Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bepaling van totale lipide- en lipideklassen in mariene monsters

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62315

⸱

11 december 2021

 , 
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is voor de bepaling van lipiden in zeewater en biologische specimens. Lipiden in filtraten worden geëxtraheerd met chloroform of mengsels van chloroform en methanol in het geval van vaste stoffen. Lipideklassen worden gemeten door staaf dunnelaagchromatografie met vlamionisatiedetectie en hun som geeft het totale lipidengehalte.

Samenvatting

Lipiden bestaan grotendeels uit koolstof en waterstof en leveren daarom een grotere specifieke energie dan andere organische macromoleculen in de zee. Omdat ze koolstof- en waterstofrijk zijn, zijn ze ook hydrofoob en kunnen ze fungeren als een oplosmiddel en absorptiedrager voor organische verontreinigingen en kunnen ze dus aanjagers zijn van verontreinigende bioaccumulatie in mariene ecosystemen. Hun hydrofobe aard vergemakkelijkt hun isolatie van zeewater of biologische monsters: mariene lipidenanalyse begint met bemonstering en vervolgens extractie in niet-polaire organische oplosmiddelen, wat een handige methode biedt voor hun scheiding van andere stoffen in een aquatische matrix.

Als zeewater is bemonsterd, bestaat de eerste stap meestal uit scheiding in operationeel gedefinieerde 'opgeloste' en 'deeltjes' facties door filtratie. Monsters worden verzameld en lipiden geïsoleerd uit de monstermatrix, meestal met chloroform voor echt opgeloste materie en colloïden, en met mengsels van chloroform en methanol voor vaste stoffen en biologische monsters. Dergelijke extracten kunnen verschillende klassen bevatten uit biogene en antropogene bronnen. Op dit moment kunnen de totale lipiden- en lipidenklassen worden bepaald. Het totale lipide kan worden gemeten door individueel bepaalde lipideklassen op te tellen die gewoonlijk chromatografisch zijn gescheiden. Thin-layer chromatography (TLC) met vlamionisatiedetectie (FID) wordt regelmatig gebruikt voor de kwantitatieve analyse van lipiden uit mariene monsters. TLC-FID levert synoptische lipideklasse-informatie en, door klassen op te tellen, een totale lipidenmeting.

Informatie over lipidenklassen is vooral nuttig in combinatie met metingen van individuele componenten, bijvoorbeeld vetzuren en / of sterolen, na hun afgifte uit lipide-extracten. De grote verscheidenheid aan lipidestructuren en -functies betekent dat ze breed worden gebruikt in ecologisch en biogeochemisch onderzoek dat de gezondheid van ecosystemen en de mate van invloed door antropogene effecten beoordeelt. Ze zijn gebruikt om stoffen met een voedingswaarde voor de mariene fauna te meten (bijv. Aquafeeds en / of prooien) en als een indicator van de waterkwaliteit (bijv. Koolwaterstoffen).

Inleiding

De hier beschreven methoden hebben betrekking op stoffen die operationeel worden gedefinieerd als mariene lipiden. Deze definitie is gebaseerd op hun vatbaarheid voor vloeistof-vloeistofextractie in niet-polaire organische oplosmiddelen en biedt een handige methode voor hun scheiding van andere stoffen in een aquatische matrix. Hun hydrofobe aard vergemakkelijkt hun isolatie van zeewater of biologische exemplaren, evenals hun verrijking en de verwijdering van zouten en eiwitten.

Het meten van het lipidengehalte en de samenstelling ervan in mariene organismen is al tientallen jaren van groot belang in voedselwebecologie, aquacultuurvoeding en voedingswetenschap. Lipiden zijn universele componenten in levende organismen, die fungeren als essentiële moleculen in celmembranen, als belangrijke bronnen van biologisch beschikbare energie, thermische isolatie en drijfvermogen bieden en dienen als signaalmoleculen. Hoewel procedures voor lipidenbepaling op andere gebieden goed zijn beschreven, vereist het gebruik ervan met mariene monsters gewoonlijk modificatie om zich aan te passen aan veldomstandigheden en om type1te bemonsteren.

