Een microfluïdische benadering voor het functioneel onderzoek van signaaloscillaties die somitogenese beheersen

Samenvatting

Een protocol voor het kweken en manipuleren van embryonaal weefsel van muizen op een microfluïdische chip wordt verstrekt. Door pulsen van pathway modulators toe te passen, kan dit systeem worden gebruikt om signaaloscillaties extern te regelen voor het functionele onderzoek van muis somitogenese.

Samenvatting

Periodieke segmentatie van het presomitische mesoderm van een zich ontwikkelend muizenembryo wordt gecontroleerd door een netwerk van signaalroutes. Van signaaloscillaties en gradiënten wordt gedacht dat ze respectievelijk de timing en afstand van segmentvorming regelen. Hoewel de betrokken signaalroutes de afgelopen decennia uitgebreid zijn bestudeerd, ontbreekt direct bewijs voor de functie van signaalschommelingen bij het beheersen van somitogenese. Om het functionele onderzoek van de signaaldynamica mogelijk te maken, is microfluïdica een eerder vastgesteld hulpmiddel voor de subtiele modulatie van deze dynamica. Met deze op microfluïdica gebaseerde entrainment-benadering worden endogene signaaloscillaties gesynchroniseerd door pulsen van pathway modulators. Dit maakt modulatie mogelijk van bijvoorbeeld de oscillatieperiode of de fase-relatie tussen twee oscillerende paden. Bovendien kunnen ruimtelijke gradiënten van pathwaymodulatoren langs het weefsel worden vastgesteld om te bestuderen hoe specifieke veranderingen in de signaalgradiënten somitogenese beïnvloeden.

Het huidige protocol is bedoeld om microfluïdische benaderingen te helpen vaststellen voor de eerste gebruikers van microfluïdica. De basisprincipes en apparatuur die nodig zijn om een microfluïdisch systeem op te zetten worden beschreven en er wordt een chipontwerp geleverd, waarmee een mal voor chipgeneratie gemakkelijk kan worden voorbereid met behulp van een 3D-printer. Ten slotte wordt besproken hoe primair muisweefsel op een microfluïdische chip kan worden gekweekt en hoe signaaloscillaties naar externe pulsen van pathwaymodulatoren kunnen worden meegevoerd.

Dit microfluïdische systeem kan ook worden aangepast om andere in vivo en in vitro modelsystemen zoals gastruloïden en organoïden te herbergen voor functioneel onderzoek van signaaldynamica en morfogeengradiënten in andere contexten.

Inleiding

De ontwikkeling wordt gecontroleerd door intercellulaire communicatie via signaalwegen. Er is slechts een beperkt aantal signaalwegen die de complexe vorming van weefsels en de juiste celdifferentiatie in ruimte en tijd orkestreren. Om deze veelheid aan processen te reguleren, kan informatie worden gecodeerd in de dynamiek van een signaalroute, de verandering van een pad in de loop van de tijd, zoals de frequentie of duur van een ^signaal1,2.

Tijdens somitogenese wordt somitisch weefsel periodiek afgesplitst van het presomitische mesoderm (PSM)³. De PSM is ruimtelijk georganiseerd door gradiënten van Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) en Retinoïnezuursignalering. In anterieure PSM aan het bepalingsfront, waar Wnt- en FGF-signalen laag zijn, worden cellen klaargestoomd voor differentiatie in somites. Differentiatie treedt op wanneer een golf van transcriptionele activering dit bepalingsfront bereikt. Binnen de PSM, Wnt, FGF en Notch oscilleren signaleringen. Naburige cellen oscilleren enigszins uit fase, wat resulteert in golven van oscillerende transcriptionele activering stroomafwaarts van de Wnt-, FGF- en Notch-paden die van achterste naar voorste PSM reizen. Bij muizenembryo's bereikt een transcriptionele golf ongeveer elke 2 uur het determinatiefront en initieert somietvorming. Het bestuderen van somitogenese door signaleringsroutes te verstoren of te activeren kan het belang van deze paden illustreren4,5,6,7,8,9. Om de functie van signaaldynamica in de controle van cellulair gedrag te kunnen onderzoeken, is het echter essentieel om signaalroutes subtiel te moduleren in plaats van ze permanent te activeren of te remmen.

Om de signaalwegactiviteit binnen het segmenterende muizenembryo tijdelijk te moduleren, hebben Sonnen et al. een microfluïdisch systeem ^ontwikkeld10. Dit systeem maakt een strakke controle mogelijk van vloeistofstromen binnen microkanalen van een chip die het biologische monster ^bevat11. Om het belang van signaaldynamiek voor een goede segmentatie van PSM te bestuderen, wordt deze microfluïdica-opstelling gebruikt om de signaaldynamiek van de muissegmentatieklok ex vivo te moduleren. Door sequentieel pulserende padactivatoren of -remmers in de kweekkamer te pulseren, wordt externe controle van de dynamiek van Wnt-, FGF- en Notch-signalering ^bereikt10. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de periode van individuele paden en de faserelatie tussen meerdere oscillerende signaalroutes te wijzigen. Met behulp van gelijktijdige real-time beeldvorming van dynamische signalerende verslaggevers kan het effect van entrainment op de paden zelf, op differentiatie en somietvorming worden geanalyseerd. Met behulp van dit niveau van controle over de signaaldynamiek werd het belang van de faserelatie tussen Wnt- en Notch-signaleringsroutes tijdens somitogenese ^benadrukt10.

