Method Article

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

DOI:

10.3791/62330

⸱

March 23rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee protocollen die het modelleren van intestinale apicale-specifieke interacties mogelijk maken. Organoïde-afgeleide intestinale monolagen en Air-Liquid Interface (ALI) culturen vergemakkelijken de generatie van goed gedifferentieerde epithelia toegankelijk vanaf zowel luminale als basolaterale zijden, terwijl polariteit-omgekeerde intestinale organoïden hun apicale kant blootstellen en vatbaar zijn voor hoge doorvoertesten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bekleding van het darmepitheel bestaat uit een eenvoudige laag gespecialiseerde epitheelcellen die hun apicale kant blootstellen aan het lumen en reageren op externe signalen. Recente optimalisatie van in vitro kweekomstandigheden maakt het mogelijk om de intestinale stamcelniche opnieuw te creëren en geavanceerde 3-dimensionale (3D) kweeksystemen te ontwikkelen die de celsamenstelling en de organisatie van het epitheel samenvatten. Intestinale organoïden ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) kunnen worden gehandhaafd voor de lange termijn en zelforganiserend om een goed gedefinieerd, gepolariseerd epitheel te genereren dat een intern lumen en een externe blootgestelde basale kant omvat. Deze restrictieve aard van de intestinale organoïden brengt uitdagingen met zich mee bij de toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel in vitro en beperkt het onderzoek naar biologische mechanismen zoals de opname van nutriënten en interacties tussen gastheermicrobiota en gastheer-pathogeen. Hier beschrijven we twee methoden die de toegang tot de apicale kant van het organoïde epitheel vergemakkelijken en de differentiatie van specifieke darmceltypen ondersteunen. Ten eerste laten we zien hoe ECM-verwijdering een omkering van de epitheliale celpolariteit induceert en de generatie van apicale 3D-organoïden mogelijk maakt. Ten tweede beschrijven we hoe we 2-dimensionale (2D) monolagen kunnen genereren uit eencellige suspensuspensussingen afgeleid van intestinale organoïden, bestaande uit volwassen en gedifferentieerde celtypen. Deze technieken bieden nieuwe hulpmiddelen om apicale-specifieke interacties van het epitheel met externe signalen in vitro te bestuderen en het gebruik van organoïden als platform voor precisiegeneeskunde te bevorderen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmepitheel is het op een na grootste epitheel in het menselijk lichaam en bestaat uit een gepolariseerde cellaag die de opname van voedingsstoffen vergemakkelijkt en fungeert als een barrière tegen milieubeledigingen1. Dit onderscheid tussen de apicale en basolaterale zijden stelt cellen van het epitheel in staat om hun diverse functies uit te voeren. Het apicale compartiment wordt blootgesteld aan het lumen en bemiddelt de epitheliale interacties met omgevingsprikkels en micro-organismen, terwijl het ook de opname van voedingsstoffen vergemakkelijkt. Het basolaterale oppervlak herbergt intercellulaire verbindingen en celmatrixadhesie, terwijl het interfacing met cellen van het immuunsysteem en andere weefsels2. Deze verbindingen genereren een ondoordringbare monolaag bevestigd aan het keldermembraan, dat fungeert als een barrière en de geabsorbeerde voedingsstoffen levert aan het omliggende lichaamsweefsel.

De oprichting van kweeksystemen die in staat zijn om deze darmfuncties in vitro samen te vatten, is een uitdaging geweest3. Conventionele in vitro modellen maken gebruik van getransformeerde menselijke colorectale kankercellijnen, zoals Caco-2, om 2D-monolaagculturen te genereren. Ondanks het feit dat ze meerdere functies van het absorptiecompartiment kunnen modelleren, kunnen deze modellen de samenstelling en functie van het darmepitheel niet volledig samenvatten, waardoor de belangrijkste functionele kenmerken en toepassingen worden beperkt4,5.

De opkomst van organoïden als een geavanceerd 3D-kweeksysteem gegenereerd uit stamcellen die zichzelf kunnen organiseren en differentiëren naar orgaanspecifieke celtypen, was een doorbraak in de in vitro studie van het intestinale epitheel6. Intestinale organoïden zijn ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) die lijkt op de basale lamina en celmatrixverbindingen vormt waarmee deze culturen de apicobasale polariteit van het epitheel kunnen behouden. Organoïden vertonen een gesloten architectuur waarin de apicale kant wordt blootgesteld aan het lichtgevende compartiment, waardoor de structuur van de darm wordt nagebootst. Hoewel deze gesloten organisatie de mogelijkheid biedt om oriëntatiespecifieke functies te bestuderen, beperkt het onderzoeken die toegang vereisen tot de apicale kant van het epitheel. Er zijn verschillende benaderingen gevolgd om deze beperkingen in zowel 2D als 3D te overwinnen, waaronder organoïde fragmentatie, organoïde micro-injectie en generatie van monolaagculturen7. Organoïde fragmentatie veroorzaakt het verlies van de structurele organisatie en de vernietiging van celverbindingen, waardoor het apicale oppervlak van het epitheel aan het medium kan worden blootgesteld. Deze techniek maakt gebruik van het regeneratieve vermogen van de fragmenten om organoïden te hervormen wanneer ze in een extracellulaire matrix worden gezaaid en is gebruikt om infectieziekten en gastheerpathogeneninteracties te modelleren8,9. De gelijktijdige toegang tot zowel het apicale als het basale oppervlak kan echter ook niet-specifieke reacties op infectie oproepen.

Een alternatieve benadering die toegang tot het apicale oppervlak mogelijk maakt en zowel de structurele architectuur als celverbindingen behoudt, wordt vertegenwoordigd door de micro-invoeging van factoren in het lumen van organoïden. Deze methode is uitgebreid gebruikt om gastheer-pathogene interacties te bestuderen en de effecten van Cryptosporidium10, H. pylori11en C. difficile12 op het gastro-intestinale epitheel in vitro te modelleren. Met behulp van vergelijkbare technieken werd het mutageen potentieel van de pks+ stam van E. coli op intestinale epitheel bepaald13. Hoewel effectief, organoïde micro-injection is een moeizame en inefficiënte taak gezien het grote aantal organoïden die nodig zijn om te worden geïnjecteerd om meetbare effecten te verkrijgen en daarom beperkt de toepassing ervan voor hoge doorvoer assays.

