Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

Samenvatting

Het kweken van CTC's maakt een diepere functionele karakterisering van kanker mogelijk, door specifieke markerexpressie te testen en resistentie tegen geneesmiddelen en het vermogen om de lever te koloniseren te beoordelen, naast andere mogelijkheden. Over het algemeen zou de CTC-cultuur een veelbelovend klinisch hulpmiddel kunnen zijn voor gepersonaliseerde geneeskunde om de uitkomst van de patiënt te verbeteren.

Samenvatting

Metastase is een belangrijke doodsoorzaak van kanker. Ondanks verbeteringen in behandelingsstrategieën heeft uitgezaaide kanker een slechte prognose. We worden dus geconfronteerd met een dringende behoefte om de mechanismen achter de ontwikkeling van metastase te begrijpen en zo efficiënte behandelingen voor gevorderde kanker voor te stellen. Gemetastaseerde kankers zijn moeilijk te behandelen, omdat biopsieën invasief en ontoegankelijk zijn. Onlangs is er veel belangstelling geweest voor vloeibare biopsieën, waaronder zowel celvrij circulerend desoxyribonucleïnezuur (DNA) als circulerende tumorcellen uit perifeer bloed en we hebben verschillende circulerende tumorcellijnen van gemetastaseerde colorectale kankerpatiënten vastgesteld om deel te nemen aan hun karakterisering. Inderdaad, om deze zeldzame en slecht beschreven cellen functioneel te karakteriseren, is de cruciale stap om ze uit te breiden. Eenmaal vastgesteld, kunnen circulerende tumorcellijnen (CTC) vervolgens worden gekweekt in suspensie of aanhankelijke omstandigheden. Op moleculair niveau kunnen CTC-lijnen verder worden gebruikt om de expressie van specifieke markers van belang (zoals differentiatie, epitheliale of kankerstamcellen) te beoordelen door immunofluorescentie of cytometrie-analyse. Bovendien kunnen CTC-lijnen worden gebruikt om de gevoeligheid van geneesmiddelen voor chemotherapieën met een gouden standaard en voor gerichte therapieën te beoordelen. Het vermogen van CTC-lijnen om tumoren te initiëren kan ook worden getest door subcutane injectie van CTC's in immunodeficiënte muizen.

Ten slotte is het mogelijk om de rol van specifieke genen van belang die betrokken kunnen zijn bij de verspreiding van kanker te testen door CTC-genen te bewerken, door korte haarspeld ribonucleïnezuur (shRNA) of Crispr / Cas9. Gemodificeerde CTC's kunnen dus worden geïnjecteerd in immunodeficiënte muizenpleten, om experimenteel een deel van het metastatische ontwikkelingsproces in vivona te bootsen.

Kortom, CTC-lijnen zijn een kostbaar hulpmiddel voor toekomstig onderzoek en voor gepersonaliseerde geneeskunde, waar ze voorspelling van de efficiëntie van de behandeling mogelijk maken met behulp van de cellen die oorspronkelijk verantwoordelijk zijn voor metastase.

Inleiding

Ondanks recente verbeteringen in vroege kankerdiagnose en in therapeutische strategie, is meer dan negentig procent van de kankermorbiditeit nog steeds te wijten aan metastase¹. Het metastatische proces is een cascade van meerdere stappen die begint met de lokale loslating van cellen van de primaire tumor en hun toegang tot de bloedbaan waar ze circulerende tumorcellen (CTC's) worden om uiteindelijk verre locaties zoals lever en longen te koloniseren, in het geval van colorectale kanker (CRC)². Onlangs is er een groeiende aandacht voor vloeibare biopsieën, die een niet-invasief hulpmiddel zijn om met name CTC's uit bloedmonsters van patiënten te detecteren en op te sommen. Intratumor genetische heterogeniteit is een belangrijke oorzaak van resistentie tegen geneesmiddelen; het isoleren van representatieve cellen uit tumormateriaal vormt dus een veelbelovend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde³.

