Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62348

⸱

20 maart 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Emory University, 2Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van DNA-gebaseerde spanningsondes om de receptorkrachten in beeld te brengen die door immuuncellen worden toegepast. Deze aanpak kan receptorkrachten >4,7pN in realtime in kaart brengen en krachten in de loop van de tijd integreren.

Samenvatting

Mechanische krachten die worden overgedragen op de kruising tussen twee naburige cellen en op de kruising tussen cellen en de extracellulaire matrix zijn van cruciaal belang voor het reguleren van vele processen, variërend van ontwikkeling tot immunologie. Daarom is het ontwikkelen van de tools om deze krachten op moleculaire schaal te bestuderen van cruciaal belang. Onze groep ontwikkelde een reeks moleculaire spanningssensoren om de krachten te kwantificeren en te visualiseren die door cellen worden gegenereerd en naar specifieke liganden worden verzonden. De meest gevoelige klasse van moleculaire spanningssensoren bestaat uit nucleïnezuur stam-loop haarspelden. Deze sensoren gebruiken fluorofoor-quencher-paren om te rapporteren over de mechanische uitbreiding en ontvouwing van DNA-haarspelden onder kracht. Een uitdaging met DNA-haarspeldspanningssensoren is dat ze omkeerbaar zijn met snelle haarspeldhervouwing bij beëindiging van de spanning en dus zijn voorbijgaande krachten moeilijk te registreren. In dit artikel beschrijven we de protocollen voor het voorbereiden van DNA-spanningssensoren die kunnen worden "vergrendeld" en voorkomen dat ze opnieuw worden gevouwen om "opslag" van mechanische informatie mogelijk te maken. Dit maakt het mogelijk om zeer voorbijgaande piconewtonkrachten te registreren, die vervolgens kunnen worden "gewist" door de toevoeging van complementaire nucleïnezuren die het slot verwijderen. Dit vermogen om te schakelen tussen real-time spanningskartering en mechanische informatieopslag onthult zwakke, kortstondige en minder overvloedige krachten, die vaak worden gebruikt door T-cellen als onderdeel van hun immuunfuncties.

Inleiding

Immuuncellen verdedigen zich tegen ziekteverwekkers en kankercellen door voortdurend de oppervlakken van doelcellen te kruipen en te scannen op antigenen, waarbij hun oppervlak 1,2 wordt gestudeerd. Antigeenherkenning wordt geïnitieerd na binding tussen de T-celreceptor (TCR) en het peptide-major histocompatibiliteitscomplex MHC (pMHC) -complex dat tot expressie komt op het oppervlak van doelcellen. Omdat TCR-pMHC-herkenning plaatsvindt op de kruising tussen twee mobiele cellen, wordt al lang vermoed dat het mechanische krachten ervaart. Bovendien leidde dit tot het mechanosensormodel van TCR-activering, dat suggereert dat TCR-krachten bijdragen aan zijn functie 3,4. Om te begrijpen wanneer, waar en hoe mechanische krachten bijdragen aan de T-celfunctie, is het noodzakelijk om hulpmiddelen te ontwikkelen om de moleculaire krachten die door T-cellen worden overgedragen te visualiseren. Traditioneel worden methoden zoals tractiekrachtmicroscopie (TFM) en micropillar arrays gebruikt om cellulaire krachten 5,6 te onderzoeken. De krachtgevoeligheid van TFM en micropilaire arrays bevindt zich echter op de nanonewton (nN) schaal en is dus vaak onvoldoende om de moleculaire piconewton (pN) krachten te bestuderen die door celreceptorenworden overgedragen 7. Om de kracht en ruimtelijke resolutie voor detectie te verbeteren, pionierde ons laboratorium met de ontwikkeling van moleculaire spanningsondes, die aanvankelijk werden gesynthetiseerd met behulp van polyethyleenglycol (PEG) polymeren7. Moleculaire spanningsondes bestaan uit een uitschuifbare moleculaire "veer" (PEG, eiwit, DNA) geflankeerd door een fluorofoor en quencher en zijn verankerd op een oppervlak. Krachten die op het eindpunt van de sonde worden uitgeoefend, leiden tot de uitbreiding ervan, waardoor de fluorofoor en de quencher worden gescheiden en zo een sterk fluorescentiesignaal wordt gegenereerd (figuur 1A)8,9,10.