Recente vooruitgang met intestinale organoïden heeft ook methoden opgeleverd voor de oprichting van 2D monolaag organoïde culturen, waardoor hun apicale oppervlak14,15,16,17wordt blootgelegd . Deze organoïde-afgeleide monolagen vatten belangrijke in vivo eigenschappen van het intestinale epitheel samen. Ze vertonen een fysiologisch relevante celsamenstelling, die zowel gedifferentieerde als stamcelpopulaties bevat en modelleren de diversiteit over de crypt-villus-as. Omdat apicobasale polariteit behouden blijft, zorgen de inherente monolaageigenschappen voor gemakkelijke toegang tot zowel de apicale als basolaterale zijden en media-uitwisselingen kunnen de darmstroom en afvalverwijdering nabootsen, waardoor cultuur op lange termijn mogelijk is. Deze kenmerken maken organoïde-afgeleide monolagen vatbaar voor studies die zich richten op luminale interacties en bieden een superieur model voor epitheliale barrière-integriteit en permeabiliteit18,19.

Studies hebben aangetoond dat epitheliale celpolariteit strak wordt gereguleerd door ECM-eiwitten in MDCK-sferoïden20,21 en onlangs in menselijke intestinale organoïden22. Verwijdering van ECM-componenten of remming van de integrinreceptor die de celmatrixverbindingen bemiddelt, resulteert in een polariteitsomkering van intestinale organoïden en de blootstelling van de apicale kant van het epitheel aan het medium22. Deze aanpak heeft de interesse getrokken van onderzoekers die werken aan infectieziekten, omdat het gemakkelijke toegang biedt tot de apicale kant in 3D en het vatbaar maakt voor assays met hoge doorvoer. Hier beschrijven we een aangepast protocol op basis van het recente werk van het Amieva-lab22, dat de generatie van 3D-intestinale organoïden vergemakkelijkt die gemakkelijk hun apicale kant blootleggen. We schetsen ook een protocol dat efficiënt en reproduceerbaar intestinale 2D-monolagen kan genereren die zijn afgeleid van intestinale organoïden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afleiding van menselijke intestinale organoïde culturen werd uitgevoerd zoals elders beschreven23. Organoïden werden in cultuur gehouden zoals beschreven in het Product Information Sheet (PIS) voor het Intestinal Organoid Expansion Medium (zie de Tabel met materialen).

1. Omkering van intestinale organoïde polariteit

OPMERKING: In deze sectie wordt het protocol beschreven voor het omkeren van de polariteit van 3D-intestinale organoïden. Dit protocol voorziet in een gedetailleerde procedure voor de opstelling van gepolariseerde organoïden met een blootgesteld apicaal oppervlak in suspensie in een kweekplaat. Dit protocol is bedoeld als een eindpunttest, hoewel de organoïden gedurende meer dan 2 weken in deze conformatie kunnen worden gehandhaafd en een kleine stamcelpopulatie kunnen behouden waarmee ze bij passage apicale organoïden kunnen herstellen.