Gepersonaliseerde chipontwerpen maken een overvloed aan opties mogelijk voor spatiotemporale verstoringen binnen de lokale omgeving, bijvoorbeeld stabiele gradiëntvorming12,13,14,15, pulsatiele activering / remming10,16,17,18 of gelokaliseerde ^{verstoringen19,20} . Microfluïdica kan ook een meer reproduceerbare uitlezing en hogere doorvoer mogelijk maken dankzij automatisering van experimentele handling21,22,23. Het huidige protocol is bedoeld om microfluïdica en entrainment van endogene signaaloscillaties in weefsels naar elk standaard biowetenschappelijk laboratorium te brengen. Zelfs bij afwezigheid van geavanceerde apparatuur voor het genereren van chips, zoals cleanroom en apparatuur voor softlithografie, kunnen microfluïdische chips worden vervaardigd en gebruikt om biologische vragen aan te pakken. Mallen kunnen worden ontworpen met behulp van vrij beschikbare computerondersteunde ontwerpsoftware (CAD). Een mal voor het genereren van microfluïdische chips, meestal bestaande uit polydimethylsiloxaan (PDMS), kan worden geprint met een 3D-printer of worden besteld bij drukkerijen. Op deze manier kunnen microfluïdische chips binnen één dag worden geproduceerd zonder dat dure apparatuur nodig ^is24. Hier is een chipontwerp voorzien, waarmee met een 3D-printer een mal voor het meevoeren van de muissegmentatieklok in tweedimensionale (2D) ex vivo ^culturen25 kan worden geprint.

On-chip culturen en precieze verstoringen, mogelijk gemaakt door microfluïdica, hebben een uitstekend potentieel bij het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van hoe signaalroutes meercellig gedrag regelen. Signaaldynamica en morfogene gradiënten zijn nodig voor veel processen in ontwikkeling. Eerder hadden laboratoria cellen, weefsels en hele organismen gekweekt in microfluïdische chips en protocollen voor spatiotemporale verstoring van voornamelijk 2D-celkweek worden elders verstrekt12,26,27,28,29. Het toepassen van microfluïdica om lokale omgevingen in meercellige systemen te moduleren, opent nieuwe perspectieven voor high-throughput en nauwkeurige spatiotemporale verstoringen. Het gebied van microfluïdica heeft nu een punt bereikt dat het een niet-specialistisch, goedkoop en gemakkelijk toepasbaar hulpmiddel is geworden voor ontwikkelingsbiologen.

Hier wordt een protocol gegeven voor het meevoeren van de muissegmentatieklok naar pulsen van een Notch-signaleringsremmer. Zo'n experiment bestaat uit de volgende stappen: (1) generatie van microfluïdische chip, (2) voorbereiding van slangen en coating van de chip, en (3) het microfluïdische experiment zelf (figuur 1A). Onderzoek met modelsystemen voor gewervelde dieren vereist voorafgaande ethische goedkeuring van de bevoegde commissie.

Protocol

Het hier gepresenteerde onderzoek is goedgekeurd door de EMBL ethische ^commissie10 en de Dierenexperimentencommissie (DEC) en volgt de Hubrecht-richtlijnen voor dierverzorging.

Draag handschoenen tijdens het werken met vloeibare PDMS. Bedek oppervlakken en apparatuur. Verwijder eventuele morsen onmiddellijk, omdat schoonmaken moeilijk wordt zodra het is uitgehard.

1. Generatie van de chip

OPMERKING: Microfluïdische chips worden gegenereerd door PDMS (Polydimethylsiloxaan) in een mal te gieten. Mallen kunnen worden ontworpen met behulp van CAD-software (bijv. uFlow of ^3DμF30). Een repository van gratis ontwerpen wordt aangeboden door de MIT (Metafluidics.org). Mallen worden geprint met een 3D-printer of kunnen worden gegenereerd door zachte lithografie met behulp van een fotomasker dat het gewenste ontwerp bevat (zie voor meer informatie bijvoorbeeld Qin et al., ²⁰¹⁰³¹). Hier wordt een ontwerp voor een mal verstrekt dat met een 3D-printer kan worden geprint voor de on-chip kweek van muizenembryoweefsel (Figuur 1B, C, Aanvullende Bestanden 1 en 2). Om afdrukken met 3D-printers met een lagere resolutie mogelijk te maken, is het ontwerp gewijzigd ten opzichte van het eerder gepubliceerde ^10-printer. Een mal zonder luchtbellenvallen en een met luchtbellenvallen is aanwezig (respectievelijk aanvullende bestanden 1 en 2 ). Aangezien de procedure voor het afdrukken afhankelijk is van de beschikbare printer, worden de details voor het afdrukken niet beschreven. Men moet er echter voor zorgen dat alle ongepolymeriseerde hars volledig wordt verwijderd. Het is vaak nodig om extra te wassen met oplosmiddelen om ongepolymeriseerde hars uit de kleine gaten van <200 μm in de microfluïdische kamer te verwijderen. Deze gaten zullen PDMS-pilaren vormen om het embryonale weefsel in de chip tijdens het experiment te vangen. PDMS wordt over het algemeen gebruikt voor microfluïdica, omdat het goedkoop, biocompatibel en transparant is en een lage autofluorescentie heeft. Na uitharding wordt de PDMS-chip uit de mal gesneden en op een glasplaat gelijmd. Plasmabehandeling van zowel het glas als de PDMS-chip activeert de oppervlakken en maakt de vorming van covalente bindingen mogelijk, wanneer ze in contact worden gebracht.