Voor zeewatermonsters vereist de eerste stap meestal scheiding in de operationeel gedefinieerde 'opgeloste' en 'deeltjes' fracties, normaal gesproken door filtratie (protocolstap 1). De deeltjesfractie is wat wordt vastgehouden door het filter en de grootte van de poriën is belangrijk bij het definiëren van de afsnijding2. Vaak willen we bij het bemonsteren van fijnstof lipideconcentraties relateren aan totale massaconcentraties, in welk geval hiervoor een apart, kleiner monster (bijv. 10 ml) moet worden genomen (protocolstap 1, opmerking). Om een nauwkeurige massabepaling te krijgen, is het belangrijk om ammoniumformium (35 g / L) toe te voegen aan het einde van de filtratie.

Het zeewaterfiltraat uit het grotere monster moet tussen 250 ml en 1 l bedragen, afhankelijk van het type monster en wordt onderworpen aan vloeistof-vloeistofextractie in een separatortrechter (protocolstap 2). De hydrofobe aard van lipiden betekent dat ze kunnen worden gescheiden van andere verbindingen door extractie in een niet-polair oplosmiddel zoals chloroform. Er wordt een tweelaags systeem gecreëerd waarbij lipiden zich opdelen in de organische laag terwijl wateroplosbare componenten in de waterige laag blijven.

Deeltjesmonsters op een filter, of biologische monsters worden geëxtraheerd met een gemodificeerde Folch et al. extractie3, ook met chloroform (Protocol stap 3). Nogmaals, een organisch / waterig systeem wordt gecreëerd waarin lipiden zich verdelen in de organische fase, terwijl in water oplosbare moleculen in de waterige fase blijven en eiwitten worden neergeslagen. In feite gebruiken de meeste laboratoria voor vaste stoffen een variatie op de Folch et al. extractie3-procedure met chloroform en methanol. Voor filters is de eerste stap om te homogeniseren in 2 ml chloroform en 1 ml methanol.

Tijdens de extractie moet ervoor worden gezorgd dat lipiden worden beschermd tegen chemische of enzymatische modificatie, door monsters en oplosmiddelen op ijs te houden om esterbindingshydrolyse of koolstof-koolstof dubbele bindingsoxidatie te verminderen. Weefsels en cellipiden worden vrij goed beschermd door natuurlijke antioxidanten en door compartimentering4; na de homogenisatie van monsters wordt de celinhoud echter gecombineerd, waardoor lipiden meer vatbaar zijn voor verandering, chemisch of enzymatisch. Sommige lipiden, zoals de meeste sterolen, zijn zeer stabiel, terwijl andere, zoals die met meervoudig onverzadigde vetzuren, gevoeliger zijn voor chemische oxidatie. Anderen, zoals sterolen met geconjugeerde dubbele bindingen, zijn gevoelig voor oxidatie gekatalyseerd door licht5. Na extracties zijn lipiden veel gevoeliger voor chemische oxidatie en moeten monsters worden opgeslagen onder een inert gas zoals stikstof. Een zachte stroom stikstof zou ook worden gebruikt om extracten te concentreren.

Na concentratie zouden lipiden dan normaal gesproken in bulk worden gekwantificeerd, omdat ze een belangrijk onderdeel zijn van mariene ecosystemen die een hoge concentratie energie leveren, meer dan twee keer de kJ / g koolhydraten en eiwitten. Steevast zouden ze vervolgens worden gekwantificeerd als afzonderlijke componenten: de uitgebreide analyse van lipiden omvat over het algemeen scheiding in eenvoudigere categorieën, afhankelijk van hun chemische aard. Een volledige analyse omvat dus het meten van totale lipiden, lipidenklassen en individuele verbindingen.

