en huIL-15 bij 5x106 cellen/ml bij 30 °C gedurende 48 uur in 12-well platen. Ga na 48 uur verder met T-celactivering en -uitbreiding.

3. T-cel activatie, lentivirale transductie en expansie

OPMERKING: Voor screening van sgRNA's is lentivirale transductie (stap 3.2) van de CAR-constructie niet nodig.

  1. Tel geëlektroporated T-cellen en verdun tot een concentratie van 1 x10 6 cellen / ml met behulp van warme R10 aangevuld met 5 ng / ml huIL-7 en huIL-15. Activeer cellen door anti-CD3/anti-CD28 monoklonale antilichaam gecoate magnetische kralen toe te voegen in een verhouding van 3 kralen per levende T-cel.
    OPMERKING: Elektroporatie veroorzaakt significante celdood, wat resulteert in ongeveer 60% ± 15% levensvatbare cellen in vergelijking met niet-geëlektroporated cellen. Gebruik een levend/dood celgetal om de juiste hoeveelheid kralen te bepalen. Breng de cellen over tot 37 °C en incubeer een nacht.
  2. Na nachtelijke stimulatie transduceer je CRISPR-engineered T-cellen met lentiviral supernatant uit stap 1. Voeg het juiste volume toe op basis van de virale titer berekend in stap 1.7 om een multipliciteit van infectie (MOI) van 3 te bereiken en incubate cellen gedurende 72 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De viruskorrel geresuspendeerd in R10 wordt eenvoudig bovenop de cellen toegevoegd op basis van de celconcentratie, virale titer en gewenste MOI.
  3. Voer na 72 uur cellen met 50% van het huidige kweekvolume R10 met 10 ng / ml huIL-7 en huIL-15 en breng ze terug naar de incubator voor nog eens 48 uur. Verstoor de clusters die zich tussen de T-cellen en de kralen hebben gevormd niet.
  4. Verwijder na 48 uur de kralen uit de cellen door het cel-kraalmengsel voorzichtig te resuspenderen, gevolgd door magnetische scheiding. Tel cellen na het verwijderen van kralen en breng tot een concentratie van 0,8 x10 6 cellen / ml met behulp van R10 aangevuld met 5 ng / ml huIL-7 en huIL-15. Na het deparen moeten de celaantallen vergelijkbaar zijn met het celgetal op dag 1 voorafgaand aan de elektroporatie(figuur 2B).
  5. Tel na 24 uur de cellen en voer tot een concentratie van 1 x 106 cellen/ml met R10 + 5 ng/ml huIL-7 en huIL-15. Herhaal dit elke 24 uur totdat groeikinetiek en celgrootte aantonen dat cellen hebben gerust van stimulatie.
    OPMERKING: Vanaf dit punt verdubbelen T-cellen ongeveer elke 24 uur. T-cellen ondergaan meestal 5-7 populatieverdubbelingen en hebben een celvolume van ongeveer 300 ± 50 fL in rust.
  6. Eenmaal uitgerust, draai crispr-engineered CAR-T-cellen en resuspend in vriesmedia (1: 1 X-Vivo en FBS plus 10% DMSO) voor cryopreservatie. Car-T-cellen die worden gebruikt, moeten vóór een experiment worden ontdooid en gedurende 16 uur bij 37 °C rusten.
    OPMERKING: Houd ongeveer 10x106 cellen gereserveerd voor het meten van knock-out efficiëntie en CAR-integratie. Verwachte bevolkingsverdubbelingen en volumeveranderingen tijdens de uitbreiding zijn weergegeven in figuur 2B(2C). Bovendien toont figuur 2D niveaus van CAR-expressie op zowel Mock- als gen-bewerkte CAR-T-cellen.