1. Bereid de vereiste hoeveelheid PDMS door het monomeer met de katalysator te mengen in een verhouding van 9:1 (w:w) om polymerisatie te induceren. Gebruik wegwerpgereedschap om te mengen, zoals plastic bekers en vorken. Zorg ervoor dat het mengen goed wordt bereikt.
2. Plaats het PDMS-mengsel in een exsiccator en breng ongeveer 30 minuten vacuüm aan om lucht uit het PDMS-mengsel te verwijderen. Door het vacuüm in de exsiccator wordt lucht uit het PDMS-mengsel verwijderd.
   OPMERKING: Bedek de binnenkant van de exsiccator met tissues voor het geval PDMS overloopt.
3. Giet het PDMS-mengsel in de spaanvorm (een PDMS-laag van ongeveer 3-5 mm is voldoende).
4. Plaats de met PDMS gevulde mal terug in de exsiccator en breng vacuüm aan om eventuele resterende bubbels te verwijderen. Zorg ervoor dat lucht uit alle kleinere structuren van de mal wordt verwijderd.
5. Hard de vorm uit door hem een nacht in een oven van 65 °C (of lager, afhankelijk van het vormmateriaal) te plaatsen. Snijd de chip uit de mal met behulp van een scalpel. Knip het geharde PDMS uit de mal met voldoende ruimte (1-2 cm) rond het ontwerp om later te kunnen verlijmen. Zorg ervoor dat u de PDMS volledig snijdt om te voorkomen dat de chip breekt wanneer u deze eruit haalt. Til de PDMS-chip voorzichtig op, eerst met het stompe uiteinde van het scalpel en indien mogelijk met de handen.
6. Pons inlaat- en uitlaatgaten, beginnend aan de binnenkant van de microfluïdische kamer met behulp van een biopsiespons van 1 mm.
7. Reinig de PDMS-chip kort met perslucht en plak plakband aan beide zijden om eventuele vastzittende stukjes PDMS en stof te verwijderen en schoon te houden tot verder gebruik.
   OPMERKING: De chip kan zo worden bewaard tot verder gebruik.
8. Reinig de glasplaat met perslucht. Pas op dat het niet breekt. Verwijder plakband van de PDMS-chip.
9. Bevestig de chip met behulp van een plasmaoven aan de glasplaat. De volgende instructies zijn geoptimaliseerd voor luchtplasma.
   OPMERKING: Raadpleeg de handleiding van de plasmaoven van het laboratorium en optimaliseer de procedure voor het specifieke experiment.
   1. Plaats de chip en glasschuif in de plasmaoven met de te verlijmen zijkanten naar boven gericht.
   2. Plaats het deksel op de plasmaoven en houd het op zijn plaats tijdens het aanbrengen van vacuüm en wacht tot het vacuüm is ontstaan.
   3. Zet het gas aan door op de gasknop te drukken en wacht ongeveer 1 minuut (de druk moet ongeveer 0,37 mbar zijn).
   4. Genereer plasma door op Generator te drukken (Voeding: 9.0, Tijd: 1 min).
   5. Als u klaar bent, schakelt u de pomp en het gas uit; ventileer en open de deur.
   6. Hecht de chip aan het glas door de geactiveerde oppervlakken op elkaar te plaatsen en gelijkmatig druk uit te oefenen. Pas op dat het glas niet breekt.
      OPMERKING: Een watertest kan worden uitgevoerd om te bevestigen dat de plasmabehandeling heeft gewerkt. Plaats een druppel water op het glazen oppervlak. Als de plasmabehandeling heeft gewerkt, moet het water zich onmiddellijk verspreiden in plaats van een druppel te vormen.
10. Plaats de gebonden chip gedurende 5 minuten in een oven op 65 °C.
11. Sluit de blootgestelde kant van de chip af met plakband om te voorkomen dat stof in de inlaten komt.
    OPMERKING: De chip kan worden bewaard tot gebruik. Openingen moeten tot die tijd met tape worden gesloten.

2. Voorbereiding van microfluïdica-experiment

OPMERKING: De volgende voorbereidende stappen zijn nodig om het microfluïdica-experiment uit te voeren: Ten eerste wordt bij het uitvoeren van het microfluïdica-experiment een vloeistofstroom gecreëerd van de inlaten naar de uitlaten. Eventuele gaten in de chip zullen functioneren als uitgangen als gevolg van de drukopbouw van de inlaten. Daarom moeten alle gaten die niet worden gebruikt, worden gesloten; bijvoorbeeld gaten die worden gebruikt om weefsel op de chip te laden. Als deze niet gesloten zijn, kan het weefsel met de vloeistof meestromen. Om deze gaten te dichten, worden PDMS-gevulde buizen gebruikt. De met PDMS gevulde buizen kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard en hoeven daarom niet voor elk microfluïdica-experiment afzonderlijk te worden voorbereid, maar kunnen in grotere batches worden gemaakt. Ten tweede worden vóór de start van het microfluïdische experiment buizen, PDMS-gevulde buizen en de chip, die nodig is voor het experiment, voorbereid en UV-gesteriliseerd. Ten slotte moet de chip worden bedekt met fibronectine, zodat het embryonale weefsel zich aan het glas kan ^hechten25.