Het totale lipide kan worden bepaald door de som te nemen van individueel gemeten lipideklassen gescheiden door chromatografie6. Een marien lipidenextract kan meer dan een dozijn klassen bevatten uit biogene en antropogene bronnen. De grote verscheidenheid aan lipidestructuren betekent dat veel informatie kan worden verkregen door individuele groepen van structuren te bepalen. Lipideklassen afzonderlijk, of in bepaalde groepen, zijn gebruikt om de aanwezigheid van bepaalde soorten organismen aan te geven, evenals hun fysiologische status en activiteit2. Ze zijn ook gebruikt als een indicator van de oorsprong van organisch materiaal, waaronder opgelost organisch materiaal (DOM) en hydrofobe verontreinigingen.

Triacylglycerolen, fosfolipiden en sterolen behoren tot de belangrijkere biogene lipidenklassen. De eerste twee zijn biochemisch verwant omdat ze een glycerol-ruggengraat bezitten waaraan twee of drie vetzuren zijn veresterd(figuur 1). Triacylglycerolen zijn samen met wasesters zeer belangrijke opslagstoffen, terwijl andere vetzuurbevattende lipideklassen zoals diacylglycerolen, vrije vetzuren en monoacylglycerolen over het algemeen minder belangrijke bestanddelen zijn. Vrije vetzuren zijn in lagere concentraties aanwezig in levende organismen, omdat de onverzadigde vetzuren giftig kunnen zijn7. Sterolen (zowel in hun vrije als veresterde vormen) en vetalcoholen behoren ook tot de minder polaire lipiden, terwijl glycolipiden en fosfolipiden polaire lipiden zijn. Polaire lipiden hebben een hydrofiele groep, die de vorming van lipide bilayers in celmembranen mogelijk maakt. Vrije sterolen zijn ook structurele componenten van het membraan en wanneer ze in verhouding tot triacylglycerolen worden ingenomen, bieden ze een conditie of voedingsindex (TAG: ST) die op grote schaal is gebruikt8. Wanneer ze in verhouding tot fosfolipiden (ST: PL) worden ingenomen, kunnen ze worden gebruikt om de gevoeligheid van de plant voor zout aan te geven: hogere waarden behouden de structurele integriteit en verminderen de membraandoorlaatbaarheid9. De inverse van deze verhouding (PL: ST) is bestudeerd in tweekleppige weefsels tijdens temperatuuraanpassing10.

Mariene lipideklassen kunnen worden gescheiden door dunnelaagchromatografie (TLC) op silicagel gecoate staven (Protocol stap 4) en vervolgens worden gedetecteerd en gekwantificeerd door vlamionisatiedetectie (FID) in een automatische FID-scanner. TLC / FID is routinematig gebruikt voor mariene monsters omdat het snel synoptische lipideklassegegevens van kleine monsters levert, en door de som van alle klassen te nemen, een waarde voor totale lipiden. TLC/FID is onderworpen aan een kwaliteitsborgingsbeoordeling (QA) en bleek te voldoen aan de normen die vereist zijn voor consistente externe kalibratie, lage blanco's en nauwkeurige replicatieanalyse11. Variatiecoëfficiënten (CV) of relatieve standaardafwijkingen liggen rond de 10%, en de totale lipidengegevens van de FID-scanner zijn normaal gesproken ongeveer 90% van die verkregen door gravimetrische en andere methoden2. Gravimetrie geeft een hoger totaal aan lipiden waarschijnlijk omdat de FID-scanner alleen niet-vluchtige stoffen meet, en ook als gevolg van mogelijke opname van niet-lipide materiaal in gravimetrische metingen.

De informatie die wordt verstrekt door lipidenklasseanalyse is vooral nuttig in combinatie met bepalingen van vetzuren als individuen, of sterolen, of de twee in combinatie. De eerste stap naar deze analyses omvat de afgifte van alle samenstellende vetzuren samen met sterolen in de lipide-extracten (Protocol stap 5). De grote verscheidenheid aan lipidestructuren en -functies betekent dat ze op grote schaal zijn gebruikt in ecologische en biogeochemische studies die de gezondheid van ecosystemen beoordelen en de mate waarin ze zijn beïnvloed door antropogene en terrestrische inputs. Ze zijn gebruikt om de biosynthese van stoffen met een voedingswaarde voor de mariene fauna te meten en om de kwaliteit van watermonsters aan te geven. Het meten van lipiden in sedimentkernmonsters helpt de gevoeligheid van sedimenten voor veranderingen in menselijk landgebruik in de buurt van de land-zeerand aan te tonen.