  1. Coating kweekmateriaal en buizen met anti-aanhechtingsoplossing
    OPMERKING: Om het aantal apicale intestinale organoïden te maximaliseren en ongewenste gehechtheid aan het cultureware te voorkomen, is voorcoating van cultureware over het algemeen vereist. Het hieronder beschreven gedeelte beschrijft de coating van cultuur en plasticgoed met anti-aanhechtingsoplossing.
    1. De kweekplaten van de laag die in het opschortingsdeel van het protocol als volgt moeten worden gebruikt.
      1. Voeg 0,5 ml anti-aanhechtingsoplossing toe aan elke put van een 24-put weefselkweekplaat.
      2. Wervel de plaat om de oplossing gelijkmatig over het oppervlak en de wanden van de putten te verspreiden.
      3. Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 1300 x g.
      4. Verwijder anti-aanhechtingsoplossing uit elke put met behulp van een aspirator of een pipet van 1 ml.
      5. Was de putten met 1 ml DMEM/F-12 met 15mM HEPES (DMEM/F12).
      6. Vul elke goed gewassen plaat met 0,5 ml DMEM/F-12 en bewaar de plaat tot gebruik op 37 °C en 5% CO2.
        OPMERKING: Als de gecoate platen niet onmiddellijk worden gebruikt, kunnen ze ten minste 1 week in de incubator worden bewaard.
    2. Coat 15 ml conische buizen die in dit protocol als volgt worden gebruikt.
      1. Voeg 4 ml anti-aanhechtingsoplossing toe aan de conische buis van 15 ml.
      2. Wervel de buis om de oplossing gelijkmatig over het oppervlak van de muren te verspreiden.
      3. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 1300 x g.
      4. Verwijder de anti-aanhechtingsoplossing uit de buis.
      5. Was de buis 1x met 5 ml DMEM/F-12 en aspireer de DMEM/F-12. De buizen zijn nu klaar voor gebruik.
        OPMERKING: Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, voeg dan 5 ml DMEM/F12 toe en bewaar bij 4 °C. Gecoate buizen kunnen minstens een week op 4 °C worden bewaard.
  2. Polariteitsinversie van intestinale organoïden door suspensiecultuur
    OPMERKING: De onderstaande stappen schetsen de omkering van intestinale organoïden die eerder onder standaard ECM-koepelomstandigheden werden gekweekt. De hier beschreven procedures zijn voor één put van een 24-put plaat. Als u andere cultureware gebruikt, past u de volumes dienovereenkomstig aan.
    1. Verwijder en gooi het medium voorzichtig weg uit elke put met organoïden zonder de extracellulaire matrixkoepel van het keldermembraan te verstoren. Zorg ervoor dat de organoïden een diameter hebben van 150-250 μm (meestal op dag 3-5) voordat u met het inversieprotocol begint.
    2. Voeg in elke put 1 ml ijskoude dissociatieoplossing toe.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur (15-25 °C) gedurende 1 min.
    4. Voeg ten minste 2 ml anti-aanhechtingsoplossing toe aan een buis van 15 ml die moet worden gebruikt voor het coaten van plastic tips.
    5. Voeg ten minste 2 ml DMEM/F-12 toe aan een buis van 15 ml voor het wassen van plastic tips gespoeld met anti-aanhechtingsoplossing.
    6. Bekleed een pipettip van 1 ml met een anti-aanhechtingsoplossing en spuit 3 keer 1 ml oplossing in de buis met anti-aanhangoplossing vanaf stap 1.2.4.
    7. Was de punt in koude DMEM/F-12 en spuit 3 keer 1 ml oplossing in de buis met DMEM/F-12 vanaf stap 1.2.5.
    8. Maak met behulp van de gecoate punt de koepels voorzichtig los door langzaam te pipetten. Zorg ervoor dat u de organoïden niet verstoort of versnippert.
    9. Breng de organoïde suspensie over op een plaat die is behandeld met anti-aanhangoplossing (vanaf stap 1.1.1).
    10. Plaats de plaat gedurende 30 minuten op een shaker bij 4 °C. Een gyro shaker kan worden gebruikt bij 70 tpm.
      OPMERKING: Vermijd hard schudden, zoals het vortexen van het monster, omdat dit kan leiden tot organoïde fragmentatie. De vorming van bubbels en schuim kan wijzen op hard schudden.
    11. Verwijder na 30 minuten de plaat. Gebruik een pipettip van 1 ml bedekt met anti-aanhechtingsoplossing en pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer.
    12. Plaats de plaat gedurende 15 minuten op een shaker bij 4 °C. Een gyro shaker kan worden gebruikt bij 70 tpm.
    13. Verwijder de plaat en laat de organoïden bezinken door de zwaartekracht (1-2 min bij kamertemperatuur). Observeer de plaat onder de microscoop om de organoïde sedimentatie te controleren.
      OPMERKING: Vermijd uitgebreide agitatie van de plaat, omdat dit kan leiden tot resuspendatie van vaste organoïden.
    14. Nadat de organoïden zijn bezinkt, verwijdert u zoveel mogelijk van de dissociatieoplossing en wast u deze door 1,5 ml DMEM/F-12 toe te voegen.
    15. Laat de organoïden bezinken en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant. Herhaal de wasstap nogmaals.
      OPMERKING: Observeer de plaat onder de microscoop om de organoïde sedimentatie te controleren voordat u een wasstap uitvoert.
    16. Verwijder zoveel mogelijk van de DMEM/F-12 en voeg 0,5 ml intestinale organoïde expansiemedium toe. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
    17. Voer de volgende dag een gedeeltelijke mediumwissel uit door de plaat onder een hoek van 25 tot 30 graden te kantelen en het medium langs de wand van de put te verwijderen. Verwijder 0,4 ml medium en zorg ervoor dat u geen zwevende organoïden verwijdert.
    18. Voeg 0,4 ml intestinale organoïde expansie medium toe. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Na 3 dagen moeten de meeste organoïden een apicale polariteit hebben, maar er kunnen zich grote aggregaten hebben gevormd.
    19. Als zich aggregaten hebben gevormd, gebruik dan een pipet van 1 ml met een tip bedekt met anti-aanhechtingsoplossing (zoals beschreven in stap 1.2.6 en 1.2.7) om de aggregaten af te scheren door 20 keer op en neer te gaan terwijl u het uiteinde van de punt in de bodem van de plaat drukt.
    20. Plaats de plaat op 37 °C en 5% CO2 en voer de volgende dag een volledige mediumwissel uit met intestinale organoïde expansiemedium (zoals beschreven in rubriek 1.2.17).
    21. Na 2 dagen (dag 5 in suspensie) kunnen apicale intestinale organoïden worden gebruikt bij downstream-assays.

2. Oprichting van intestinale cel 2D monolayer en Air-Liquid Interface (ALI) culturen afgeleid van 3D intestinale organoïden

OPMERKING: Deze sectie beschrijft het protocol voor het genereren van 2D monolaagculturen uit intestinale organoïden. Deze techniek biedt het voordeel van het opzetten van een samenvloeiende, gepolariseerde monolaagcultuur met een blootgesteld apicaal oppervlak in een weefselkweekplaat met celkweekmembraaninzet. Hoewel de monolaag zal beginnen te differentiëren in het ondergedompelde, monolaagformaat, kan extra differentiatie van de monolaag worden bereikt door over te schakelen naar een ALI-cultuur nadat deze samenvloeiing heeft bereikt. Zowel de monolayer als de daaropvolgende ALI-protocollen zijn bedoeld als eindpunttesten en hoewel de monolaagcultuur een kleine stamcelpopulatie behoudt, kan geen van beide efficiënt worden gesplitst en doorgepasseerd nadat deze is vastgesteld.