Ondanks de lage frequentie van CTC's in het bloed (1 CTC per 10⁶ - 10⁷ leukocyten)⁴, werden verschillende detectie- en isolatietechnieken ontwikkeld op basis van eigenschapsverschillen tussen CTC's en andere componenten van het bloed⁵. Het aantal CTC's in bloedmonsters van patiënten kan alleen al informatie geven over het stadium van maligniteit, behandelingsrespons en ziekteprogressie^6,7. CTC-isolatie is dus een cruciaal hulpmiddel voor translationele studies om genetische heterogeniteit te beoordelen of geneesmiddelenscreening uit te voeren, evenals voor fundamentele studies om deze invasieve cellen te karakteriseren, omdat zij de belangrijkste actoren zijn van gemetastaseerde inductie^8,9. Inderdaad, vergeleken met commercieel gevestigde kankercellijnen die in de loop van de tijd duizenden mutaties hebben verzameld, delen verse CTC's de belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumor, waaronder een krachtig vermogen om te metastaseren, en ze zijn een betere weerspiegeling van de ziekte. Deze kenmerken maken ze een robuust hulpmiddel voor fundamentele studies, vooral in knock-out experimenten van voorspelde sleutelfactoren die betrokken zijn bij metastase. De uitkomst van deze experimenten kan in vivoworden gevalideerd , op muizen, zoals hieronder beschreven.

Zodra CTC's zijn geïsoleerd, kunnen ze worden uitgebreid in niet-adherente kweekomstandigheden en vervolgens kunnen ze worden gemanipuleerd, net als elke beschikbare kankercellijn, d.w.z. ze kunnen ook worden gekweekt in aanhankelijke omstandigheden of ingebed in Matrigel, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag¹⁰. Om bijvoorbeeld de expressie en lokalisatie van een interessant eiwit te testen, kunnen CTC-bollen in suspensieconditie worden gekweekt en in Histogel worden ingebed om immunofluorescentie op bolsecties uit te voeren. Bovendien, als het eiwit vliezig is, kan de expressie ervan op levende cellen worden gemeten door cytometrie.

Voor functionele studies, om de rol van een eiwit van belang te testen dat een rol kan spelen bij leverkolonisatie, kunnen CTC's met genen bewerkt, door shRNA of CRISPR / Cas9, worden geïnjecteerd in de milt van immunodeficiënte muizen. Dit laatste experiment is een krachtig model om levermetastasekolonisatie na te bootsen¹¹.

Het vermogen van CTC's om tumoren te initiëren kan worden beoordeeld door een zeer klein aantal cellen in immuno-deficiënte muizen te injecteren. Aangezien tumorinitiatie een kenmerk is van kankerstamcellen (CSC's), zal deze test het percentage CSC's binnen CTC-lijnen aangeven. Dit stamcelfenotype maakt circulerende tumorcellijnen resistent tegen sommige goudstandaard kankertherapieën. Uitgebreide CTC's kunnen daarom worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen en de beste potentiële efficiënte behandeling voor de patiënt te bepalen; CTC-respons op de behandeling kan bijvoorbeeld in vitro worden getest met behulp van een luminescentie-levensvatbaarheidstest.

In een langetermijnperspectief kan geneesmiddelenscreening op vers geïsoleerde en versterkte CTC's worden gebruikt als een nieuw hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde om te helpen bij het kiezen van de meest efficiënte en aangepaste behandeling voor patiënten.

In dit artikel worden protocollen voor het kweken van CTC-lijnen, voor het kleuren van specifieke eiwitten via immunostaining en cytometrie, voor het uitvoeren van cytotoxiciteitstests en in vivo xenograftexperimenten met CTC gedetailleerd beschreven.

Protocol

Alle in vivo protocollen werden goedgekeurd door de dierenethische instanties.