Het belangrijkste hulpmiddel voor het identificeren en kwantificeren van individuele lipideverbindingen is van oudsher gaschromatografie (GC) met FID. Vóór de analyse worden deze verbindingen echter vluchtiger gemaakt door derivatisatie. Vetzuren komen vrij in aanwezigheid van een zure katalysator (H2SO4) uit acyllipideklassen (Figuur 1). In de organische chemie is de acylgroep (R-C=O) meestal afgeleid van een carbonzuur (R-COOH). Ze worden vervolgens opnieuw veresterd tot vetzuurmethylesters (FAME), wat betere scheidingen op GC-kolommen geeft (protocolstap 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Om glaswerk, instrumenten en filters voor lipidenanalyses te reinigen, wast u ze 3 keer met methanol gevolgd door 3 wasbeurten met chloroform of verwarmt u ze gedurende ten minste 8 uur tot 450 °C.

1. Filtratieprocedure voor opgelost zeewater en deeltjeslipiden

OPMERKING: De specifieke fractie van belang wordt operationeel gedefinieerd door de filtratieprocedure. In dit geval is de poriegrootte 1,2 μm.

  1. Plaats het filterspruitstuk zonder filter en spoel de installatie met gefilterd zeewater.
  2. Plaats met behulp van een schone tang een 47 mm glasvezelfilter (GF / C) dat is gewassen, in het schone filtratiesysteem.
  3. Neem het monster en draai voorzichtig om materiaal dat zich mogelijk op de bodem van de verzamelcontainer heeft gevestigd, opnieuw op te suspenden. Meet nauwkeurig een bekend volume, in dit geval 1 L, en filter dit door het filter.
    OPMERKING: Het volume is afhankelijk van de hoeveelheid deeltjes in het monster: meestal tussen 250 ml en 5 l, afhankelijk van het seizoen en de locatie.
  4. Wanneer het monster is uitgemeten, maakt u het filter voorzichtig nat met gefilterd zeewater. Voeg het volledige monster langzaam toe aan het filtersysteem en spoel de gegradueerde cilinder met gefilterd zeewater om ervoor te zorgen dat alle deeltjes aan het filter worden toegevoegd. Spoel de opstelling af met gefilterd zeewater aan de zijkanten om ervoor te zorgen dat alle deeltjes op het filter worden gespoeld.
    1. Laat al het zeewater door het filter gaan, maar laat het filter niet volledig uitdrogen omdat het de cellen op het filter kan verstoren; breek de zuigkracht als het laatste water verdwijnt.
  5. Vouw met een schone tang en een schone pipet het filter doormidden, vervolgens in drieën en vervolgens in de lengte doormidden om het filter in een buis te rollen. Plaats het in een schone, gelabelde glazen injectieflacon van 10 ml.
  6. Bedek het filter met 2 ml chloroform. Vul de hoofdruimte met stikstof en sluit af met PTFE-tape. Plaats in een rek in een vriezer van -20 °C. De monsters zullen stabiel zijn bij deze temperatuur tot een jaar.
    OPMERKING: Om lipideconcentraties te relateren aan de totale massaconcentraties, is ook een droge gewichtsmeting nodig. Dit houdt in dat een voorgewogen filter van 24 mm in een filtratie-opstelling met droog gewicht wordt gezet, het monster wordt geroerd en een kleine substeekproef wordt genomen die op het kleine filter wordt gefilterd. Wanneer het filter bijna droog is, wordt ongeveer 10 ml 3,5% ammoniumformium aan het filter toegevoegd. Het filter wordt doormidden gevouwen, teruggebracht naar een gelabelde petrischaal en in een vriezer geplaatst.