  1. Media en platen voorbereiden voor intestinale monolaagcultuur
    1. Bereid intestinale organoïde differentiatiemedium voor zoals beschreven door de fabrikant voor monolaagcultuur (zie Lijst van materialen). Voeg Y-27632 alleen toe aan een volume medium dat binnen 1 week bij een eindconcentratie van 10 μM wordt gebruikt. Indien niet onmiddellijk gebruikt, bewaren bij 4 °C.
    2. Trypsine EDTA voorverwarmen (0,05%) tot 37 °C.
    3. Bereid ten minste 2 uur voordat u monolaagculturen zaait, een 2% ECM-coatingoplossing als volgt voor.
      1. Ontdooi ECM op ijs en voeg 1:50 toe aan koude, steriele PBS om een oplossing van 2% te bereiden. Bereid voldoende hoeveelheden voor om 100 μL toe te voegen aan de bovenste put van elke te gebruiken celkweekmembraaninzetstuk van 6,5 mm(0,33 cm 2). Pas het volume op de juiste manier aan voor grotere of kleinere culturen.
    4. Voeg 100 μL toe aan elke put en incubeer elke plaat bij 37 °C en 5% CO2 tot het nodig is (ten minste 2 uur voor het zaaien).
  2. Dissocierende darmorganoïden voor monolaaggeneratie en -cultuur
    1. Verwijder een geschikt aantal organoïde kweekputten uit de incubator. Raadpleeg tabel 1 voor het aanbevolen aantal putten om te oogsten voor verschillende cultuurartikelen.
    2. Aspireer alle medium uit de organoïde culturen zonder de ECM-koepel te verstoren.
    3. Voeg 1 ml dissociatieoplossing toe aan elke put.
    4. Incubeer bij kamertemperatuur (15-25 °C) gedurende ten minste 1 min.
    5. Gebruik een pipet van 1 ml en pipet krachtig op en neer om de koepel te verstoren en de organoïden los te laten.
    6. Pool de zwevende organoïden uit elke put in een conische buis van 15 ml. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met zachte agitatie of schommelen. Organoïden voor het zaaien van meerdere putten kunnen bij deze stap worden samengevoegd, tot 10 ml volume in elke buis.
    7. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    8. Verwijder en gooi het supernatant weg. Voeg 5 ml ijskoude DMEM/F-12 toe aan resuspend organoïden.
    9. Meng en centrifugeer opnieuw op 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    10. Aspireer het supernatant, verwijder zoveel mogelijk, wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren.
      OPMERKING: Er kan nog wat ecm in de pellet achterblijven; dit mag echter geen significante invloed hebben op de dissociatie van de organoïden.
    11. Voeg 1 ml voorverwarmde (37 °C) Trypsine-EDTA (0,05%) toe aan resuspend organoïden. Meng grondig om een gelijkmatige suspensie te garanderen. Voeg tot een extra 1 ml Trypsin-EDTA toe voor een groot aantal cellen, of als er een aanzienlijke hoeveelheid ECM overblijft.
    12. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 min.
    13. Meng grondig met een pipet van 1 ml om de organoïden zoveel mogelijk te verstoren. Organoïden moeten volledig worden gedissocieerd in enkele cellen of kleine fragmenten. Als grotere fragmenten of hele organoïden na grondig pipetten achterblijven, gaat u nog 3-5 minuten door met de incubatie met Trypsine-EDTA bij 37 °C.
      OPMERKING: Incubeer niet langer dan 20 minuten met Trypsin-EDTA, omdat dit kan leiden tot een verhoogd verlies van levensvatbaarheid van cellen.
    14. Zodra organoïden voldoende zijn losgekoppeld, voegt u een gelijk volume DMEM/F-12 toe (bijv. 1 ml DMEM/F-12 per ml Trypsin-EDTA) en pipet op en neer om grondig te mengen. Inactiveer Trypsin-EDTA door in deze stap 10% FBS toe te voegen aan de DMEM/F-12.
    15. Centrifugeer fragmenten bij 200 x g gedurende 5 min bij 2-8 °C.
    16. Als de gedissocieerde organoïden niet pelleteren, komt dit vaak voor en kan dit te wijten zijn aan een ophoping van slijm dat vrijkomt door de gedissocieerde cellen. Meng in dit geval de cellen grondig door ze op en neer te pipetten en centrifugeer ze opnieuw op 200 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C.
    17. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant, laat alleen de celkorrel achter.
    18. Resuspendeer de cellen in 100 μL intestinale organoïde differentiatiemedium (met 10 μM Y-27632) voor elke put die moet worden gezaaid. Pas het volume op de juiste manier aan voor grotere of kleinere putgroottes.
    19. Verwijder de gecoate platen uit de incubator (voorbereid in stap 3.1.4) en verwijder het overtollige ECM uit elke put.
    20. Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan de bovenste put van elke celkweekinzet.
    21. Voeg 500 μL intestinale organoïde differentiatiemedium toe aan de onderste put van elke celkweekinzet.
    22. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
    23. Vervang het medium om de 2 tot 3 dagen in zowel de bovenste als de onderste put. Monolaagculturen moeten binnen 7 dagen samenvloeiing bereiken en zullen vaak binnen 2-3 dagen samenvloeiing bereiken.
  3. Het opzetten van een Air-Liquid Interface (ALI) cultuur
    OPMERKING: Indien gewenst kan verdere differentiatie van een ondergedompelde intestinale monolaagcultuur worden bereikt door de ondergedompelde monolaagcultuur over te schakelen naar een ALI-cultuur. Deze kweekmethode zal een toename van het aantal gedifferentieerde celtypen mogelijk maken, met name cellen van de secretoire afstamming, zoals bokaal- en entero-endocriene cellen.
    1. Stel een monolaagcultuur vast in een celkweekinvoeging zoals hierboven beschreven in stap 2.2.1-2.2.23 en houd deze cultuur gedurende ten minste 4 dagen op 100% samenvloeiing.
    2. Om een ALI-cultuur vast te stellen, verwijdert u het medium uit de bovenste en onderste putten. Voeg vers intestinale organoïde differentiatiemedium (met Y-27632) toe aan de onderste put, waardoor de bovenste put leeg blijft.
    3. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
    4. Vervang het medium in de onderste put om de 2-3 dagen en laat de monolaag minstens 1 week differentiëren.
    5. Spoel de bovenste put indien nodig af met steriele PBS om overtollige slijmophoping te verwijderen.
      Onder deze omstandigheden kan de ALI-cultuur ten minste 2-3 weken worden gehandhaafd.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden werden gegenereerd uit biopsiemonsters volgens het eerder beschreven protocol23 en in het voor intestinale organoïde expansiemedium (zie de tabel met materialen). Figuur 1A, Linkerpaneel, toont het fenotype van de intestinale organoïden gekweekt in een koepel met intestinale organoïde expansiemedium. In deze kweekomstandigheden vertonen organoïden een cystische morfologie gedefinieerd door een dun (10-25 μm) epitheel dat een lumen omsluit (Figuur 1A, Rechterpaneel). In dit stadium kijkt de apicale kant van het darmepitheel naar het lumen, terwijl de basolaterale kant contact maakt met de omringende extracellulaire matrix. Toen de meeste organoïden de gewenste grootte bereikten, werd de extracellulaire matrix verwijderd en werden de organoïden vervolgens gekweekt in suspensie. Het verlies van cellulaire binding aan de extracellulaire matrix veroorzaakt een inversieproces in de organoïden, wat resulteert in een omkering van de polariteit van het organoïde epitheel, waardoor de apicale kant van het epitheel wordt blootgesteld aan het groeimedium en de basolaterale kant wordt geïnternaliseerd.

