Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

4.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62319

⸱

25 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Samenvatting

Gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) zijn alomtegenwoordig in levende organismen en spelen een cruciale rol in een verscheidenheid aan fundamentele biologische structuren en processen. Als polymeren bestaan GAG's als een polydisperse mengsel met polysaccharideketens die kunnen variëren van 4000 Da tot ruim 40.000 Da. Binnen deze ketens bestaan domeinen van sulfatie, die een patroon van negatieve lading verlenen dat interactie met positief geladen residuen van verwante eiwitliganden vergemakkelijkt. Gesulfateerde domeinen van GAG's moeten voldoende lang zijn om deze elektrostatische interacties mogelijk te maken. Om de functie van GAG's in biologische weefsels te begrijpen, moet de onderzoeker in staat zijn om de grootte van GAG's te isoleren, te zuiveren en te meten. Dit rapport beschrijft een praktische en veelzijdige polyacrylamide gel elektroforese-gebaseerde techniek die kan worden gebruikt om relatief kleine verschillen in grootte tussen GAG's geïsoleerd uit een verscheidenheid aan biologische weefseltypen op te lossen.

Inleiding

Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een diverse familie van lineaire polysacchariden die een alomtegenwoordig element zijn in levende organismen en bijdragen aan vele fundamentele fysiologische processen1. GAG's zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) kunnen op verschillende posities langs de polysaccharideketen worden gesulfateerd, waardoor geografische domeinen van negatieve lading worden overgedragen. Deze GAG's, wanneer ze worden vastgebonden aan celoppervlakeiwitten die bekend staan als proteoglycanen, projecteren in de extracellulaire ruimte en binden aan verwante liganden, waardoor de regulatie van zowel cis- (ligand gehecht aan dezelfde cel) als trans- (ligand gehecht aan naburige cel) signaleringsprocessen mogelijk is2. Bovendien vervullen GAG's ook kritieke rollen als structurele elementen in weefsels zoals het glomerulaire keldermembraan3,de vasculaire endotheelglyx4 en pulmonale epitheliale glycocalyx5, en in bindweefsels zoals kraakbeen6.

De lengte van GAG-polysaccharideketens varieert aanzienlijk afhankelijk van de biologische context en kan dynamisch worden verlengd, gesplitst en gewijzigd door een zeer complex enzymatisch regulerend systeem7. Belangrijk is dat de lengte van GAG-polymeerketens substantieel bijdraagt aan hun bindingsaffiniteit voor liganden en vervolgens aan hun biologische functie8,9. Om deze reden vereist de bepaling van de functie van een endogene GAG waardering van de grootte ervan. Helaas bestaan er, in tegenstelling tot eiwitten en nucleïnezuren, zeer weinig direct beschikbare technieken om GAG's te detecteren en te meten, wat historisch heeft geresulteerd in relatief beperkt onderzoek naar de biologische rollen van deze diverse polysaccharidefamilie.

Dit artikel beschrijft hoe GAG's uit de meeste biologische weefsels kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en beschrijft ook hoe polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) kan worden gebruikt om de lengte van de geïsoleerde polymeren met een redelijke mate van specificiteit te evalueren. In tegenstelling tot andere, zeer complexe (en vaak op massaspectrometrie gebaseerde) glycomische benaderingen, kan deze methode worden gebruikt met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en -technieken. Deze praktische benadering kan daarom het vermogen van onderzoekers uitbreiden om de biologische rol van inheemse GAG's en hun interactie met contextueel belangrijke liganden te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle biologische monsters die in dit protocol werden geanalyseerd, werden verkregen van muizen, volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Heparansulfaat isolatie