2. Vloeistof-vloeistofextractie van zeewater of vloeistofmonsters

  1. Het monster voorbereiden
    1. Meet een bekend volume filtraat in een lipide schone glazen maatcilinder. Plaats dit monster in een schone 1 L scheidingstrechter. Voeg vervolgens 20 ml chloroform toe aan het monster en schud gedurende 2 minuten, waarbij u regelmatig ontlucht.
  2. Verwijdering van het eerste extract en toevoeging van zuur na eerste scheiding
    1. Wikkel trechter in aluminiumfolie en wacht 5 tot 10 minuten voor de scheiding. Pel de onderkant van de folie terug om de twee lagen te zien. Verzamel de onderste, organische laag door de stopkraan in een schone kolf met ronde bodem, waarbij u ervoor moet zorgen dat u geen van de bovenste lagen opneemt. Dek de kolf met ronde bodem onder stikstof en plaats in de vriezer.
    2. Voeg 0,25 ml geconcentreerd H2SO4 voor elke liter monster toe aan het monster in de separatortrechter en schud de trechter voorzichtig.
    3. Voeg 10 ml chloroform toe en schud krachtig gedurende 2 minuten terwijl u regelmatig ventileert. Laat de scheiding plaatsvinden.
  3. Tweede en derde scheiding
    1. Wacht op de scheiding en voeg de onderste laag toe aan de kolf met ronde bodem.
    2. Voeg een derde 10 ml chloroform toe en schud gedurende 2 minuten, opnieuw regelmatig ventilerend. Voeg na de scheiding de onderste laag toe aan de kolf met ronde bodem.
    3. Breng het extract in de kolf met ronde bodem over in een roterende verdamper, verdamp en breng het over in een injectieflacon van 2 ml.

3. Extractieprotocol voor vaste stoffen (gemodificeerde Folch et al.3 extractie)

  1. Setup
    OPMERKING: De extractie-opstelling vereist een geïsoleerde container gevuld met ijs. Oplosmiddelen omvatten methanol, chloroform geëxtraheerd water en 2:1 chloroform:methanol. Alle oplosmiddelen moeten op ijs worden geplaatst, zodat ze koud zijn tegen de tijd dat de extracties worden gestart. De monsters gaan ook op ijs, zodat alles koud blijft.
    1. Spoel alle buizen en ptfe beklede doppen 3 keer met methanol en vervolgens 3 keer met chloroform. Voor elke extractie is één centrifugebuis en één injectieflacon van 15 ml met dop nodig.
    2. Plaats het monster in een centrifugebuis met 2 ml chloroform. De grootte van het monster hangt af van de hoeveelheid lipide die aanwezig is, ongeveer 5 tot 10 mg lipide heeft de voorkeur.
  2. Slijpen en extraheren
    1. Voeg ongeveer 1 ml ijskoude methanol toe en maal het monster snel tot pulp met een schone homogenisator of PTFE/metalen staaf.
    2. Spoel de staaf terug in de buis met ongeveer 1 ml ijskoud 2:1 chloroform: methanol en vervolgens met 1/2 ml ijskoud chloroform geëxtraheerd water. Gebruik indien nodig een schone set tangen om deeltjes terug in de injectieflacon te dwingen voordat u gaat wassen. Sluit de buis en soniceer het mengsel gedurende 4 minuten in een ultrasoon bad (35 - 42 kHz).
  3. Dubbel pipetteren: Centrifugeer het monster gedurende 2 min bij 1800 × g. Verzamel de gehele organische laag (onderste laag) met behulp van de dubbele pipettertechniek waarbij een 5 3/4" pipet met de bol losjes aan zachtjes door de twee lagen wordt geduwd, terwijl de bol wordt ingedrukt, waardoor er bellen uit komen.
    1. Wanneer de onderkant van de tweede laag is bereikt, gebruikt u de duim om de lamp te verwijderen zonder de organische laag in de pipet te trekken. Plaats een 9" pipet in de 5 3/4" pipet en verwijder de onderste laag door de 5 3/4" pipet.
    2. Plaats het extract in een schone injectieflacon. Blijf de onderste laag verwijderen totdat deze allemaal is verwijderd.
  4. Pipetten wassen: Spoel de 9"-pipet in de injectieflacon met de organische laag met behulp van 1,5 ml ijskoude chloroform om de buitenkant van de pipet af te spoelen en 1,5 ml om de binnenkant af te spoelen. Draai die pipet voorzichtig tijdens het wassen en zorg ervoor dat alle chloroform langs de pipet in de injectieflacon loopt.
    1. Spoel de 5 3/4" pipet op dezelfde manier in de buis met de waterige laag.
  5. Soniceer en centrifugeer de monsters en dubbele pipet wanneer deze worden gescheiden, telkens met behulp van nieuwe pipetten. Herhaal dit minstens drie keer en bundel alle organische lagen. Nadat u de organische laag voor de derde keer hebt verwijderd, wast u beide pipetten in de injectieflacon met de organische laag.
  6. Gebruik een zachte stikstofstroom, concentreer tot op volume, sluit vervolgens af met PTFE-tape en bewaar in een vriezer.