In sommige culturen, organoïden in ophanging aggregaat en zekering, een effect dat dieper is tijdens de eerste 3 dagen (Figuur 1B, Linker paneel). Toepassing van een afschuiftechniek maakt het mogelijk om de organoïden te ontkoppelen en de culturen dagenlang voort te zetten met minimale reaggregatie (Figuur 1B, Rechterpaneel).

Intestinale organoïden gekweekt in ECM-koepels blijven zich uitbreiden (Figuur 1C, Linkerpaneel) en vertonen spontane vorming van secundaire ontluikende structuren, die lijken op kleine crypten, aan de basolaterale kant van het epitheel rond het lumen (Figuur 1C,Rechterpaneel). Tegelijkertijd blijven organoïden die gedurende 5 dagen worden bewaard bij afwezigheid van extracellulaire matrix zich ontwikkelen in suspensie (figuur 1D, linkerpaneel). De omkering van de polariteit wordt gekenmerkt door de verdikking (30-40 μm) van het epitheel dat de kern van de organoïden omringt en het verschijnen van een verscheidenheid aan morfologieën: langwerpig (figuur 1D, rechterpaneel en aanvullend figuur 1A), cystisch (aanvullend figuur 1B) en onregelmatig (aanvullend figuur 1C). Dit wordt vaak gecombineerd met een krimp van de lichtgevende ruimte in de organoïde, wat hun totale grootte beïnvloedt.

Efficiënte inversie kan ook worden bevestigd door de expressie van intestinale specifieke polariteitsmarkers te analyseren. Apicale intestinale organoïden vertonen een duidelijke lokalisatie van de kernen in de richting van het lumen van de organoïde, zoals aangegeven door het 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) signaal. De expressie van apicale markers, zoals VILLIN (Figuur 2A) en ZO-1 (Figuur 2B), wordt gedetecteerd aan de buitenkant van het epitheel dat wordt blootgesteld aan het medium. Deze lokalisatie staat in schril contrast met die waargenomen in intestinale organoïden gekweekt in ECM. Extracellulaire matrix ingebedde organoïden gekleurd voor kernen (DAPI), VILLIN (Figuur 2C) en ZO-1 (Figuur 2D) tonen een apicobasale polariteit aan waarbij de apicale kant naar het lumen van de organoïde kijkt.

Volledige verwijdering van ECM is vereist om een efficiënte polariteitsinversie van de intestinale organoïden te verkrijgen. Af en toe vertoont een deel van de organoïden in suspensieculturen omringd door ECM-residuen een cystische morfologie die wijst op een falen in polariteitsinversie van het epitheel (Aanvullende figuur 2A). Analyse van immunofluorescente kleuring, uitgevoerd op deze organoïden, levert bewijs van de basolaterale positie van de kernen (DAPI) langs het epitheel en de expressie van ZO-1 aan de apicale kant die naar het lumen van de organoïde kijkt (Aanvullende figuur 2B) die bevestigt dat onvolledige ECM-verwijdering het behoud van de apicobasale polariteit veroorzaakt op een manier die vergelijkbaar is met ECM-ingebedde organoïden.

Het protocol voor de oprichting van intestinale monolaagculturen resulteert in een samenvloeiende monolaagcultuur binnen 7 dagen na het zaaien en de cultuur zal vaak binnen 2-3 dagen samenvloeien. Een van de belangrijkste determinanten van succes is het aantal en de kwaliteit van cellen die worden gebruikt om de monolaag te zaaien. Figuur 3A, Linkerpaneel geeft een voorbeeld van een ideale zaaidichtheid van ongeveer 150.000 cellen in een 6,5 mm celkweekmembraaninzetstuk. Dit aantal is niet vast en kan zeer variabel zijn op basis van de donor en de kwaliteit van de bron organoïde cultuur; daarom moet het celnummer worden geoptimaliseerd op basis van deze variabelen. Als de zaaidichtheid te laag is of van slechte kwaliteit(figuur 3A,rechterpaneel), zijn er mogelijk niet voldoende hulpstukken om een samenvloeiende monolaagcultuur te vormen.

Zodra de monolaag is vastgesteld(figuur 3B),vormen de cellen nauwe verbindingen, waardoor een kasseienverschijning ontstaat (figuur 3B, linkerpaneel). Als ze geen samenvloeiingsmonolaag vormen (figuur 3B, rechterpaneel), zal het uiterlijk van de monolaag vaak "fragmentarisch" zijn, met gebieden van goede kwaliteit celaanhechting, maar met grotere openingen tussen deze regio's. Deze culturen bieden geen functionele barrière tussen de basale en apicale compartimenten en zijn niet geschikt voor de beschreven assays. Een samenvloeiende monolaag oriënteert zijn VILLIN-bevattende borstelrand naar de apicale kant van het epitheel, met zijn kern geplaatst in de richting van de basolaterale pool van de cel (Figuur 4B). Tussen de cellen worden intercellulaire verbindingen gevormd die bestaan uit multi-eiwitcomplexen, waaronder ZO-1 (figuur 4B). Hun aanwezigheid is de sleutel tot het bieden van de barrièrefunctie van de epitheelcultuur.

Eenmaal samenvloeiend, leidt de overgang naar een ALI-cultuur tot verdere differentiatie van de cultuur (figuur 3C). Kleine, ronde bekercellen verschijnen en de monolaag zelf krijgt een meer gevouwen uiterlijk. Hoewel bokaalcellen aanwezig zijn in het epitheel van ondergedompelde cultuur(figuur 4A),zijn ze prominenter na ALI-differentiatie. Bokaalcellen aanwezig in het epitheel scheiden slijm af, wat leidt tot een wazig uiterlijk over de bovenkant van het epitheel. De bokaalcellen en het afgescheiden slijm kunnen worden gevisualiseerd door kleuring voor het afgescheiden mucine-eiwit MUC2 (figuur 4A, C en D) en de toename van de bokaalcelpopulatie kan worden gemeten door een toename van de MUC2-expressie (aanvullende figuur 3A). Het is niet nodig om deze gelachtige slijmlaag te verwijderen en het zal aan het oppervlak van het epitheel blijven plakken en na herhaalde wasbeurten blijven. Als verwijdering nodig is, verwijdert het wassen van de cultuur met een mucolytische verbinding, zoals 10 mM N-acetylcysteïne of 50 μg/ml DTT, overtollig slijm. Naast de toename van de populatie bokaalcellen verhoogt de ALI-interface ook de aanwezigheid van entero-endocriene cellen (zoals aangegeven door CHGA-expressie) (Aanvullend figuur 3B) en volwassen enterocyten (zoals aangegeven door KRT20-expressie) (Aanvullende figuur 3C).

