Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

Summary

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencing transcriptoomgegevens te analyseren, van ruwe reads tot functionele analyse, inclusief kwaliteitscontrole en voorbewerkingsstappen tot geavanceerde statistische analytische benaderingen.

Abstract

Pathogenen kunnen een breed scala aan infectieziekten veroorzaken. De biologische processen die door de gastheer worden geïnduceerd als reactie op infectie bepalen de ernst van de ziekte. Om dergelijke processen te bestuderen, kunnen onderzoekers high-throughput sequencing-technieken (RNA-seq) gebruiken die de dynamische veranderingen van het gastheertranscriptoom meten in verschillende stadia van infectie, klinische uitkomsten of ernst van de ziekte. Dit onderzoek kan leiden tot een beter begrip van de ziekten, evenals het blootleggen van potentiële medicijndoelen en behandelingen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencinggegevens van onbewerkte reads tot functionele analyse te analyseren. De pijplijn is verdeeld in vijf stappen: (1) kwaliteitscontrole van de gegevens; (2) in kaart brengen en annoteren van genen; (3) statistische analyse om differentieel tot expressie gebrachte genen en mede-tot expressie gebrachte genen te identificeren; (4) bepaling van de moleculaire mate van verstoring van monsters; en (5) functionele analyse. Stap 1 verwijdert technische artefacten die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van downstream-analyses. In stap 2 worden genen in kaart gebracht en geannoteerd volgens standaard bibliotheekprotocollen. De statistische analyse in stap 3 identificeert genen die differentieel tot expressie komen of co-tot expressie komen in geïnfecteerde monsters, in vergelijking met niet-geïnfecteerde monsters. Monstervariabiliteit en de aanwezigheid van potentiële biologische uitschieters worden geverifieerd met behulp van de moleculaire mate van verstoringsbenadering in stap 4. Ten slotte onthult de functionele analyse in stap 5 de routes die verband houden met het fenotype van de ziekte. De gepresenteerde pijplijn is bedoeld om onderzoekers te ondersteunen door middel van de RNA-seq data-analyse van gastheer-pathogeeninteractiestudies en toekomstige in vitro of in vivo experimenten te stimuleren, die essentieel zijn om het moleculaire mechanisme van infecties te begrijpen.

Introduction

Arbovirussen, zoals dengue, gele koorts, chikungunya en zika, zijn op grote schaal geassocieerd met verschillende endemische uitbraken en zijn naar voren gekomen als een van de belangrijkste pathogenen die verantwoordelijk zijn voor het infecteren van mensen in de afgelopen ^decennia1,2. Personen die besmet zijn met het chikungunya-virus (CHIKV) hebben vaak koorts, hoofdpijn, huiduitslag, polyartriagie en ^{artritis3,4,5}. Virussen kunnen de genexpressie van de cel ondermijnen en verschillende signaalroutes van de gasthee....

Protocol

De monsters die in dit protocol werden gebruikt, werden goedgekeurd door de ethische commissies van zowel de afdeling Microbiologie van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen van de Universiteit van São Paulo als de Federale Universiteit van Sergipe (Protocollen: respectievelijk 54937216.5.0000.5467 en 54835916.2.0000.5546).

1. Docker desktop installatie

OPMERKING: De stappen om de Docker-omgeving voor te bereiden verschillen tussen de besturingssystemen (besturingssystemen). Daarom moeten Mac-gebruikers de stappen 1.1 volgen, Linux-gebruikers moeten stappen volgen die worden vermeld als 1.2 ....

Results

De computeromgeving voor transcriptoomanalyses is gemaakt en geconfigureerd op het Docker-platform. Deze aanpak stelt beginnende Linux-gebruikers in staat om Linux-terminalsystemen te gebruiken zonder a priori managementkennis. Het Docker-platform gebruikt de bronnen van het hostbesturingssysteem om een servicecontainer te maken die specifieke hulpprogramma's van gebruikers bevat (afbeelding 1B). Een container op basis van de Linux OS Ubuntu 20.04-distributie werd gemaakt en deze was volledi.......

Discussion

De voorbereiding van de sequencingbibliotheken is een cruciale stap om biologische vragen op de best mogelijke manier te beantwoorden. Het type transcripties van belang van de studie zal bepalen welk type sequencingbibliotheek zal worden gekozen en bio-informaticaanalyses aansturen. Bijvoorbeeld, van de sequencing van een pathogeen en gastheer interactie, afhankelijk van het type sequencing, is het mogelijk om sequenties van beide of alleen van de gastheer transcripties te identificeren.

Next-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	1.12.2	Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.
EdgeR	Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication
EnhancedVolcano	Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Assign mapped sequencing reads to specified genomic features
MDP	Computational Systems Biology Laboratory	1.8.0	Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls
R	R Core Group	4.0.3	Programming language and free software environment for statistical computing and graphics
STAR	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.7.6a	Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments
Bowtie2	Johns Hopkins University	2.4.2	Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data
Get Docker	Docker	20.10.2	Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Get Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux Repository	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
MDP Website	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr Website	MaayanLab	NA	https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI study	NCBI	NA	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/