  1. Delipidatie van weefselmonsters
    OPMERKING: Delipidatie is een optionele stap voor vetrijke weefsels.
    1. Maak een 1:1 mengsel van methanol en dichloormethaan. Bereid ongeveer 500 μL per monster; grotere stukken weefsel kunnen tot 1 ml nodig hebben.
    2. Plaats elk weefselmonster in een kleine glazen container met een deksel voor delipidatie.
      OPMERKING: De massa van het monster kan variëren per weefsel van belang en experimentele behoeften. 50 mg of minder is meestal voldoende voor een adequate GAG-opbrengst, maar enige optimalisatie kan nodig zijn voor de eindgebruiker.
    3. Voeg 500 μL van de methanol:dichloormethaanoplossing toe aan elke glazen container en meng. Zorg ervoor dat alle vaste weefselmonsters volledig zijn ondergedompeld in oplosmiddel.
      OPMERKING: Gebruik serologische pipetten of plastic conische buizen om de methanol/ dichloormethaanoplossing te mengen en te hanteren; andere kunststoffen kunnen oplossen.
    4. Plaats monsters op een shaker (in beveiligd rek) in een chemische zuurkast en roer voorzichtig gedurende 1 uur.
    5. Roer de monsters tot een mengsel en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    6. Pipetteer voorzichtig de organische oplosmiddelfractie (supernatant). Dit is de lipidenfractie - het bevat geen GAG's en kan worden weggegooid.
      OPMERKING: Probeer het weefsel niet te verstoren, omdat kleine stukjes verloren kunnen gaan. Het verdient de voorkeur om een deel van de organische laag in de monstercontainer te laten, in plaats van het verlies van het monster te riskeren.
    7. Laat het deksel van de glazen container open en laat het een nacht in de kap verdampen. Vervang de buis voor de volgende stap, omdat die buizen de verdere verwerking niet zullen overleven.
    8. Zodra het oplosmiddelmengsel volledig is verdampt, gaat u over tot mechanische desintegratie (als het resterende monster is >50 mg) of Actinase E-vertering (< 50 mg).
  2. Mechanische desintegratie van vast weefsel (optioneel; voor grotere weefselmonsters)
    OPMERKING: De meeste kleinere stukjes vast weefsel (ongeveer 50 mg of minder) moeten volledig oplossen tijdens de verteringsstap. Grotere monsters vereisen echter mechanische desintegratie.
    1. Flash-freeze monsters van belang door ze in een polypropyleenbuis van de juiste grootte te plaatsen en de gesloten buis in vloeibare stikstof te plaatsen. Laat het monster bevriezen tot het helemaal vast is.
    2. Maal met een schone vijzel en stamper bevroren monsters tot een poederachtige consistentie.
    3. Ga direct verder met Actinase E digestie (Stap 1.4).
  3. Monster ontsalting en concentratie
    OPMERKING: Dit is een optionele stap en alleen vereist voor verdunde vloeibare weefselmonsters (bijv. Broncho-alveolaire lavagevloeistof (BALF) of plasma).
    1. Vloeibare monsters bundelen in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep)
    2. Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) van 3.000 Da.
    3. Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
    4. Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
    5. Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
  4. Actinase E spijsvertering
    OPMERKING: Deze stap is nodig om eiwitverontreinigingen uit uw monster te verteren en uiteindelijk te verwijderen.
    1. Meng monsters 1:1 met recombinant Actinase E tot een gewenste concentratie van 10 mg/ml. Voeg het juiste volume van 10x digestiebufferconcentraat toe. Gewenste eindconcentratie: 0,005 M calciumacetaat en 0,01 M natriumacetaat, pH 7,5. Bijvoorbeeld: 190 μL vloeibaar monster, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M calciumacetaat, 0,1 M natriumacetaat.
    2. Roer de monsters voorzichtig om te mengen en verteer vervolgens gedurende 48-72 uur bij 55 °C (tot 7 dagen voor het hele weefsel).
    3. Verwarm tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om Actinase E te verwarmen.
    4. Vries het monster in bij -80 °C of ga verder met stap 1.5.
  5. Monster ontsalting en concentratie
    OPMERKING: Als een lage massa van de GAG van belang wordt verwacht in het biologische monster, of als het behoud van verbruiksreagentia (d.w.z. centrifugaalfilterkolommen) wenselijk is, kunnen monsters worden samengevoegd om een enkel concentraat per experimentele groep te produceren (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep).
    1. Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
    2. Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
    3. Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