4. CRISPR-efficiëntie

  1. Genomische DNA-extractie en doelgenversterking
    1. Draai van elke screeningcultuur 3-5 x 106 T-cellen naar beneden. Cellen kunnen worden ingevroren als een droge pellet of men kan doorgaan met genomische DNA-extractie. Op het moment van DNA-extractie, resuspend pellets in 200 μL Fosfaat Buffer Saline (PBS) en extract genomisch DNA uit elektroporated cellen met behulp van een standaard DNA-extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Kortom, lyse cellen met proteïnase K en laad lysaat op een DNA-bindingskolom. Tijdens het centrifugeren bindt DNA zich aan het membraan terwijl verontreinigingen passeren. Na twee wasstappen om resterende verontreinigingen en enzymremmers te verwijderen, elueert u DNA in water.
    2. Versterk 200-300 ng genomisch DNA met behulp van standaard PCR-mix met DNA-polymerase, accessoire-eiwitten, zouten en dNTPs en 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers die het gebied van de beoogde dubbelstrengsbreuk flankeren.
      OPMERKING: Voor pcr-primerontwerp wordt de referentiegenomische sequentie (kan worden gevonden met behulp van http://www.ensemble.org) die de gRNA-snijplaats flankeert, ingevoerd in de NCBI-primerblasttool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). PCR-primers moeten zo zijn ontworpen dat het amplicon een doelgrootte van 600-700bp heeft. Deze lengte maakt het mogelijk om sequencingprimers te ontwerpen die binnen het amplicon binden met voldoende afstand van de gRNA-snijplaats (ten minste 150 bp) om een goede sequencingkwaliteit rond de door Cas9 geïnduceerde indels te garanderen (zie 4.2.1). Elk gRNA vereist een uniek primerpaar, tenzij de gRNA-snijplaatsen zich in de buurt bevinden.
    3. Voer het volledige PCR-product uit op een 1% agarose-gel en zuiver het amplicon met behulp van een standaard agarose-gelzuiveringskit.
      OPMERKING: Het proces van het bepalen van de optimale Tm voor PCR kan meerdere rondes van probleemoplossing vergen. Dit komt omdat de KO-sequentie indels heeft en het doelgen moet worden voorbereid op sequencing waar er geen indels zouden zijn, meestal 100 bp stroomopwaarts of stroomafwaarts van de cut-site. Dit kan sterk variëren als gevolg van indels als gevolg van niet-homologe eindvoeging. Het ontwerpen van geneste sequencing primers naar de PCR primers en het verhogen van de concentratie van product sequenced kan problemen met sequencing elimineren.
  2. Sequencing en indel detectie
    1. Ontwerp sequencing primers die binden aan de gel gezuiverde amplicon en stuur mock en knockout amplicons voor Sanger sequencing. Zodra de sequencing is voltooid, uploadt u de traceerbestanden naar de Desktop Genetics-software (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) voor TIDE-analyse.
      1. Voor het sequentiëren van primerontwerp voert u de volgorde van het PCR-amplicon in een standaard primerontwerpsoftware (NCBI, Eurofins of andere openbaar beschikbare hulpmiddelen) in. De ontwerpsoftware zal meerdere primersequenties voorstellen die geschikt zijn om sequencing te sangeren.
      2. Kies voorwaartse en omgekeerde primers die in het amplicon binden ten minste 150 bp stroomopwaarts of stroomafwaarts van de gRNA-snijplaats om een goede sequencingkwaliteit rond de indels te garanderen. Het sequencingchromatogram zal in 4.2 worden gebruikt voor TIDE-analyse, daarom is het belangrijk dat de sequencingkwaliteit goed is voor nauwkeurige indel-decompositie (zie Hultquist et al.) 25.
    2. Gebruik TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) analyse om knock-out (KO) efficiëntie op het genomische niveau te detecteren26. Het algoritme reconstrueert nauwkeurig het spectrum van indels uit de sequentiesporen en berekent R2-waarden, die de goedheid van fit weerspiegelen na niet-negatieve lineaire modellering door de TIDE-software.
  3. Doeleiwitdetectie
    1. Voor doelgenen waarvan het genproduct tot expressie komt op het oppervlak van T-cellen, kleurt ongeveer 1 x 105 cellen uit elke screeningcultuur met een fluorochroomgelabeld antilichaam dat specifiek is voor het doeleiwit. Vergelijk expressieniveaus van het doeleiwit tussen de mock control- en knock-outgroepen door middel van flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 3A,3B.
    2. Voor doelgenen waarvan het genproduct intracellulair tot expressie komt, lyse ongeveer 3 x 106 miljoen cellen per screeningsgroep in lysisbuffer en volg standaardprotocollen voor SDS-PAGE en western blotting. Als alternatief kan oppervlakte- of intracellulaire flowcytometrie worden gebruikt om te tasten naar het doeleiwit.