In het afgelopen decennium hebben we een bibliotheek ontwikkeld van verschillende klassen van moleculaire spanningsondes met veerelementen gemaakt van nucleïnezuren11, eiwitten10 en polymeren8. Onder deze bieden de op DNA gebaseerde spanningssondes de hoogste signaal-ruisverhouding en de grootste krachtgevoeligheid, die gemakkelijk kan worden afgestemd van een paar pN tot ~ 20 pN11. We hebben deze real-time DNA-spanningsondes gebruikt om de moleculaire krachten te bestuderen die worden gegenereerd door vele verschillende celtypen, waaronder fibroblasten, kankercellen, bloedplaatjes en immuuncellen11,12,13. Dit manuscript zal protocollen beschrijven voor het synthetiseren en assembleren van DNA-spanningsondes op een oppervlak om moleculaire receptorkrachten in kaart te brengen met pN-krachtresolutie met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Hoewel de huidige procedure chemische modificaties aan het nucleïnezuur omvat om de fluorescerende reporter te introduceren (figuur 1B), is het belangrijk op te merken dat veel van de modificatie- en zuiveringsstappen kunnen worden uitbesteed aan aangepaste DNA-synthesebedrijven. Daarom is de technologie van DNA-spanningsondes gemakkelijk en toegankelijk voor de bredere celbiologie en mechanobiologiegemeenschappen.

Kortom, om DNA-spanningssensoren samen te stellen, wordt een DNA-haarspeld gehybridiseerd tot een fluorescerende ligandstreng op de ene arm en een quencher-ankerstreng op de andere arm en vervolgens geïmmobiliseerd op een glazen substraat (figuur 1C, real-time spanning). Bij afwezigheid van mechanische kracht wordt de haarspeld gesloten en wordt dus de fluorescentie geblust. Wanneer de uitgeoefende mechanische kracht echter groter is dan de F1/2 (de kracht bij evenwicht die leidt tot een kans van 50% om zich te ontvouwen), smelt de haarspeld mechanisch en wordt een fluorescerend signaal gegenereerd.

Voortbouwend op de real-time DNA-spanningssensor beschrijven we ook protocollen om geaccumuleerde krachten in kaart te brengen, wat vooral nuttig is voor het bestuderen van interacties tussen receptoren op immuuncellen en hun natuurlijke ligand. Dit komt omdat immuunreceptoren vaak kortstondige bindingen vertonen 3,14. Geaccumuleerde krachten worden in beeld gebracht met behulp van een "vergrendelingsstreng" die bij voorkeur bindt aan open DNA-haarspelden en de opslag van fluorescentiesignalen mogelijk maakt die verband houden met mechanische trekgebeurtenissen (figuur 1C, vergrendelde spanning). De vergrendelingsstreng is ontworpen om een cryptische bindingsplaats te binden die wordt blootgesteld aan mechanisch geïnduceerd smelten van de haarspeld en de haarspeld in de open toestand te vergrendelen door het opnieuw vouwen van de haarspeld te blokkeren, waardoor het spanningssignaal wordt opgeslagen en een geaccumuleerde spanningskaart wordt gegenereerd. Bovendien is de vergrendelingsstreng ontworpen met een acht-nucleotide teengreep, die een teengreep-gemedieerde strengverplaatsingsreactie mogelijk maakt met zijn volledige complement, de "ontgrendelende" streng. Met de toevoeging van de ontgrendelingsstreng wordt de gebonden vergrendelingsstreng van de haarspeldconstructie gestript, waardoor het opgeslagen spanningssignaal wordt gewist en de haarspeld wordt teruggezet naar de real-time status.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema van de state-of-art moleculaire spanningsondes . (A) Algemeen ontwerp van real-time moleculaire spanningsonde, (B) Strengen voor de DNA-gebaseerde spanningsondeconstructie, en (C) gemanipuleerde DNA-gebaseerde spanningsondes en hun schakelen tussen real-time toestand en vergrendelde toestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het hoofdprotocol bestaat uit vier hoofdsecties - oligonucleotidepreparaat, oppervlaktevoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse. Dit protocol is met succes aangetoond door ons laboratorium en anderen in naïeve en geactiveerde OT-1 CD8 + T-cellen, OT-II CD4 + -cellen, evenals hybridomen, en kan worden toegepast om verschillende immuuncelreceptoren te ondervragen, waaronder T-celreceptor, geprogrammeerde celdoodreceptor (PD1) en lymfocytfunctie-geassocieerde antigeen 1 (LFA-1) krachten. OT-1 CD8+ naïeve T-cellen worden in dit artikel als voorbeeldcellijn gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De OT-1 transgene muizen zijn gehuisvest in de Division of Animal Resources Facility aan de Emory University. Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd onder het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.