figure-results-1
Figuur 1: Stadia van de apicale intestinale organoïde generatie. (A) Representatieve beelden van een koepel met organoïden van de gewenste grootte op dag 4 (linkerpaneel, schaalbalk = 500 μm). Organoïden zijn dunwandig, met een open luminaal compartiment (rechterpaneel, schaalbalk = 100 μm). (B) Representatief beeld van een put met uitgebreide aggregatie na 3 dagen in suspensie (linkerpaneel, schaalbalk = 200 μm). Afbeelding van klonterfragmenten direct na het scheren (rechterpaneel, schaalbalk = 200 μm). (C) Representatief beeld van intestinale organoïden in koepel op dag 7. Organoïden vertonen een uitgevouwen lumen met de vorming van kleine knoppen aan de basolaterale kant van het epitheel (linker 20x vergroting, rechts 100x vergroting van het gemarkeerde gebied, Schaalbalk = 200 μm). (D) Representatief beeld van intestinale organoïden na ECM-verwijdering en daaropvolgende suspensiecultuur gedurende 5 dagen. De organoïden verkrijgen een dichte morfologie met een verdikt epitheel en stellen hun apicale kant bloot aan het medium. (Linker 20x vergroting, Rechts 100x vergroting van het gemarkeerde gebied, Schaalbalk = 200 μm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunofluorescente kleuring voor celpolariteitsmarkers in darmorganoïden. Apical-out (A,B) en apical-in (C,D) georiënteerde intestinale organoïden werden gekleurd met apicale markers ZO-1 en VILLIN, en met epitheliale marker E-CADHERIN (rood). DAPI (blauw) werd gebruikt om kernen te visualiseren. Linkerpanelen tonen afbeeldingen die zijn gemaakt met 25x vergroting en rechterpanelen tonen afbeeldingen van verschillende organoïden bij 63x vergroting (alleen paneel C geeft 25x en 63x vergroting van dezelfde organoïde weer). (A) Apicale intestinale organoïden bevlekt met VILLIN (groen) en E-CADHERIN (rood) geven de blootstelling van de apicale kant aan het medium aan. (B) Apicale intestinale organoïden bevlekt met ZO-1 (groen) en E-CADHERIN (rood) tonen de aanwezigheid van nauwe verbindingen en reversie van de apicobasale polariteit. (C) Matrigel-ingebedde intestinale organoïde gekleurd met VILLIN (groen) en E-CADHERIN (rood) met de apicale kant tegenover het organoïde lumen. (D) Matrigel-ingebedde darmorganoïden gekleurd met ZO-1 (groen) en E-CADHERIN (rood) die de aanwezigheid aangeven van apicale nauwe verbindingen met uitzicht op het lumen van de organoïde. (Schaalbalk = 100 μm). Organoïden werden gekleurd door immunofluorescentie en afgebeeld met behulp van eerder gepubliceerde protocollen24,25. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Oprichting van intestinale monolaagculturen. (A) Representatief beeld van 3D-organoïden na behandeling met 0,05% Trypsine-EDTA. Organoïden worden gedissocieerd tot enkele cellen of kleine celklonters ter voorbereiding op het zaaien van monolaagculturen. Linkerpaneel: voorbeeld van een optimale zaaidichtheid voor een monolaagcultuur, ongeveer 150.000 cellen per 100 μL op een 6,5 mm celkweekmembraaninzetstuk. Rechterpaneel: voorbeeld van suboptimale zaaidichtheid bij <50.000 cellen per 100 μL op een 6,5 mm celkweekmembraaninzetstuk. (B) Representatief brightfield beeld van een ondergedompelde monolaag cultuur. Linker paneel: 100% samenvloeiingslaag met het karakteristieke kasseiconsequent uiterlijk. Rechterpaneel: ongeveer 50% samenvloeiing monolaag. Hiaten in de monolaag (aangegeven door onderbroken lijn) sluiten in de loop van de tijd als gevolg van de voortdurende proliferatie van de intestinale stamcellen. (C) Representatief brightfield beeld van een gedifferentieerde ALI cultuur op 7 dagen. (Schaalbalk = 200 μm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Immunofluorescente kleuring voor gedifferentieerde celmarkers in monolaagculturen. (A) Z-stack afbeelding van immunofluorescente kleuring van een ondergedompelde monolaagcultuur voor het mucine-eiwit MUC2, wat wijst op de aanwezigheid van bokaalcellen binnen de monolaagcultuur (groen = MUC2, blauw = DAPI). (B) Z-stack afbeelding van immunofluorescente kleuring van een ondergedompelde monolaag. VILLIN-kleuring (groen) langs het apicale uiteinde van het epitheel geeft de aanwezigheid van een borstelrand aan en ZO-1-kleuring (rood) geeft de aanwezigheid aan van nauwe verbindingen tussen cellen (blauw = DAPI). (C) Z-stack afbeelding van immunofluorescente kleuring van een ALI-gedifferentieerde monolaagcultuur voor het mucine-eiwit MUC2, wat wijst op de aanwezigheid van een aanzienlijk groter aantal bokaalcellen binnen de ALI-monolaagcultuur (groen = MUC2, blauw = DAPI). (D) Cryosection van de ALI-gedifferentieerde monolaagcultuur, gekleurd voor de aanwezigheid van MUC2 (groen) en E-CADHERIN (rood) die wijzen op de aanwezigheid van bokaalcellen in het epitheel en de afscheiding van slijm langs de apicale kant van de monolaagcultuur. (Schaalbalk = 200 μm). Monolaagculturen werden gekleurd door immunofluorescentie en afgebeeld met behulp van eerder gepubliceerde protocollen26,27. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Spectrum van fenotypes van apicale intestinale organoïde in kweeksuspensie. (A, B, C) Aanvullende representatieve beelden van intestinale organoïde morfologieën in suspensie 5 dagen na ECM-verwijdering. Organoïde polariteit is omgekeerd. De organoïden zijn dichter geworden met een verdikt epitheel en de apicale kant van de organoïden is naar buiten gericht. Organoïden kunnen een verscheidenheid aan morfologieën vertonen: langwerpig (A), cystisch (B) en onregelmatig (C). (Schaalbalk = 100 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Intestinale organoïden slagen er niet in polariteit om te keren in aanwezigheid van resterend keldermembraanmatrixmedium in suspensieculturen. (A) Representatief beeld van onvolledige ECM-verwijdering en het niet omkeren van polariteit van de organoïden. Matrigelresten zijn aanwezig rond de organoïden en dragen bij aan het behoud van de epitheelpolariteit georiënteerde apicale in. Organoïden vertonen een cystische morfologie met een dun epitheel rond het lumen (Schaalbalk = 200 μm). (B) Representatief beeld van een niet-omgekeerde organoïde gevonden in suspensie cultuur omstandigheden. Kernen (blauw = DAPI) en E-CADHERIN (rood) zijn geplaatst aan de basolaterale kant, ZO-1 (groen) wordt uitgedrukt aan de apicale kant die naar het lumen van de organoïde kijkt. (Schaalbalk = 100 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 3: Genexpressie van gedifferentieerde celmarkers in monolaagculturen. (A, B, C) Expressie van MUC2, CHGAen KRT20 in ondergedompelde en ALI-gedifferentieerde monolaagcultuur gegenereerd in intestinale organoïde differentiatiemedium ten opzichte van een 3D-organoïdecultuur gekweekt met intestinale organoïde expansiemedium vastgesteld via qPCR. De instelling van een ondergedompelde monolaagcultuur verhoogt de expressie van elke gedifferentieerde celmarker; differentiatie als ALI-cultuur verhoogt echter de expressie van elke marker exponentieel. Foutbalken = +/- SEM. Klik hier om dit Bestand te downloaden.