5. Monitoring off-target effecten met behulp van iGUIDE - Bibliotheekvoorbereiding, DNA-sequencing en analyse

OPMERKING: De iGUIDE-techniek maakt het mogelijk om locaties van Cas9-geleide splitsing te detecteren en de verdelingen van die DNA-dubbelstrengsbreuken te kwantificeren.

  1. Voer iGUIDE uit zoals beschreven door Nobles et al.21. De off-target effecten van sgRNA gericht op TRAC locus met behulp van de iGUIDE-techniek zijn aangetoond in Stadtmauer et al, 202013.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We beschrijven hier een protocol om T-cellen genetisch te manipuleren, dat kan worden gebruikt om zowel autologe als allogene CAR-T-cellen te genereren, evenals TCR-omgeleide T-cellen.

Figuur 1 geeft een gedetailleerde beschrijving van de stadia die betrokken zijn bij het productieproces van CRISPR-bewerkte T-cellen. Het proces begint met het ontwerpen van sgRNA naar het gen van belang. Zodra het sgRNA is ontworpen en gesynthetiseerd, worden ze vervolgens gebruikt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we benaderingen voor genbewerking CAR-T-cellen met behulp van CRISPR Cas9-technologie en produceren we producten om verder te testen op functie en werkzaamheid. Het bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor het uitvoeren van CRIPSR-genbewerking in primaire menselijke T-cellen in combinatie met technische T-cellen met chimere antigeenreceptoren. Dit protocol maakt een hoge knock-out efficiëntie mogelijk met minimale donor-tot-donor variabiliteit. Modificatie met CRISPR kan zowel de werkzaamheid als de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen onthullingen.

Dankbetuigingen

We erkennen de Human Immunology Core voor het leveren van normale donor T-cellen en de Flow Cytometry Core aan de Universiteit van Pennsylvania.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4D-Nucleofactor Core UnitLonzaAAF-1002B
4D-Nucleofactor X-UnitLonzaAAF-1002X
Accuprime Pfx SupermixThermoFisher12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifugeBeckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 AntibodyBiolegend317322Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1BiolegendClone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancersIDT1075915
CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher40203D
CD4+ T cell isolation KitStemCell technologies15062
CD8+ T cell isolation KitStemCell technologies15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottleCorning430768
Corning T150 cell culture flaskMillipore SigmaCLS430825
DMSOMillipore SigmaD2650
DNAeasy Blood and Tissue KitQiagen69504
DynaMag MagnetThermoFisher12321D
Glutamax supplementThermoFisher35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216
HEPES (1 M)ThermoFisher15630080
huIL-15PeproTech200-15
huIL-7PeproTech200-07
Lipofectamine 2000ThermoFisher11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanupTakara740609.25
Opti-MEMThermoFisher31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit LLonzaV4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-GlutamineThermoFisher10378016
pTRPE expression Plasmidin house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PECytoArt200105
RPMI1640ThermoFisher12633012
sgRNAIDT
Spy Fi Cas9Aldevron9214
Ultracentrifuge tubesBeckman Coulter326823
Viral packaging mixin house
X-Vivo-15 MediaLonzaBE02-060F

Referenties

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139(2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471(2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CRISPR-engineeringgenbewerkingT-celactivatielentivirale transductieflowcytometriegids-RNA-ontwerpCas9-nucleaseknockout-validatiecytotoxiciteitsassays
Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.