1. Pdms-gevulde buizen maken.
   1. Neem ±1 m buis. Meer buizen kunnen worden gevuld met PDMS door meerdere stukken buis te nemen.
   2. Bereid de vereiste hoeveelheid PDMS door het monomeer met de katalysator te mengen in een verhouding van 9:1 (w:w) om polymerisatie te induceren.
      OPMERKING: Gebruik wegwerpgereedschap om te mengen, zoals plastic bekers en vorken. Meng goed.
   3. Plaats het PDMS-mengsel in een exsiccator en breng ongeveer 30 minuten vacuüm aan om lucht uit het PDMS-mengsel te verwijderen.
      OPMERKING: Bedek de binnenkant van de exsiccator met tissues voor het geval PDMS overloopt.
   4. Vul een spuit van 3 ml met PDMS. Vul voorzichtig om de vorming van luchtbellen in het mengsel te voorkomen.
   5. Gebruik een tang om de punt van een naald van 22 G in de slang te steken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de slang of uw vingers niet doorboort met de naald.
   6. Bevestig de slang via de naald aan de met PDMS gevulde spuit. Gebruik de spuitpomp om de slang te vullen, met een debiet van ongeveer 500 μL/h. Zorg ervoor dat u geen te hoge druk uitoefent om te voorkomen dat de pomp breekt.
   7. Zodra de slang volledig gevuld is met PDMS, plaatst u deze in een schaal van 15 cm en laat u deze uitharden bij kamertemperatuur (ten minste een nacht).
2. Bereid de slang en chip voor op het experiment.
   OPMERKING: De volgende buizen zijn vereist voor het experiment: ten eerste, ongeveer 50 cm buis per uitlaat en ten tweede, ongeveer 2-3 m per inlaat (de exacte grootte hangt af van de ruimtelijke organisatie van de pompen, incubator of microscoop die later worden gebruikt). De inlaatbuis moet lang zijn om het kweekmedium in staat te stellen tijdens het experiment in evenwicht te brengen met _CO2 voor embryocultuur.
   1. Knip de slang in een hoek van 45° zodat puntige uiteinden ontstaan; dit maakt het gemakkelijker om de slang in de gaten van de chip te steken. Bevestig één naald aan elk van de inlaatbuizen. Zie stap 2.1.5.
   2. Knip met PDMS gevulde buizen in pluggen van ±1 cm. Snijd in een hoek van 45° zodat puntige uiteinden ontstaan; dit maakt het gemakkelijker om de slang in de gaten van de chip te steken. Er zijn voldoende pluggen nodig om elk gat te vullen dat niet aan een slang is bevestigd.
   3. Verwijder het plakband van de chip.
   4. Plaats alle slangen met naalden bevestigd, de chip en de pluggen in een schaal en steriliseer door blootstelling aan UV-licht gedurende ±15 minuten. Elke celkweekkap met de mogelijkheid voor UV-sterilisatie kan worden gebruikt.
3. Coating van chip met fibronectine.
   OPMERKING: Voor het kweken van 2D ex vivo culturen van posterieure PSM, coat de chip met fibronectine.
   1. Plaats de chip in een bekerglas met PBS + 1% penicilline / streptomycine bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de chip volledig bedekt is met PBS. Spoel de chip met PBS om lucht te verwijderen met een P200 pipet.
      OPMERKING: Alle verdere behandeling van de chip zal in dit bekerglas worden gedaan tot het begin van het experiment om het binnendringen van lucht in de chip te voorkomen. Pas op dat u de glasplaat van de chip niet breekt.
   2. Bereid 2 ml 1:20 fibronectine in PBS en vul in een bekerglas.
   3. Laad een spuit van 3 ml voor elke kamer van de chip. Steek met een tang een naald van 22 G in de uitlaatslang. Bevestig de naald aan de spuit die fibronectine bevat.
   4. Sluit de spuit aan op de spuitpomp. Spoel de slang door, totdat er geen lucht meer in de slang zit.
   5. Bevestig de uitlaatslang aan de uitlaat van de chip. Zorg ervoor dat je de slang helemaal naar beneden duwt. Stel een laag debiet in om de chip te coaten. Alle andere openingen kunnen open blijven. Laat de spuitpomp minstens 2 uur draaien, kan ook 's nachts draaien.
   6. Stop de pomp. Snijd de slang direct na de naald af. De resterende buizen zullen later tijdens het experiment als uitlaat dienen.

3. Microfluïdica experiment

OPMERKING: Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het meevoeren van de muissegmentatieklok in 2D ex vivo culturen door het toepassen van pulsen van de Notch-signaleringsremmer DAPT. Het toepassen van pulsen met een periode van 130 min, dicht bij de natuurlijke periode van de muissegmentatieklok (137 ^min25), maakt een efficiënte meevoering mogelijk. Pulsen van 100 min medium en 30 min van 2 μM DAPT worden toegepast (figuur 2A). De aanwezigheid van een medicijn in de chip wordt gecontroleerd met behulp van een fluorescerende kleurstof. De excitatie- en emissiespectra van deze kleurstof en de fluorescerende signaleringsmelder moeten verschillend genoeg zijn om doorbloeding tijdens fluorescentie real-time beeldvorming te voorkomen. Wanneer gele fluorescerende eiwitten worden gebruikt als signaleringsverslaggever, zoals de Notch-signaleringsverslaggever ^LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), kan de kleurstof, Cascade Blue, worden toegepast. Om andere mogelijke combinaties van fluorescerende kleurstof en reporter te identificeren, kan een vrij beschikbare spectraviewer worden gebruikt. Het effect van meevoeren kan worden gedetecteerd door real-time beeldvorming van dynamische signaleringsverslaggevers5,10,32. Elke chip heeft twee incubatiekamers. Dit maakt de directe vergelijking van medicijnpulsen (DAPT) mogelijk om pulsen (DMSO) te regelen.