4. Ontwikkeling van systemen en stappen voor staaf TLC-scheiding van mariene lipidenklassen

  1. De hengels voorbereiden op TLC
    1. Blanco scan de staafjes in de automatische FID-scanner drie keer
    2. Een monster spotten: Breng monsters en standaarden aan met een spuit op de staafjes op of net onder de oorsprong. Dispense 0,5 μL en raak de druppel aan de staaf aan. Laat drogen voordat je de volgende druppel op dezelfde plek legt. Spot alle monsters in een lijn op hengels.
    3. Scherpstellen in aceton: Focus monsters tweemaal (drie keer als de monsters zeer geconcentreerd zijn) in 70 ml aceton. Let op de solvent voorkant terwijl deze de staaf beklimt totdat de onderkant van de plek samensmelt met de bovenkant. Verwijder de staafjes, droog ze ongeveer 5 s en herhaal vervolgens de procedure om een smalle band van lipidemateriaal te produceren in de buurt van de bodem van de staaf.
    4. Droog en conditioneer de staven gedurende 5 minuten in een kamer met constante vochtigheid. Een constante vochtigheidskamer is eensiccator met een verzadigde oplossing van calciumchloride onder de plaat.
  2. Sequentie die leidt tot het eerste chromatogram (koolwaterstof tot keton)
    1. Eerste ontwikkelingssysteem: Het eerste ontwikkelingssysteem is hexaan:diethylether:mierenzuur, 98.95:1:0.05. Gebruik een spuit om het mierenzuur toe te voegen, maar spoel de spuit eerst 3× af met mierenzuur. Spoel het mierenzuur direct daarna uit de spuit met chloroform. Gebruik 30 ml van het mengsel om het papier nat te maken en de tank af te spoelen. Gooi de spoeloplossing weg en voeg de resterende 70 ml toe aan de tank.
      1. Neem de rekken en laat ze voorzichtig in de tank zakken. Kijk totdat het oplosmiddel de monstervlekken bereikt en start vervolgens de timer. Verwijder na 25 minuten de staven uit de ontwikkelingskamer, droog gedurende 5 minuten in de constante vochtigheidskamer en ontwikkel opnieuw in dezelfde oplossing gedurende nog eens 20 minuten.
    2. Droog de staafjes gedurende 5 minuten in de automatische FID-scanner en scan vervolgens naar het laagste punt achter de ketonpiek met behulp van een PPS-scan van 25.
  3. Sequentie die leidt tot het tweede chromatogram (triacylglycerol tot diacylglycerol):
    1. Conditioneer de staven gedurende 5 minuten in de constante vochtigheidskamer.
    2. Tweede ontwikkelingssysteem: Het tweede ontwikkelingssysteem is hexaan:diethylether:mierenzuur, 79:20:1. Voeg ~ 30 ml toe aan de ontwikkelingstank om het papier nat te maken en de tank af te spoelen. Gooi vervolgens de staven weg en ontwikkel ze gedurende 40 minuten in de resterende 70 ml. Gebruik voor de beste scheiding tussen de TAG (verzadigd) en de TAG (meervoudig onverzadigde) pieken een mengsel van 79,9:20:0,1, maar voor de scheiding van de ST- en DAG-pieken een mengsel van 79:20:1.
    3. Droog en scan naar het laagste punt achter de diacylglycerolpiek in een tweede gedeeltelijke scan met behulp van een PPS-scan 11.
  4. Sequentie die leidt tot het derde chromatogram (aceton-mobiele polaire lipide en fosfolipide)
    1. Conditioneer de staven gedurende 5 minuten in de constante vochtigheidskamer.
    2. Ontwikkel de staafjes twee keer gedurende 15 minuten in 70 ml aceton. Tussen de ontwikkelingen door drogen de staven ongeveer 30 seconden aan de lucht.
    3. Conditioneer de staven gedurende 5 minuten in de constante vochtigheidskamer.
    4. Derde ontwikkelingssysteem: Het derde ontwikkelingssysteem is een mengsel van chloroform, methanol en chloroform-geëxtraheerd water, 50:40:10. Ontwikkel de staven tweemaal gedurende 10 minuten in 70 ml van het mengsel. Tussen de ontwikkelingen door drogen de staven ongeveer 30 seconden aan de lucht.
    5. Droog en scan de hele lengte van de staven.