1. CTC-versterking in 3D-cultuuromstandigheden

1. Om CTC's in suspensie te kweken, eerste zaad CTC's in putten van een Ultra-Low Attachment (ULA) 24-well plaat bij de maximale concentratie van 5 cellen / μL en in 1 ml M12-medium (d.w.z. geavanceerde DMEM-F12 aangevuld met 2 mM l-glutamine, 100 eenheid / ml penicilline en streptomycine, N2-supplement, 20 ng / ml epidermale groeifactor en 10 ng / ml fibroblastgroeifactor¹⁰).
2. Om bolvorming en celexpansie mogelijk te maken, incubeer de cellen in hypoxische omstandigheden (2% O₂) tussen 6 en 10 dagen.
3. Zodra de bollen groot genoeg zijn (100 μm), om necrose te voorkomen, dissociëren ze voor versterking.
   1. Plaats de celsuspensie in een buis van 2 ml of een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
   2. Verwijder het supernatant en voeg 500 μL zacht dissociatiereagens (bijv. Accumax) toe aan de pellet.
   3. Vortex voorzichtig en incubeer de celsuspensie met zacht dissociatiereagens gedurende 20 tot 30 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Het overschrijden van de incubatietijd in het zachte dissociatiereagens (Accumax) kan abnormaal verhoogde celsterfte veroorzaken.
   4. Voeg 1,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 300 x g.
   5. Giet het supernatant af en resuspend de pellet in vers M12-medium om de dichtheid van 1-5 cellen per μL te bereiken.
   6. Zaai de celsuspensie in nieuwe putten van een Ultra-Low Bevestigingsplaat: 10 ml voor T75-kolven, 2 ml voor 6 putplaten en 100 μL voor 96 putplaten

2. Immunofluorescentie (IF) kleuring op CTC-bolsecties

1. Centrifugeer CTC-bolletjes in een buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten, zuig het supernatant op en was de pellet tweemaal met PBS.
2. Resuspend de pellet met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Centrifugeer de suspensie op 300 x g en was tweemaal met 5 ml PBS.
3. Resuspend de pellet met (d.w.z. 15 tot 20 μL) hete en vloeibare Histogel. Neem met een pipet alle suspensie en maak een druppel op een voorgekoeld oppervlak bij 4 °C en laat deze 5 tot 10 minuten polymeriseren.
   OPMERKING: Werk snel om polymerisatie van de suspensie in de punt te voorkomen.
4. Maak de vaste druppel los met het mes van een scalpel en plaats deze in een gecompartimenteerde inbouwcassette.
5. Voer de volgende stappen uit: paraffine-inclusie, paraffinesectie, sectierehydratatie, antigeenherstel en antilichaamincubatie. Deze stappen zijn hetzelfde als voor elke tumor of orgaan ingebed in paraffine en verwerkt voor immunofluorescentiekleuring¹².
   OPMERKING: De cassette kan worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C totdat paraffine wordt ingesloten.

3. Cytometrie Analyse

1. Centrifugeer CTC-bolletjes in een buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten en was de pellet tweemaal met PBS.
2. Zuig het supernatant op en voeg 500 μL van het zachte dissociatiereagens toe aan de pellet.
3. Vortex voorzichtig en incubeer de celsuspensie met het zachte dissociatiereagens gedurende 20 tot 30 minuten bij 37 °C.
   OPMERKING: Meer dan 40 minuten incubatie in het zachte dissociatiereagens (Accumax) kan leiden tot een abnormaal verhoogde celsterfte.
4. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g, verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 5 ml blokkerende buffer (d.w.z. PBS met 1% runderserumalbumine (BSA)).
5. Laat de celsuspensie door een celzeef van 40 μm gaan om de resterende bollen te elimineren.
6. Plaats na het tellen 200.000 cellen in drie fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuizen (FACS), centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en verwijder het supernatant. Gebruik een van de drie FACS-buizen als een controle die geen kleuringsreagentia ontvangt.
7. Voeg volgens het gegevensblad het juiste antilichaam toe aan de twee resterende FACS-buizen (d.w.z. één geconjugeerd antilichaam tegen het eiwit van belang, één geconjugeerde isotypecontrole).
8. Voeg na de aanbevolen incubatietijd 300 μL van de blokkerende buffer toe om de cellen te wassen, centrifugeer de 3 buizen op 300 x g en zuig het supernatant op. Herhaal deze stap twee keer. Resuspend de pellet vervolgens met de blokkerende buffer met een kleuringsreagens voor de levensvatbaarheid van de cel (behalve de FACS-buiscontrole zonder kleuring).
9. Houd de buizen op ijs tot de FACS-analyse. Gebruik eerst de buis zonder kleuring om de poort voor de levensvatbaarheid van de cel en de antilichaamkleuring te identificeren. Analyseer vervolgens de FACS-buis met het geconjugeerde antilichaam tegen het eiwit van belang, om het percentage CTC te kwantificeren dat het eiwit van belang tot expressie brengt. De FACS-buis met de geconjugeerde isotypecontrole mag geen verschuiving aangeven. Dit bevestigt dat de verschuiving specifiek is voor het beoogde eiwit van belang.
   OPMERKING: Gebruik indien mogelijk een cellijn die een hoog niveau van eiwit van belang tot expressie brengt als een positieve controle en een cellijn die het eiwit niet tot expressie brengt als een negatieve controle.