1. Maak medium en ontgas.
   1. Bereid op de dag van het experiment 50 ml kweekmedium voor (DMEM-F12 aangevuld met 0,5 mM glucose, 2 mM glutamine en 1% BSA, voor meer informatie over de muizenstaartjescultuur ^zie25).
   2. Bereid spuiten gevuld met het medium voor op het experiment. Bereid kweekmedium voor in bekers: Om Notch-signaleringsoscillaties mee te nemen, bereidt u 6 ml medium met 1,2 μL DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 ml kweekmedium met 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; twee buizen met elk 6 ml medium. Gebruik ten minste 6 ml medium per spuit. Laad spuiten met het medium. Zorg ervoor dat u de spuiten met medicijn en DMSO labelt.
   3. Ontgas de chip in PBS en de spuiten met medium in een exsiccator. Plaats de spuiten in een bekerglas met de punt naar boven gericht, zodat de lucht aan de bovenkant kan ontsnappen. Het kan voorkomen dat de chip drijft en nog steeds gevuld is met bubbels. Deze worden daarna verwijderd.
   4. Probeer de meeste luchtbellen uit de chip te spoelen/op te zuigen met behulp van een P200-pipet. Als er wat lucht overblijft, wordt dit tijdens het volgende experiment verwijderd.
   5. Installeer spuiten in de pompen en bevestig de inlaatbuizen aan de spuiten. Gebruik twee spuitpompen voor het meevoeren van notch-signalering, één met de mediumspuiten, één met de medicijn-/DMSO-spuiten. Laat dit met een hoger debiet (0,5 ml/h) lopen tot het begin van het experiment om luchtbellen uit de buis te verwijderen. Zorg ervoor dat u de details (diameter) van de spuit goed instelt in de pomp.
2. Laden van weefsel op de chip.
   1. Ontleed muizenembryoweefsel. Ontleed de meest achterste punt van de staart (tailbud). Plaats het ontleedde weefsel in kweekmedium + 25 μM HEPES.
   2. Spoel de chip met kweekmedium + 25 μM HEPES met behulp van een P200 om PBS te verwijderen.
   3. Laad het weefsel in de chip met behulp van een P200-pipet (figuur 1C). Zorg ervoor dat u geen luchtbellen in de chip brengt.
      OPMERKING: Efficiënt laden vereist enige oefening. Als het weefsel niet goed is georiënteerd, is het misschien mogelijk om het te draaien door voorzichtig uit te zuigen en weer naar binnen te spoelen. Dit resulteert echter vaak in een snelle celdood.
   4. Sluit na elke stap die het weefsel laadt de overeenkomstige weefselbeladende inlaat met behulp van een stuk pdms-gevulde slang. Zorg ervoor dat de pluggen voldoende naar de onderkant van de chip zijn geduwd met een stomp pincet.
   5. Nadat alle monsters zijn geladen, sluit u ongebruikte inlaten /uitlaten met stukjes PDMS-gevulde buis met behulp van een stompe tang.
3. Assemblage van microfluïdische opstelling.
   1. Verlaag het debiet van de microfluïdische pompen. 60-100 μL/h werkt goed voor muizenembryo-staartjes. Bij hogere stroomsnelheden werd celdood waargenomen – vermoedelijk als gevolg van te hoge celschuiving. Het cumulatieve debiet van meerdere pompen mag deze 60-100 μL/h per microfluïdische kamer op een bepaald moment niet overschrijden.
   2. Bevestig slangen aan de microfluïdische chip. Doe dit zonder luchtbellen in de chip te krijgen (dit kan worden bereikt door ervoor te zorgen dat er een druppel medium aanwezig is aan het einde van de buis). Uit de fibronectinecoating zijn nog steeds afzetmogelijkheden aanwezig (zie 2.3).
   3. Zodra alle slangen aan de chip zijn bevestigd, haalt u deze uit het bekerglas, droogt u deze goed, plaatst u deze in een schaal en plaatst u dit samen met ongeveer 1,5 m inlaatbuis in een incubator (37 ° C, 20% _O2, 5% _CO2) voor nachtkweek. De slang is gasdoorlatend; dit maakt evenwicht van _O2 en _CO2 in het medium mogelijk. Als alternatief, voor gelijktijdige fluorescentie real-time beeldvorming, worden de chip en ongeveer 1,5 m inlaatbuizen rechtstreeks in de microscoop geplaatst. Een houder voor de chip, die past in standaard 96-putplaathouders, wordt geleverd in aanvullend bestand 3.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid hoog genoeg is tijdens de incubatie. Voeg indien nodig een vochtig weefsel toe aan de beeldvormingskamer of incubator om verdamping in de microfluïdica-opstelling te voorkomen. Als de luchtvochtigheid in de microscoopincubator te laag is, resulteert dit in luchtbelvorming in de slang en de microfluïdische chip. Vervolgens kan een gesloten beelddoos worden gebruikt, waarin chip en slang zijn geplaatst. De eenvoudigste manier om zo'n beelddoos te maken is door een groot deksel over de chip te plaatsen en een nat weefsel toe te voegen, het hoeft niet helemaal afgesloten te worden. Zorg ervoor dat het hoogteverschil tussen pomp en spaan niet te groot is en verander indien nodig langzaam van hoogte om de vorming van luchtbellen door de zwaartekracht te voorkomen.
   4. Laat alle pompen stromen met een debiet van 20 μL/h gedurende 20 minuten, nadat de opstelling op de definitieve locatie is geplaatst. Omdat de kamer en pomp hoogstwaarschijnlijk in hoogte zijn verplaatst, is dit nodig om de juiste druk in de slang te herstellen.
   5. Schakel de medicijnpomp uit, laat alleen de mediumpomp draaien op 60 μL/h tot het begin van het experiment/real-time imaging.
4. Start van het experiment.
   1. Start het geplande pompprogramma voor het experiment. Om Notch-signalering mee te nemen, gebruikt u een pompprogramma van 100 min medium en 30 min medicijnpulsen, die wordt herhaald tot het einde van het experiment, meestal gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Elke programmeerbare microfluïdische pomp kan worden gebruikt. In het eenvoudigste formaat kunnen de pompen handmatig worden geprogrammeerd en gestart. Als alternatief kunnen de pompen worden aangestuurd door een computersoftware.
   2. Als real-time beeldvorming wordt uitgevoerd, start u de beeldvorming na een periode van ten minste 30 minuten. Hierdoor kan de temperatuur van de chip worden aangepast aan de temperatuur in de incubator en wordt een te sterke drift tijdens het beeldvormen voorkomen. Autofocus is nog steeds gunstig.
   3. Voer standaard confocale beeldvorming uit via de glasplaat van de chip met behulp van een omgekeerde microscoop. Gebruik een beeldinterval van 10 minuten om signaalschommelingen voldoende te detecteren met een periode van 130 minuten.
   4. Voor kortere perioden, verkort het interval voor voldoende bemonstering. Voeg een beeldvormingstrack met lage resolutie toe voor detectie van Cascade Blue om de aanwezigheid van een geneesmiddel op de chip te visualiseren.
   5. Gebruik voor excitatie van een Venus-verslaggever een 515 nm-laser of een 2-fotonenlaser op een golflengte van 960 nm.
   6. Verkrijg een z-stack van 6-8 vlakken met een afstand van 8 μm door middel van een 20x plandoel (resolutie 512 x 512 pixels, 1,38 μm /pixel). Gebruik een gemotoriseerde fase om meerdere monsters binnen één experiment in beeld te brengen.
   7. Exciteer Cascade Blue met een 405 nm laser en verkrijg elke 10 minuten een enkel z-vlak (resolutie 32 x 32 pixel, 22,14 μm/pixel).
      OPMERKING: Meer informatie over beeldvorming en beeldanalyse vindt u in de representatieve resultaten en is te vinden in ^referentie10.