1. Oligonucleotidepreparaat

  1. Los het DNA van de ligandstreng op in water (weerstand van 18,2 MΩ, gebruikt in het hele protocol). Vortex en draai de oplossing af met een tafelcentrifuge. Stem het watervolume zo af dat de uiteindelijke concentratie 1 mM is. Valideer de concentratie door een nanodruppelspectrofotometer te gebruiken om de absorptie bij 260 nm te meten en de uiteindelijke concentratie te bepalen op basis van de extinctiecoëfficiënt van het oligonucleotide.
    OPMERKING: De ligandstreng heeft een modificatie bij elk eindpunt, 5' amine en 3' biotine, om te conjuleren met de fluorofoor en om het gebiotinyleerde ligand te presenteren. De aminegroep in de ligandstreng moet worden geconjugeerd met een fluorofoor. Cy3B-kleurstof wordt gebruikt voor deze conjugatie vanwege de hoge helderheid en fotostabiliteit, maar het wordt over het algemeen niet commercieel aangeboden en vereist interne conjugatie. Dienovereenkomstig beschrijft de volgende sectie de conjugatie tussen amines en NHS-esterdoften. Voor eindgebruikers die geen toegang hebben tot faciliteiten of middelen voor nucleïnezuurmodificatie, kunnen gemodificeerde nucleïnezuren in plaats daarvan worden gekocht bij leveranciers van aangepaste DNA-synthese die heldere en fotografische kleurstoffen aanbieden, zoals de Alexa- en Atto-familie van kleurstoffen.
  2. Bereid 10x PBS en 1 M NaHCO3 oplossingen voor. Meng 10 μL van de 1 mM amine ligand strengoplossing (10 nmol) met 10 μL van 10x PBS, 10 μL van 1 M NaHCO3 en 60 μL van H2O. Los 50 μg Cy3B NHS-ester op in 10 μL DMSO onmiddellijk voor gebruik en voeg toe aan het mengsel voor een totaal reactievolume van 100 μL. Voeg Cy3B NHS-ester als laatste toe. Laat 's nachts bij kamertemperatuur 1 uur of 4 °C reageren.
  3. Bereid de Atto647N-vergrendelingsstreng voor door de aminevergrendelingsstreng te vervoegen met Atto647N NHS-ester. Bereid 10x PBS en 1 M NaHCO3 oplossing. Meng 10 μL van de 1 mM aminevergrendelingsstrengoplossing (10 nmol) met 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 en 60 μL H2O. Los onmiddellijk voor gebruik 50 μg Atto647N NHS-ester op in 10 μL DMSO en voeg toe aan het mengsel voor een totaal reactievolume van 100 μL. Voeg Atto647N NHS-ester als laatste toe. Laat 's nachts bij kamertemperatuur 1 uur of 4 °C reageren.
  4. Verwijder na de reacties bijproducten, overtollige kleurstof en zouten door P2-ontzoutingsgelfiltratie. Verdun het reactiemengsel met H2O tot een totaal volume van 300 μL, wat geschikt is voor de volgende HPLC-zuiveringsstap. Voeg 650 μL gehydrateerde P2-gel toe aan een centrifugaalapparaat en draai gedurende 1 minuut op 18.000 x g . Verwijder de vloeistof aan de onderkant van het apparaat, voeg het reactiemengsel toe aan de kolom met P2-gel, draai gedurende 1 minuut op 18.000 x g en verzamel het reactiemengsel aan de onderkant van het apparaat.
    OPMERKING: P2-gel moet ten minste 4 uur voor gebruik met H2O worden gehydrateerd.
  5. Zuiver het ontzoute reactiemengsel met HPLC met behulp van een C18-kolom die is bestemd voor oligonucleotidezuivering, met oplosmiddel A: 0,1 M TEAA in H2O en B: ACN als de mobiele fase voor een lineaire gradiëntre-elutie 10-100% B gedurende 50 minuten bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min. Injecteer het ontzoute reactiemengsel in omgekeerde fase HPLC met een injectielus van 500 μL voor zuivering. Verzamel het product met een absorptiepiek voor het DNA (260 nm) en een absorptiepiek voor de fluorofoor (560 nm voor Cy3B en 647 nm voor Atto647N) en droog ze 's nachts in een vacuümcentrifugaalconcentrator (zie figuur 2A).
  6. Reconstitueer het gedroogde oligokleurstofproduct in water van 100 μL. Bepaal de concentratie van de Cy3B-ligandstreng en de Atto647N-vergrendelingsstreng met de nanodrop-spectrofotometer. Zorg ervoor dat de kleurstofetiketteringsverhouding dicht bij 1:1 ligt. Corrigeer voor de 260 nm absorptie van de kleurstof indien nodig bij het bepalen van de oligonucleotideconcentratie.
  7. Valideer het gezuiverde product met MALDI-TOF-MS met 3-HPA als substraat in 50% ACN/H2O met 0,1% TFA en 5 mg/ml ammoniumcitraat met 0,5 μL van het product bij 1-5 μM voor MALDI-TOF-MS monstervoorbereiding. Een voorbeeld van een massaspectrum is te vinden in figuur 2B.
  8. Los de haarspeldstreng en de ankerstreng van de quencher op in water en zorg ervoor dat de concentratie van de stamoplossingen tussen 50 en 100 μM ligt.
    OPMERKING: De haarspeldstreng is ongewijzigd en kan rechtstreeks op maat worden gesynthetiseerd door een leverancier. De ankerstreng heeft een thiol-verankeringsgroep en een quencher BHQ2 en kan direct op maat worden gesynthetiseerd door een leverancier.
  9. Aliquot alle oligonucleotiden. Bewaar deze oligonucleotiden voor kortdurend gebruik en opslag bij 4 °C. Voor langdurige opslag, vries ze in en bewaar ze bij -20 °C. Op dit punt zijn alle oligonucleotiden klaar voor de DNA-spanningsondeassemblage.
    OPMERKING: Herhaalde vries-dooicycli zijn niet problematisch voor oligonucleotiden.