MONOLAYER CULTUREWAREAANTAL TE OOGSTEN PUTTEN DARMORGANOÏDEN (vanaf 50 μL koepel/per te zaaien put)
6,5 mm Transwell inzetstuk1 - 2 putten
12 mm Transwell inzetstuk3 - 4 putten
6-put plaat6 - 8 putten
24-put plaat3 - 4 putten
96-put plaat1 - 2 putten

Tabel 1: Aantal putten darmorganoïden te oogsten voor diverse cultuurgerei

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitheliale organoïde modellen zijn krachtige platforms geworden die kunnen worden gebruikt om weefselorganisatie, ziekteprogressie te modelleren en therapeutische methoden te identificeren23,28,29. Organoïde micro-injectie heeft een toegevoegde waarde voor het vermogen van de organoïden om infectieziekten te modelleren, omdat het pathogene interactie met de apicale kant van het gastheerepitheel mogelijk maakt. Recente vooruitgang in micro-injectietechnieken heeft de injectiesnelheid in organoïden geoptimaliseerd en een snelheid van maximaal 90 geïnjecteerde organoïden per uur bereikt. De barrièrefunctie in geïnjecteerde organoïden bleef behouden en de lage zuurstofconcentratie in het lumen zorgde voor de overleving van verplicht-anaerobe geïnjecteerde bacteriën30. Studies hebben echter de aanwezigheid van heterogeniteit in organoïde populaties in dezelfde put opgemerkt. Deze verschillen werden waargenomen in grootte en vorm31, expressieniveaus van sleutelgenen32, evenals proliferatiepercentages33. Differentiële reacties binnen dezelfde organoïde populatie op verbindingen zoals forskolin en PGE2, of op choleratoxine, zijn ook beschreven28,33. Deze resultaten benadrukken de noodzaak van hoge organoïde aantallen in studies en beperken het gebruik van luminale injectie.

Conventionele organoïde cultuur is gebaseerd op de inkapseling en voortplanting van organoïden in een hydrogel. Hydrogels kunnen echter beperkingen op diffusie vormen en concentratiegradiënten introduceren, wat de heterogeniteit kan verhogen34. Bovendien is een hoge variabiliteit gedocumenteerd, niet alleen tussen culturen en donoren, maar ook binnen individuele experimentele omstandigheden. Donorbron, biochemische eigenschappen van de hydrogel en intrinsieke heterogeniteit van de organoïde als kweeksysteem zijn belangrijke factoren die de experimentele variabiliteit kunnen vergroten en de reproduceerbaarheid van resultaten die in downstreamtoepassingen worden verkregen, kunnen beperken. Beide hier beschreven methoden bieden een eenvoudige manier om de apicale kant van het epitheel bloot te leggen, waardoor verbindingen en pathogenen van belang kunnen worden gemodelleerd door ze rechtstreeks aan het cultuurmedium toe te voegen. De vermindering van het hydrogelgebruik kan de experimentele variabiliteit van technische foutbronnen beperken.

De apicale intestinale organoïden behouden de belangrijkste kenmerken van het organoïde modelsysteem en hun schaalbaarheid maakt ze vatbaarder voor hoge doorvoertesten, in vergelijking met de 2D-monolaag. Aangezien de organoïden echter hun 3D-structuur behouden, is de toegankelijkheid van de basale kant beperkt en kan het studies belemmeren die tegelijkertijd toegang tot beide zijden vereisen.

We hebben aangetoond dat de polariteitsinversie van intestinale organoïden afhankelijk is van de efficiënte en absolute verwijdering van ECM, terwijl ook de intacte structuur van de organoïden behouden blijft. Zowel het gebruik van de dissociatieoplossing voor het verwijderen van ECM als de anti-aanhechtingsoplossing om te voorkomen dat organoïden aan het plasticware hechten, hebben bijgedragen tot het verbeteren van de algehele efficiëntie van het protocol gepubliceerd door Co, J. Y. en collega's22, met name met betrekking tot het aantal apicale organoïden dat wordt geproduceerd voor downstreamtoepassingen.