    4. Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen (meestal inbegrepen bij de centrifugaalfilterkolommen). Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
  6. Desiccation
    1. Plaats de opgeloste monsters uit stap 1.5.5 's nachts in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer de monsters zoals hieronder beschreven.
    2. Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.
    3. Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.
    4. Bevestig de lyofilisatorkamer op de lyofilisator en vries deze 's nachts droog (ten minste -40 °C, 0,135 Torr)
  7. Kationenuitwisselingskolom
    1. Resuspend gedroogde monsters in maximaal 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing (of, bij bundeling van monsters, resuspend tot een maximum van (400/n) μL, waarbij n = het aantal monsters in de gewenste pool. Gebruik zo min mogelijk van de reinigingsoplossing.
    2. Kalibatie de kationenuitwisselingskolom (IEX) in evenwicht met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing. Draai gedurende 5 minuten bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
    3. Laad 400 μL monsters/gepoolde monsters in de IEX-kolom. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g.
    4. Wassen 3x met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS oplossing. Draai elke keer 5 minuten op 2.000 x g.
    5. Elute 3x met 400 μL van 0,2 M NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Dit is de fractie met lage affiniteit - deze kan indien gewenst worden behouden voor kwaliteitscontroledoeleinden.
    6. Elute 3x met 400 μL van 2,7 M (16%) NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Deze fractie bevat de geïsoleerde glycosaminoglycanen van belang - bewaar het allemaal!
    7. Voeg elke eluteerde fractie toe aan methanol tot 80 vol% en incubeer bij 4 °C gedurende de nacht. Draai elk monster gedurende 5 minuten op 2.000 x g. Herstel het vaste residu omdat dit gedroogde gezouten glycosaminoglycaan is.
      OPMERKING: U kunt deze stap ook overslaan en doorgaan naar stap 1.8 om het eluaat zonder methanol te ontzouten.
  8. Monster ontsalting en concentratie
    1. Indien nodig, groepeer eluteerde fracties (vanaf 1.7.6) in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep).
    2. Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
    3. Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
    4. Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Weggooien stroomt door. Ga direct verder met stap 1.9.
  9. Chondroïtine spijsvertering
    OPMERKING: Het doel van deze stap is om GAG's te verwijderen die niet interessant zijn voor de eindgebruiker. In dit geval wordt chondroitinase gebruikt om chondroïtine te verwijderen. In de weefsels die worden gebruikt voor het genereren van representatieve resultaten (broncho-alveolaire lavagevloeistof en hele longen), laat het verteren van chondroïtinesulfaat heparansulfaat achter als de primaire resterende GAG. Eindgebruikers moeten mogelijk extra verteringsstappen toevoegen, afhankelijk van hun experimentele doelen.
    1. Laad 350 μL vergistingsbuffer (50 mM ammoniumacetaat met 2 mM calciumchloride aangepast tot pH 7,0) op de centrifugaalfilterkolom zonder het membraan aan te raken.
    2. Voeg 5 μL recombinant chondroitinase ABC toe.
    3. Plaats de monsterbuis in een oven van 37 °C en incubeer gedurende 1 uur.
    4. Draai de kolom om en plaats deze in de juiste gelabelde opvangbuizen. Draai gedurende 1 min op 2000 x g.
    5. Verwarm monsters tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om chondroitinase ABC te inactiveren.
  10. Monster ontsalting en concentratie
    1. Indien nodig, bundel chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.9.5 in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep)
    2. Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
    3. Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal indien nodig indien gewenst het monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
    4. Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
    5. Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
  11. Desiccation
    OPMERKING: In deze stap is uitdroging nodig, zodat monsters kunnen worden geresuspendeerd in een zo klein mogelijke hoeveelheid water en lopende buffer.
    1. Plaats de met chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.10.5 's nachts rechtstreeks in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer als volgt:
    2. Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.
    3. Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.
    4. Bevestig de lyofilisatorkamer aan de lyofilisator en vries een nacht droog (ten minste 40 °C, 0,135 Torr)