5. FAME derivatisatie met H2SO4 in MeOH

  1. Het maken van het Hilditch reagens
    1. Bereiding van de methanol: Breng 100 ml MeOH in een schone maatkolf en strooi er voorzichtig watervrij NaSO4 in totdat de bodem van de kolf is afgedekt. Eenmaal afgedekt, keert u tweemaal om zodat al het water in de methanol wordt geabsorbeerd door de NaSO4. Laat het na het omkeren en schudden minstens 5 minuten zitten.
    2. Het zuur toevoegen: Decanteer de methanol langzaam in een glazen pot (inmiddels is de NaSO4 een harde klont in de bodem van de kolf) en de H2SO4 wordt toegevoegd. Voeg langzaam 1,5 ml zwavelzuur toe aan de methanol met behulp van een pipet. Voeg een paar druppels per keer toe en zodra al het zuur is toegevoegd, dop en roer voorzichtig om te mengen. De oplossing is nu klaar om te worden gebruikt voor derivaten, maar moet wekelijks worden ingemaakt.
  2. Het maken van de derivaten
    1. Breng ongeveer 200 μg lipiden over van een extractflacon waarvan het volume tot een bekende hoeveelheid is gebracht, in een schone injectieflacon van 15 ml en verdamp onder stikstof tot droogheid. De verwijderde hoeveelheid wordt bepaald door de concentratie van het monster van TLC/FID. Gebruik een schone pipet om het monster te verwijderen.
    2. Wanneer het monster is opgedroogd, voegt u 1,5 ml dichloormethaan en 3 ml van het nieuw gemaakte Hilditch-reagens toe.
    3. Vortex het monster en soniceer het gedurende 4 minuten in een ultrasoon bad om lipiden te verwijderen die zich aan de glazen injectieflacon hebben gehecht. Vul de injectieflacon met stikstof, dop en sluit deze af met PTFE-tape en verwarm gedurende 1 uur op 100 °C.
  3. De reactie stoppen
    1. Laat de monsters na verwijdering uit de oven gedurende 10 minuten volledig afkoelen tot kamertemperatuur en open de injectieflacons voorzichtig.
    2. Voeg langzaam ongeveer 0,5 ml verzadigde natriumbicarbonaatoplossing (9 g /100 ml chloroform-geëxtraheerd water) toe en vervolgens 1,5 ml hexaan. Schud of vortex de injectieflacon en laat vervolgens staan zodat deze zich in 2 lagen scheidt.
  4. Het verzamelen van de FAME's
    1. Verwijderen van de bovenste laag: Zodra de derivatisatie is gestopt en er een duidelijke scheiding is, verwijdert u de bovenste, organische fase en plaatst u deze in een lipide schone injectieflacon van 2 ml.
    2. Verdamp het oplosmiddel in de injectieflacon van 2 ml tot de droogheid en vul het opnieuw met hexaan tot ongeveer 0,5 ml.
    3. Vul de kopruimte van de injectieflacon met stikstof, dop en sluit de injectieflacon af met PTFE-tape, soniceer nog eens 4 minuten om de vetzuren opnieuw te suspenseren en dan is het klaar om naar de GC te gaan.
      OPMERKING: Als vetzuurconcentraties vereist zijn, moet de waterige laag drie keer worden gewassen met hexaan en alle organische lagen worden samengevoegd in de injectieflacon van 2 ml. Dit omvat het toevoegen van 2 ml hexaan, het vortexen van het monster, het centrifugeren en verwijderen van de organische laag, allemaal 3 keer herhaald.