4. Luminescentie levensvatbaarheidstest (CellTiter-Glo)

1. Resuspend gedissocieerde CTC's (zoals beschreven in rubriek 1.4.5) in M12 medium. Tel de cellen en pas de celconcentratie aan tot 200.000 cellen/ml.
2. Zaai in een ULA 96-well plaat 10.000 gedissocieerde CTC's per put, in 50 μL, en incubeer de plaat in hypoxie (2% O₂) gedurende 24 uur.
3. Voeg de volgende dag 50 μL van het geteste medicijn toe aan de CTC's. Het wordt eerder aanbevolen om een titratie van de geneesmiddelconcentratie uit te voeren om de half maximale remmende concentratie (IC50) te bepalen. Behandel sommige putten alleen met een voertuig om de levensvatbaarheid van basale cellen te bepalen.
   OPMERKING: Het aantal gezaaide cellen kan verschillen tussen CTC-lijnen, afhankelijk van hun verdubbelingstijd. Bovendien moeten cellen in drielicaten worden gezaaid om de variabiliteit van de resultaten te minimaliseren.
4. Incubate platen in hypoxie voor nog eens 48 uur.
5. Plaats op dag 3 de gekweekte platen en de levensvatbaarheidsbuffer en het substraat van de luminescentiecel op kamertemperatuur en reconstitueer het substraat met een geschikt buffervolume, volgens het protocol van de fabrikant.
6. Voeg 70 μL van het luminescentie-levensvatbaarheidsmengsel toe aan elke gekweekte plaat. Plaats platen op een orbitale shaker gedurende 20 minuten om cellyse te induceren en breng vervolgens 100 μL van het mengsel over in een ondoorzichtige multi-well plaat, compatibel met de luminometer.
7. Laat de plaat rusten bij kamertemperatuur, bedek deze met aluminiumfolie om het luminescerende signaal te stabiliseren.
   OPMERKING: Luminescent signaal is stabiel voor maximaal 3 uur.
8. Neem luminescentie op met behulp van een microplaatlezer (d.w.z. Tecan Infinite 200 Pro).
9. Bereken voor data-analyse het gemiddelde van de drievoudige relatieve lichteenheid RLU per conditie. Om het percentage levensvatbaarheid te beoordelen volgens elke geneesmiddelconcentratie die nodig is: (RLU van behandelde cellen / RLU van onbehandelde cellen) x 100.

5. Subcutane injecties

1. In een microcentrifugebuis resuspend cellen in 100 μL steriel PBS. Als het aantal geïnjecteerde cellen laag is, resuspend cellen in 1:1 PBS /Matrigel, verminderd in groeifactoren, om cellen samen te concentreren en tumorinitiatie te bevorderen.
   OPMERKING: De celdichtheid kan variëren van 10 cellen (om de tumorinitiatiecapaciteit uit te dagen) tot 1 miljoen cellen, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en het doel van het experiment.
2. Trek het volledige volume op in een insulinespuit.
3. Knijp bij een immuundeficiënte muis in de huid van de flank tussen de wijs- en de ringvinger en steek de naald voorzichtig in aan de basis van de huid.
   OPMERKING: Deze procedure is niet pijnlijk en wordt uitgevoerd op bewuste muizen.
4. Injecteer het volume langzaam op dezelfde plek om de verspreiding van de cellen te voorkomen. Hierdoor ontstaat er een kleine bleb onder de huid.
5. Oefen zachte druk uit op de injectieplaats om terugstroming van het volume te voorkomen.
6. Controleer de tumorgroei, om de andere dag, met behulp van een remklauw.
7. Offer het dier op als de tumor groter is dan 1500 mm³. Afhankelijk van de beschikbaarheid van het materiaal, euthanaseer de muizen door koolstofdioxide of anesthesiegassen inademing of door cervicale dislocatie.