2. Polyacrylamide gel elektroforese van geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen

  1. Bereid oplossingen die nodig zijn voor polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) van tevoren voor(tabel 1).
    OPMERKING: Selecteer het percentage acrylamide van de oplossende geloplossing, afhankelijk van de grootte van de glycosaminoglycanen die naar verwachting in het monster zullen zitten. 15% wordt aanbevolen voor het oplossen van grotere fragmenten (langer dan 30 disacharide subeenheden); 22% voor kleinere fragmenten (<20 disacharide subeenheden in lengte).
  2. Plaats de lege cassette in de PAGE-tank. Giet de oplossende gel als volgt: Meng in een buis van 15 ml 10 ml oplossende geloplossing, 60 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid) en 10 μl TEMED (voeg ALS LAATSTE TEMED toe). Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik pipet om de bovenstaande 10 ml oplossing snel aan de cassette toe te voegen. Overlay met 2 ml gedeïoniseerd, gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren.
    OPMERKING: Het volgende PAGE-protocol is geoptimaliseerd voor een verticaal PAGE-systeem met behulp van 13,3 x 8,7 cm (breedte x lengte) 1,0 mm dikke gietcassettes met een totaal volume van ongeveer 12 ml. Andere cassettesystemen kunnen worden gebruikt, maar vereisen mogelijk optimalisatie door de eindgebruiker.
  3. Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg en giet u de stapelgel als volgt: meng in een buis van 15 ml 3 ml van de stapelgeloplossing, 90 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid), 3 μl TEMED (voeg TEMED als laatste toe).
  4. Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen; vul cassette tot rand. Volledig insteekkam meegeleverd met de set-up. Laat de stapelgel 30 min polymeriseren.
  5. Zodra de gel is gepolymeriseerd, zorgt u ervoor dat de tapestrip van de bodem van de cassette wordt verwijderd en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage.
  6. Vul de bovenste en onderste kamers met respectievelijk de bovenste en onderste kamerbuffer.
  7. Los de gedroogde monsters uit stap 1.11.4 op in het minimaal noodzakelijke volume gedeoniseerd, gefilterd water (ten hoogste 50% van het volume van de putten in de PAGE-gel). Meng 1:1 met de buffer voor het laden van het monster. Laad de monsters en de HS oligosaccharide "ladders" (zie tabel 1) in de gel.
  8. Voer de gel 5 min voor op 100 V. Laat de gel vervolgens 20-25 minuten op 200 V lopen (voor een 15% polyacrylamide oplossende gel), 40-50 min (voor een 18% polyacrylamide oplossende gel), 90-100 min (voor 22% polyacrylamide oplossende gel).
    OPMERKING: Enige optimalisatie van de 200 V-looptijd kan nodig zijn. Fenolrood migreert voor heparine oligosacchariden die 2 polymeersubeenheden lang zijn (d.w.z. mate van polymerisatie 2 of dp2); broomfenolblauw migreert voor dp10-dp14. De beste resultaten worden verkregen wanneer de spanning zodanig wordt toegepast dat de fenolrode band bijna, maar niet helemaal, naar de bodem van de gel migreert. Pas de looptijd dienovereenkomstig aan.