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als snelst groeiende voedselproductiesector evolueert de aquacultuur in termen van technologische innovaties en aanpassingen om aan veranderende eisen te voldoen. Een daarvan is het verminderen van de afhankelijkheid van vismeel en visolie uit het wild, die voederingrediënten leveren voor veel aquacultuursoorten. Terrestrische plantaardige oliën worden onderzocht als duurzame en economische vervangingen voor visolie in aquafeeds, en de lever is een doelweefsel voor analyse omdat het de primaire plaats is voor lipidenmeta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De snelheid waarmee het TLC-FID-systeem synoptische lipideklasse-informatie van kleine monsters biedt, maakt TLC-FID een geschikt hulpmiddel voor het screenen van mariene monsters voordat meer betrokken analytische procedures worden uitgevoerd. Dergelijke analyses vereisen meestal het vrijkomen van componentverbindingen uit lipide-extracten en derivatisatie om de volatiliteit in het geval van gaschromatografie te verhogen. TLC-FID in combinatie met GC-FID is een krachtige combinatie gebleken voor extracten van zeevruchte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het subsidienummer van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) 105379 aan C.C. Parrish. Het Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network van Memorial University heeft bijgedragen aan de financiering van deze publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml vialsVWR66009-560
1-hexadecanolSigma258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerolSigmaM1640-1g
2 ml vialsVWR46610-722
25 mm glass fibre filtersFisher09 874 32A
2ml pipet bulbsVWR82024-554
47 mm glass fibre filtersFisher09 874 32
5 3/4" pipetsFisher1367820A
9" pipetsFisher1367820C
AcetoneVWRCAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gmVWRCACX0160-1
Caps for 2 ml vialsVWR46610-712
chloroformVWRCACX1054-1
Cholesteryl palmitateSigmaC6072-1G
Chromarod S5Shell USA3252
DichloromethaneVWRCADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoylSigmaP5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4LVWRCAEX0190-4
Glyceryl tripalmitateSigmaT5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µlSigma58381
HeliumAir LiquideA0492781
HexaneVWRCAHX0296-1
Hydrogen regulatorVWR55850-484
Iatroscan MK6Shell USA
KimwipesFisher066662
Medical AirAir LiquideA0464563
Medium nitrile glovesFisher191301597C
Nitrile gloves LVWRCA82013-782
NitrogenAir LiquideA0464775
Nitrogen RegulatorVWR55850-474
NonadecaneSigma74158-1G
Palmitic acidSigmaP0500-10G
Repeating dispenserSigma20943
Sodium Bicarbonate 1kgVWRCA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500grVWRCA71008-804
Sulfuric acidVWRCASX1244-5
Teflon tapeFisher14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenatorOMNI InternationalTM125-115
TLC development tankShell USA3201
UHP hydrogenAir LiquideA0492788
VWR solvent repippetterVWR82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channelVWR89140-196
Zebron ZB-Wax GC columnPhenomenex7HM-G013-11

Referenties

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045(2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49(2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024(2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178(2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mariene lipidenanalyselipidextractiebepaling van totale lipidendunne-laagchromatografievlamionisatiedetectiechloroform-methanol-extractiezeewaterfiltratielipidenbioaccumulatieaquatische ecosystemen
Bepaling van totale lipide- en lipideklassen in mariene monsters
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.