Resultaten

Met dit protocol wordt een methode gepresenteerd voor de externe meevoering van signaaloscillaties van de muissegmentatieklok met behulp van microfluïdica. Door pulsen van Notch-signaleringsremmer toe te passen, worden signaaloscillaties in onafhankelijke embryoculturen met elkaar ^{gesynchroniseerd10}. Een voorwaarde voor de toepassing van dit systeem om de functionaliteit van de segmentatieklok te bestuderen, is dat signaaldynamiek en segmentatie nog steeds op de chip aanwezig zijn. Eerder werd aangetoond dat zowel Wnt- als Notch-signaleringsdynamiek wordt gehandhaafd ondanks een constante mediumstroom en fysieke grensvorming blijft bestaan in perifere 2D-culturen, die anterieure ^PSM10 vertegenwoordigen.

Om de meevoering van signaaloscillaties naar externe medicijnpulsen te bevestigen, wordt real-time beeldvorming uitgevoerd van bijvoorbeeld de Notch-signaleringsverslaggever ^LuVeLu5, die het gele fluorescerende eiwit Venus tot expressie brengt, tijdens het microfluïdische experiment. Omdat de oriëntatie van de 2D-culturen op de chip moeilijk te controleren is, worden signaalschommelingen in voorste weefsel geanalyseerd. De periferie van de 2D-cultuur kan reproduceerbaar worden gedetecteerd. Oriëntatie van de weefselsecties op de chip kan niet naar believen worden gecontroleerd en het hele binnenoppervlak van de chip wordt bedekt met Fibronectine. Daarom komt het af en toe voor dat culturen zich hechten aan de zijkanten of het plafond van de chip. In het geval dat de monsters uit het gezichtsveld bewegen (in x-, y- en z-richting) of ze hechten met het achterste uiteinde van de staart naar beneden gericht, zijn deze monsters over het algemeen uitgesloten.

Voor verdere analyse worden meerdere van dergelijke entrainment-experimenten gecombineerd. Onafhankelijke experimenten kunnen op elkaar worden afgestemd met behulp van de timing van de medicijnpulsen gevisualiseerd door de kleurstof Cascade Blue, bij ongeveer 400 nm. Om synchronisatie te analyseren en te visualiseren, kunnen gekwantificeerde oscillaties worden gedetrendeerd (figuur 2B, D) en vervolgens worden weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie of fasen van de oscillaties kunnen worden berekend. Dit maakt de analyse mogelijk van de fase-relatie tussen oscillaties van onafhankelijke posterieure embryoculturen naar elkaar en naar de externe geneesmiddelpulsen (figuur 2C,E). Het python-gebaseerde programma ^pyBOAT33 is een eenvoudig en gebruiksvriendelijk hulpmiddel om periode, fase en amplitude van dergelijke signaaloscillaties te bepalen. Om de meevoering te bevestigen, kan men bijvoorbeeld de periode van de endogene signaalschommelingen bepalen. Bij het toepassen van pulsen met een periode van 130 min laten Notch signaleringsoscillaties ook een periode van 130 min zien (Figuur 2F)¹⁰. Bovendien kunnen met behulp van Cascade Blue-pulsen onafhankelijke experimenten met verschillende signaalgevers op elkaar worden afgestemd. Op deze manier kan indirect de fase-relatie tussen oscillaties van meerdere signalerende melders worden ^bepaald10.

Zo maakt het gepresenteerde microfluïdische systeem de controle van signaaloscillaties in ex vivo culturen van het zich ontwikkelende muizenembryo mogelijk. In combinatie met beeldvorming van markers voor segmentvorming en differentiatie, kan dit systeem nu worden toegepast om te ontleden hoe signaalroutes van de segmentatieklok interageren en hoe ze somietvorming regelen.