Bovendien hebben we opgemerkt dat ons protocol een efficiëntere omkering van organoïden kleiner dan 250 μm ondersteunt en dat het gebruik van grotere organoïden kan leiden tot een verminderde organoïde output, als gevolg van de fragmentatie veroorzaakt door pipetten. Brede boringen, zoals aangegeven in de tabel met materialen,kunnen het gebruik van grotere organoïden mogelijk maken. Tips met brede boring zijn echter minder effectief bij ECM-dissociatie in vergelijking met standaardtips vanwege de lagere toegepaste mechanische kracht. Daarom kan het herhalen van stap 1.2.9-1.2.11 nodig zijn voor voldoende verstoring en volledige verwijdering van alle ECM-resten bij het werken met grotere organoïden.

Organoïden in suspensie kunnen minstens 2 weken overleven. Na deze periode zagen we morfologische veranderingen en een verhoogd aantal celdood. De aanwezigheid van proliferatiecellen in de apicale organoïden22 maakt het mogelijk om apicale intestinale organoïde culturen te herstellen. Dit kan worden bereikt door apicale organoïden te ontkoppelen van enkele cellen en ze in ECM te verankeren met intestinale organoïde expansiemedium.

Een beperking die vaak voorkomt in protocollen die de vestiging van intestinale organoïden in suspensieculturen beschrijven, is het genereren van grote aggregaten. Dit heeft invloed op verschillende variabelen zoals efficiëntie, reproduceerbaarheid van de morfologische kenmerken, permeabiliteit voor verbindingen en paracrinesignalering. Net als het protocol gepubliceerd door Co, J. Y. en collega's, bevestigen we hier dat we polariteitsinversie hebben verkregen van ten minste 97% van alle opgeschorte organoïden zonder te scheren na 3 dagen in suspensie. In tegenstelling tot de publicatie hebben we echter een mechanische dissociatiestap ingevoerd om de vorming van grote aggregaten te verminderen en de opbrengst te verhogen. Omdat deze procedure het epitheel van de organoïden kan beschadigen, hebben we de incubatietijd van de organoïden met nog eens 2 dagen verlengd om volledig epitheelherstel mogelijk te maken en culturen van hoge kwaliteit te garanderen voor downstreamtoepassingen. De introductie van constante agitatie met behulp van een incubator shaker of een spinnerkolf kan fusiegebeurtenissen verminderen, fragmentatie minimaliseren en de oxygenatie verhogen. Deze alternatieve benaderingen kunnen de culturen langer in stand houden, celdood verminderen en verdere differentiatie van de apicale intestinale organoïden mogelijk maken.

De oprichting van een organoïde-afgeleide 2D monolaag biedt verschillende voor- en nadelen in vergelijking met de omgekeerde polariteit organoïden. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om een samenvloeiende monolaagcultuur snel tot stand te brengen, meestal in minder dan 7 dagen en de mogelijkheid om de culturen gedurende een langere periode (tot 10 weken) op lange termijn te onderhouden. Het protocol en de media die hier worden gebruikt, maken ook een efficiënte differentiatie mogelijk van significante aantallen cellen, die niet altijd worden aangetroffen in andere organoïde-afgeleide monolaagculturen16. Het opzetten van een monolaag op een celkweek insert membraan zorgt voor gelijktijdige toegang tot zowel de apicale als basolaterale zijden van het epitheel, waardoor ze ideaal zijn voor studies in barrière-integriteit en epitheeltransport. Deze vereenvoudigde toegang maakt ze ook ontvankelijker voor infectie- en medicamenteuze behandelingsstudies. Bovendien behouden deze culturen veel van de kenmerken die uniek zijn voor de donor, waardoor ze relevant blijven voor patiëntspecifieke studies. De ALI-cultuurmethode vergemakkelijkt ook de differentiatie van een functioneler epitheel dat bestaat uit zowel secretoire als absorptive celtypen, waardoor het representatiever is voor het menselijke intestinale epitheel. De relatieve stabiliteit van deze culturen maakt het ook mogelijk om ze voor een langere periode te behouden, wat de mogelijkheid biedt voor langetermijnstudies. Beperkingen van deze aanpak zijn echter het grote aantal cellen dat nodig is om een samenvloeiende monolaag vast te stellen en de noodzaak om volledige samenvloeiing te handhaven om een functionele scheiding tussen de apicale en basolaterale kamers te hebben. De karakteristieke cryptearchitectuur, die kan worden gemodelleerd in de 3D-organoïde culturen, gaat ook verloren bij het opzetten van een monolaagcultuur. Niettemin maken het experimenteel vriendelijke formaat van de cultuur en het gemak waarmee de apicale en basolaterale zijden van het epitheel toegankelijk zijn, het een krachtig hulpmiddel voor de studie van darmfysiologie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G. S., W.C., en S. S. zijn werknemers van STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (UK). M. S., F. E., S. L., A. E., en R. K.C. zijn werknemers van STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Canada).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Horizon 2020-subsidie OrganoVIR 812673 op het project Organoids for Virus Research - Een innovatief training-ITN-programma.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Adherence Rinsing SolutionSTEMCELL Technologies Inc.7010For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mLSTEMCELL Technologies Inc.38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-FreeCorning356231Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell insertsSTEMCELL Technologies Inc.38023/38024For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plateSTEMCELL Technologies Inc.38017For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)STEMCELL Technologies Inc.37350For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaD2650Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies Inc.36254For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)STEMCELL Technologies Inc.7174For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies Inc.6010For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human)STEMCELL Technologies Inc.100-0214For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%)STEMCELL Technologies Inc.7910For 2D Monolayer establishment.
Y-27632STEMCELL Technologies Inc.72302RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tipsCorning#TF-1005-WB-R-SOrganoids handling

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).">Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).">Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888(2017).">Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888(2017).
  4. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).">DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).">Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).">Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).">Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147(2014).">Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147(2014).
  9. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).">Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).">Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).">Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).">Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).">Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).">Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).">Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).">Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).">Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  18. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).">VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).">Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).">Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).">Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).">Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).">Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).">Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).">Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498(2020).">Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498(2020).
  27. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).">Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).">Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).">Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).">Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479(2019).">Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479(2019).
  32. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).">Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).">Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).">Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal OrganoidsApical Out OrganoidsOrganoid MonolayersEpithelial PolarityExtracellular Matrix RemovalPolarity InversionAir Liquid InterfaceTight JunctionsNutrient AbsorptionHost Pathogen Interactions

Related Articles