3. Zilverkleuring protocol

  1. Bereid alle oplossingen die nodig zijn voor zilverkleuring van tevoren voor(tabel 2).
    OPMERKING: Raak de PAGE-gel niet direct aan totdat deze is gekleurd, ontwikkeld en in stopoplossing is geplaatst. Manipuleer in plaats daarvan de gel met schoon plastic of glazen gereedschap. Het direct hanteren van de gel zal resulteren in vingerafdrukvervormingen en andere zichtbare artefacten op de gel na kleuring.
  2. Zodra de run is voltooid, demonteert u de cassette en extraheert u de gel in een schone, middelgrote container gevuld met gedeïoniseerd, gefilterd water.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de gel direct wordt gehanteerd, gebruikt u pipetpunt of een ander plastic voorwerp om de gel voorzichtig van de cassette af te pellen terwijl deze in water wordt ondergedompeld. Gel kan kwetsbaar zijn - voorzichtig omgaan.
    1. Gooi het water weg. Kleur de gel in Alcian blauwe kleuringsoplossing gedurende 5 min.
    2. Gooi Alcian blauwe vlek weg. Snel spoelen/wassen 2-3x met gedeoniseerd, gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd.
    3. Laat de vlekken een nacht in gedeoniseerd, gefilterd water op de rocker. Zorg ervoor dat er voldoende volume gedeoniseerd, gefilterd water is om ervoor te zorgen dat eventuele resterende vlek 's nachts volledig van de gel wordt gewassen.
    4. Wasgel in 50% methanol (40 min totaal, vervang de oplossing 2-3x).
    5. Was gel in gedeïoniseerd, gefilterd water gedurende 30 min. Gooi water weg en herhaal nog 3 keer voor een totaal van 2 uur, vervang het water elke keer.
    6. In een verse, schone container, beits de gel gedurende 30 minuten in zilvernitraatkleuringsoplossing.
    7. Snel spoelen/wassen 2-3x in gedeoniseerd, gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen.
    8. Was gedurende 30 minuten in gedeïoniseerd, gefilterd water. Gooi water weg en herhaal dit 2x gedurende een totaal van 90 minuten, waarbij u telkens het waterbad vervangt.
    9. Gooi water weg en voeg een ontwikkelingsoplossing toe.
    10. Zodra de ontwikkelingsoplossing is toegevoegd, observeer de gel zorgvuldig en let op het verschijnen van banden. Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren.
    11. Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u kort met stopoplossing.
    12. Gooi de was van de stopoplossing weg en vervang deze door een nieuwe stopoplossing. Laat 1 uur weken op een rocker of shaker.
    13. Was 's nachts in gedeioniseerd, gefilterd water (de gel kan echter onmiddellijk na het wassen van de stopoplossing in beeld worden gebracht).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alcian blauw wordt gebruikt om gesulfateerd GAGs 10te kleuren; dit signaal wordt versterkt door het gebruik van een volgende zilvervlek 11. Figuur 1 geeft een visuele demonstratie van het ontwikkelingsproces van zilverkleuring. Zoals aangetoond, wordt het Alcian blauwe signaal dat GAG's vertegenwoordigt, gescheiden door elektroforese, versterkt naarmate het zich ontwikkelende middel de polyacrylamide-gel binnendringt. Typisch, het ontwikkelings...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

GAG's spelen een centrale rol in veel verschillende biologische processen. Een van de belangrijkste functies van gesulfateerd GAG's (zoals HS en CS) is om te interageren met en te binden aan liganden, die stroomafwaartse signaleringsfuncties kunnen veranderen. Een belangrijke determinant van GAG-bindingsaffiniteit aan verwante liganden is de lengte van de GAG-polymeerketen 8,9,14. Om deze reden is het belangrijk voor onderzoeker...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL en EPS)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Elke combinatie van benchtop microcentrifuge/rotor die 14000 xG kan is geschikt
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electroforesekwaliteit
Actinase ESigma AldrichP5147Proteasemix van S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Moleculaire biologiekwaliteit
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500gecertificeerd ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25elektroforesekwaliteit
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGElk waterde-ionisatie-/zuiveringssysteem is een acceptabel alternatief
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Moleculaire biologiekwaliteit
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Moleculaire biologiekwaliteit
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Moleculaire biologiekwaliteit
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Elk 1.0mm dik PAGE-gietkastsysteem volstaat
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019elk vergelijkbaar verticaal gel PAGE-systeem zal werken)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000gecertificeerd ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Moleculaire biologiekwaliteit
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Gecertificeerd ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electroforesekwaliteit
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917Van Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Elke lyofilisaat die -40C en 0.135 Torr kan bereiken, zal werken; kan ook worden vervangen door een rotatievacuüm concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Gecertificeerd ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Elk vergelijkbaar gelbeeldsysteem is een acceptabel alternatief
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electroforesekwaliteit
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Vrije zuur
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ionenuitwisselingskolom moet een minimaal laadvolume van 0.4mL, werk-pH van 2-12 en selectiviteit voor ionische groepen met pKa van 11 hebben
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25gecertificeerd ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Moleculaire biologiekwaliteit
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Moleculaire biologiekwaliteit
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Moleculaire biologiekwaliteit
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electroforesekwaliteit
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Moleculaire biologiekwaliteit
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecuulgewicht afsnijdingAmiconUFC500324Grotere volumefiltereenheden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de steekproefomvang. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Elke rotatievacuüm concentrator zal werken; kan worden vervangen door lyofilisaat
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternatieve volumes en filtermaterialen acceptabel
```

Referenties

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Detectie van glycosaminoglycanenheparansulfaatchondro tinesulfaatAlcianblauw kleuringzuivering van glycosaminoglycanenanalyse van de glycocalyxoligosacharide ladderbronchoalveolaire lavage
Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.