Figuur 1: Schematisch overzicht van het microfluïdicaprotocol. (A) Spaanvormen kunnen worden ontworpen met behulp van CAD-software (computer-aided-design). Een chipontwerp om signaaloscillaties mee te nemen in ex vivo modellen van muis somitogenese is voorzien. Mallen kunnen bijvoorbeeld worden gegenereerd door 3D-printen of besteld. Microfluïdische chips worden geproduceerd door het vormen van PDMS. Een geharde PDMS-chip wordt uitgesneden en covalent gehecht aan een glasplaat met behulp van een plasmaoven. Het glazen oppervlak in de chip is bedekt met fibronectine om ontleed weefsel te laten hechten. Embryonaal weefsel wordt via laadinlaten op de chip geladen, die vervolgens worden gesloten. Pompen met verschillende mediacondities worden aan de inlaten van de chip bevestigd en een stroomprogramma wordt geïnitialiseerd. Weefsel kan tijdens het experiment met een confocale microscoop in beeld worden gebracht. (Kymografen aangepast van Sonnen et al., 201810. Herdrukt en aangepast van Cell volgens Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Schematische tekening van een matrijsontwerp voor on-chip kweek van achterste muisembryoweefsel. De hoogte van de microfluïdische kanalen is 500 μm, voldoende voor de kweek van achterste embryonale muizenstaarten. Het bestand om deze mal af te drukken is beschikbaar in Aanvullend bestand 1 en een alternatief wordt gegeven in Aanvullend bestand 2. (C) Brightfield-afbeelding van een E10.5-gesegmenteerde muisstaart omsloten door PDMS-pilaren op de chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve resultaten van een microfluïdica-experiment. (A) Schematische weergave van het entrainment-experiment met medium en medicijnpomp. Pulsen van signaalroutemodulator worden toegepast op ex vivo culturen van muizenembryo's en signaaloscillaties kunnen worden gevisualiseerd door real-time beeldvorming van dynamische signaleringsverslaggevers (bijvoorbeeld de Notch-signaleringsverslaggever LuVeLu5 en Wnt-signaleringsverslaggever Axin2T2A10). Stippellijnen geven het gebied aan dat in de loop van de tijd voor analyses wordt gebruikt. (B-F) LuVeLu reporter oscillaties worden meegevoerd door periodieke pulsen van de Notch signaleringsremmer DAPT. (B,D) Kwantificeringen van Notch-signaleringsoscillaties in anterieure PSM bij meevoeren met behulp van DAPT of een DMSO-besturing. (C,E) Fase-fase relatiediagrammen tussen de fase van Notch-signaleringsoscillaties en de timing van externe DAPT/DMSO-pulsen. Bij meevoeren wordt een stabiele fase-relatie tot stand gebracht. (F) Kwantificering van de gemiddelde periode en SEM van oscillaties van reporters waarbij monsters worden vergeleken die zijn meegevoerd met DMSO- en DAPT-pulsen. (Figuur aangepast van Sonnenet al., 201810. Herdrukt en aangepast van Cell volgens Creative Commons Naamsvermelding CC BY-NC-ND 4.0.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Probleem	Voorgestelde oplossing(en)
Het PDMS hecht niet aan het glas.	- Zorg ervoor dat zowel het PDMS als het glas schoon zijn.
	- Zorg ervoor dat er voldoende PDMS rond de kamer is voor verlijming.
	- Optimaliseer de instellingen van de plasmaoven.
Er zitten luchtbellen op mijn chip.	- Controleer of de pomp is ingeschakeld.
	- Ontgas de chip voordat je weefsel op de chip laadt.
	- Ontgas het medium voor aanvang van het experiment.
	- Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de incubatiekamer hoog genoeg is.
Het weefsel sterft aan het begin van het experiment.	- Voeg HEPES toe aan het medium bij het laden en monteren van de chip.
	- Spoel het weefsel niet te vaak in en uit tijdens het laden.
	- Controleer of het debiet niet te hoog is.
Het weefsel sterft af tijdens beeldvorming.	- Zorg ervoor dat er geen fototoxiciteit van de beeldvorming is
	- Zorg ervoor dat er geen besmetting is.
	- Het debiet mag niet te hoog zijn.
De focus verandert tijdens het fotograferen.	- Gebruik autofocus tijdens het fotograferen om aan te passen aan drift van de beelddia.
	- Laat de chip gedurende ten minste 30 minuten in evenwicht zijn met de temperatuur in de microscoop.
Uitlaten/inlaten worden losgemaakt.	- Duw alle slangen helemaal naar beneden.
Het glas van de chip breekt.	- Wees voorzichtiger, het glas is erg fragiel.
	- Het dunne glas is alleen nodig voor beeldvorming. Als er geen beeldvorming wordt uitgevoerd, kan een normale dikkere glasplaat worden gebruikt.
	- Als de breuk buiten de chip ligt, is dit misschien geen probleem. Als de glasafdichting van de chip wordt verbroken, lekt er vloeistof uit en komt er lucht binnen.
Er zit een besmetting op mijn chip.	- Voeg antibiotica toe aan het kweekmedium.
	- Steriliseer alle apparatuur en slangen.
	- Werk snel en schoon.

Tabel 1: Problemen oplossen

Aanvullend dossier 1: STL-bestand voor het afdrukken van een mal met een 3D-printer. Deze mal wordt gebruikt om een microfluïdische chip te genereren voor de on-chip kweek van achterste embryonale weefsel (ontwerp weergegeven in figuur 1). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: STL-bestand voor het printen van een mal met een 3D-printer om een microfluïdische chip te genereren voor de on-chip kweek van posterieur embryonaal weefsel. In tegenstelling tot aanvullend dossier 1 en het ontwerp in figuur 1, bevat dit ontwerp bellenvangers bij alle inlaten om te voorkomen dat kleine hoeveelheden lucht de belangrijkste microfluïdische kamer binnendringen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Ontwerpbestand voor het genereren van een houder om de chip in de microscoop te plaatsen. Deze houder heeft de afmetingen van een 96-well plaat en zou in standaard houders van de meeste microscopen moeten passen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hoe signaaldynamiek meercellige systemen aanstuurt, is al lang een vraag in het veld. Functioneel onderzoek vormt een belangrijke uitdaging, omdat deze dynamiek subtiel moet worden gemoduleerd om dit mogelijk te ^maken11. Een dergelijke temporele controle over routeverstoringen kan in principe worden bereikt met optogenetica, die ook een hoge ruimtelijke controle mogelijk ^maakt34. Optogenetica vereist echter de oprichting van geavanceerde genetische hulpmiddelen voor de analyse van elke signaalroute in kwestie. Het huidige protocol dat hier wordt beschreven, biedt een zeer veelzijdig hulpmiddel voor de verstoring van elke signaalroute. Het microfluïdica-experiment maakt de toepassing van tijdelijk gecontroleerde medicijnpulsen mogelijk om de dynamiek van signaalroutes in weefselculturen functioneel te onderzoeken. Hier ligt de focus op de studie van somitogenese in ex vivo culturen, maar het protocol kan worden aangepast aan andere modelsystemen.