6. Intrasplenic injectie

1. Autoclaaf de chirurgische instrumenten (schaar en tang) voordat u begint bij 124 °C gedurende 15 minuten en reinig alle oppervlakken van de werkruimte met 70% ethanol.
2. In een microcentrifugebuis resuspend cellen in 50 μL steriel PBS en bewaar ze op ijs. De celdichtheid kan gaan van 0,5 tot 1 miljoen cellen. Een groter aantal cellen kan een stolselontwikkeling in de bloedcirculatie veroorzaken.
3. Voordat u de cellen injecteert, injecteert u 100 μL 0,015 mg / ml buprenorfine subcutaan, voor pijnverlichting.
4. Plaats de muis in een inductiekamer, waar isofluraan gedurende 2-3 minuten op 3% wordt gehouden. Wanneer het dier niet langer reageert op beweging, plaatst u het aan de rechterkant op een verwarmingskussen en handhaaft u de anesthesie met behulp van een ademhalingscircuit gezichtsmasker dat een gasmengsel van O₂ en isofluraan afgeeft.
5. Breng oogglijmiddel aan over elk oog om uitdroging van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Desinfecteer het thoracale gebied met Povidon-jodiumoplossing (d.w.z. Betadine).
6. Maak aan de dorsoventrale kant een kleine incisie van 0,5 cm met een schaar onder de 10e valse rib.
7. Til de milt voorzichtig op en leg deze op steriel gaas. Injecteer met behulp van een insulinespuit de 50 μL CTC's in de punt van de milt. Zorg ervoor dat u de spuit rechtop houdt en wacht 3-5 minuten om terugstroming te voorkomen en verwijder vervolgens de naald.
8. Lireer de miltvaten van de twee zijden (slagaders en aderen) en verwijder de milt door direct boven de twee ligaturen te snijden. De milt wordt verwijderd om ongewenste tumorvorming in dit orgaan te voorkomen.
9. Steek het buikvlies en vervolgens de huid met behulp van 5,0 afbreekbare steriele hechtingen.
10. Houd de muis warm totdat hij volledig hersteld is van de anesthesie.
11. Controleer de muis 3 dagen per week op abnormale lichaamsfunctie, abnormale beweging en houding en op gewichtsverlies.
12. Offer het dier op wanneer humane eindpunten bereiken (ongeveer 6 weken na de operatie) om levermetastasen te analyseren.

Resultaten

Zowel EpCAM- als CD26-expressies waargenomen door respectievelijk IF(Figuur 1A rechterpaneel)en FACS(Figuur 1B)geven aan dat de CTC-lijn epitheelachtig is en een van de CSC-kenmerken¹⁰vertoont. Deze epitheliale eigenschap kan verder worden gekenmerkt door kleuring met antilichamen gericht tegen andere epitheliale en mesenchymale markers. Daardoor zou het mogelijk kunnen zijn om ongeveer te weten waar de CTC-lijn zich lang...

Discussie

Het hierboven beschreven protocol werd aanvankelijk gebruikt voor colorectale CTC functionele karakterisering, maar het kan worden gebruikt voor andere soorten kanker zoals borstkanker en kan worden aangepast voor muismodellen.

De echte beperkende factor is het aantal CTC's in het bloedmonster en de efficiëntie van de techniek die wordt gebruikt om ze te isoleren en uit te breiden. Verschillende CTC-isolatietechnieken zijn beschreven op basis van specifieke CTC-eigenschappen zoals de Parsortix...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063