Bepaalde stappen in het protocol zijn van cruciaal belang om een succesvol microfluïdica-experiment uit te voeren (samengevat in tabel 1). De belangrijkste punten worden als volgt besproken. Door de medium flow in de loop van het experiment ervaart de weefselkweek schuifstress. Blootstelling van het modelsysteem aan continue stroming kan celstress en in extreme gevallen celdood veroorzaken als gevolg van het afschuivingseffect. Voor ex vivo weefselculturen van muisstaartdopjes en het huidige chipontwerp bleek een debiet van 60 μL/h (maximaal 100 μL/h) goed te werken met een minimaal afschuifeffect. Wanneer meerdere pompen tegelijkertijd worden ingeschakeld voor dezelfde chip, moet het debiet van afzonderlijke pompen dienovereenkomstig worden aangepast om geen toename van het totale debiet te veroorzaken. Wanneer het huidige protocol wordt aangepast aan andere modelsystemen en chipontwerpen, moet het debiet worden geoptimaliseerd. Als alternatief is het mogelijk om medium niet continu door te spoelen, maar periodiek medium op de chip te ^wisselen35. Een dergelijke opstelling kan ook worden toegepast om signaalschommelingen in muis somitogenese (ongepubliceerde, gegevens niet getoond) te regelen. Bovendien kan ook een opstelling worden voorgesteld, waarbij weefselculturen niet worden blootgesteld aan directe vloeistofstroom, maar geneesmiddelen het weefsel bereiken door diffusie vanuit een naburig kanaal. Dergelijke systemen zijn met succes gebruikt om gradiënten van groeifactoren toe te passen op in vitro modellen van ESC-differentiatie14,36.

Een belangrijk probleem van microfluïdische experimenten is het optreden van luchtbellen op de chip tijdens het experiment. Luchtbellen in de chip of slang kunnen interfereren met een uniforme vloeistofstroom op de chip en kunnen leiden tot verwijdering van de embryocultuur van zijn locatie. Om de aanwezigheid van luchtbellen te voorkomen, zijn verschillende stappen van het protocol onmisbaar. Eerst moet het kweekmedium in spuiten en de microfluïdische chip zelf worden ontgast met behulp van een exsiccator (stap 3.1.3). Ten tweede moet men bij het laden van monsters in de laadinlaten oppassen dat er geen lucht in de chip wordt gepipetteerd samen met het monster (stap 3.2.3). Ten derde moeten bij het vullen van de slang met medium alle luchtbellen worden weggepompt voordat de chip wordt bevestigd (stap 3.3.2). Anders worden deze bubbels tijdens het experiment in de hoofdchip geduwd. Ten slotte wordt het medium tijdens het experiment in evenwicht gebracht in de beeldvormingskamer of incubator vanwege de semi-permeabele slang. De permeabiliteit van de slang zorgt ook voor verdamping van het medium, dus zorg ervoor dat de vochtigheid tijdens het experiment wordt gereguleerd om de vorming van nieuwe bubbels in de slang te voorkomen.

Over het algemeen is microfluïdica een zeer veelzijdig hulpmiddel dat kan worden aangepast aan de specifieke vraag van de onderzoeker. De huidige ontwerpbenadering maakt het mogelijk om tot 12 ex vivo culturen parallel per chip in beeld te brengen. Dit aantal wordt voornamelijk beperkt door het aantal embryo's per experiment en de tijd die nodig is om elke embryocultuur met voldoende resolutie in beeld te brengen. Als meerdere omstandigheden in één experiment moeten worden vergeleken, kunnen meerdere chips op één glasplaat worden gemonteerd. Er wordt een chipontwerp geleverd, dat ideaal is voor beeldvorming van meerdere weefselexplantaten parallel, maar gepersonaliseerde ontwerpen kunnen beperkingen in monsteraantal overwinnen om analyse met hoge doorvoer mogelijk te maken en de combinatie van meer omstandigheden binnen één experiment ^{te vergroten16,17}. Microfluïdica is beperkt tot modellen die op een chip kunnen worden gekweekt en de on-chipcultuur moet voor elk modelsysteem afzonderlijk worden geoptimaliseerd27,37,38.

In de afgelopen 5-10 jaar is microfluïdica toegepast om verschillende biologische vragen aan te pakken vanwege het potentieel voor benaderingen met hoge doorvoer en subtiele modulaties van signaaldynamiek en gradiënten. Tegenwoordig is microfluïdica een gemakkelijk toepasbaar, goedkoop en veelzijdig hulpmiddel geworden dat laboratoria gemakkelijk kunnen opzetten. Hier is het huidige protocol geoptimaliseerd voor een specifieke toepassing, namelijk het bestuderen van signaaldynamiek die somitogenese regelt. Het is eenvoudig om dit protocol en ontwerp aan te passen aan individuele onderzoeksvragen in de weefselbiologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mL spuit	Becton, Dickinson and company	300912
184 Silicon Elastomer hardingsmiddel	SYLGARD	1673921
184 Silicon Elastomer PDMS	SYLGARD	1673921
3 ml spuiten	Becton, Dickinson and company	309657
Zelfklevend plakband			Scotch Magic tape of vergelijkbaar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 roestvrij staal	Fisher Scientific	10663341
Bovine Serum albumine Gevriesdroogd pH~7	Biowest	P6154
Persluchtsysteem
Kristallerende schotel	VWR	10754-7	Gesteriliseerd
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Droogkast	VWR	467-0104
Wegwerp bekers	Duni	173 941
Wegwerp vorken	Staples	511514
Dissectie-apparatuur
DMEM/F12	Cell culture technologies	custom	DMEM/F-12, geen fenol rood, geen L-glutamine, geen glucose
Fibronectine	Sigma	F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline	CleanAir by Baker	511514	Voor UV-lichtbron
Glijplaatje nr 1.5H hoge precisie, 70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPES Buffer	Gibco	15630-056
L-glutamine	Gibco	25030024
Microscoop	Leica	Leica SP8 MP
Naalden 22G	Becton, Dickinson and company	z412139-100EA
Oven	VWR	390-09
PBS0
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15070063
Plasma oven Femto	Diener electronic
Punch Ø 1mm	Uni-Core	WB100073
Weegschaal	Sartorius	Entris
Spuitpomp	WPI	AL-4000
Tubing Ø 1mm	APT	AWG24T
Vacuümpomp	VWR	181-0308