2. Oppervlaktevoorbereiding

OPMERKING: De voorbereiding van DNA-haarspeldspanningssondesubstraten duurt twee dagen. De DNA-haarspeldspanningsonde wordt gefunctionaliseerd op glazen dekplaten.

  1. Dag 1
    1. Plaats de 25 mm coverslips op een polytetrafluorethyleen rek in een bekerglas van 50 ml. Elk rek kan tot 8 coverslips bevatten. Spoel de afdekstroken af door drie keer onder te dompelen in water.
    2. Voeg 40 ml van een 1:1-oplossing (v:v) van ethanol gemengd met water toe aan het bekerglas met het rek en de dekzeilen en sluit het bekerglas af met een paraffinefilm.
    3. Soniceer het bekerglas gedurende 15 minuten in een ultrasone reiniger (werkfrequentie 35 KHz) om de afdekstroken te reinigen. Gooi na ultrasoonapparaat de vloeistof weg en spoel het bekerglas met het rek en dek het af met water minstens 6 keer om het resterende organische oplosmiddel te verwijderen.
    4. Bereid verse Piranha-oplossing door zwavelzuur en waterstofperoxide te mengen in de verhouding 3:1. Om 40 ml Piranha-oplossing te maken, voegt u eerst 30 ml zwavelzuur toe aan een schoon bekerglas van 50 ml en voegt u vervolgens langzaam 10 ml H 2 O2 toe. De Piranha-oplossing zal snel verwarmen en borrelen na toevoeging vande H 2 O2. Meng de piranha voorzichtig met behulp van het uiteinde van een glazen pipet.
    5. Breng vervolgens het rek met de dekslips over naar het bekerglas met een voorzichtig gemengde Piranha-oplossing voor etsen (figuur 3A). Laat de Piranha-oplossing hydroxyleren en reinig de coverslips gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng na het etsen van Piranha het rek met een stalen of polytetrafluorethyleenpincet over in een schoon bekerglas van 50 ml met water en spoel het opnieuw minstens 6 keer af met water.
      LET OP: Grote hoeveelheden organische stoffen kunnen krachtig reageren met piranha oplossing en kunnen explosie veroorzaken. Wees voorzichtig en werk altijd met Piranha-oplossing in een zuurkast. Zorg ervoor dat je een labjas, handschoenen en een veiligheidsbril draagt. Bewaar verse Piranha-oplossing nooit in een afgesloten container.
      OPMERKING: De verhouding waterstofperoxide tot zwavelzuur moet onder 1:2 (v:v) worden gehouden en mag nooit hoger zijn dan 1:1. Wanneer u het rek onderdompelt met afdekstroken in Piranha-oplossing, plaatst u ze langzaam en voorzichtig in de oplossing. Gooi de oplossing niet onmiddellijk na het etsen weg, omdat deze nog steeds actief en heet is. Laat het een nacht in het bekerglas liggen voordat je het in de zure afvalcontainer giet.
    6. Dompel het rek met de afdekzeilen onder in een bekerglas van 50 ml met 40 ml ethanol om water te verwijderen. Gooi de ethanol weg en herhaal dit 3 keer om er zeker van te zijn dat het water is verwijderd.
    7. Dompel het rek vervolgens onder in 3% aminopropyltriethoxysilaan (APTES) (v/v) in 40 ml ethanol om gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te reageren met de -OH op de afdekstroken (figuur 3B).
      OPMERKING: Ethanol kan worden vervangen door aceton.
    8. Spoel oppervlakken 6 keer door ze onder te dompelen in 40 ml ethanol en droog ze vervolgens gedurende 20 minuten in de oven op 80 °C. Bewaar na afkoeling de gedroogde amine-gemodificeerde coverslips bij -20 °C voor toekomstig gebruik (tot 6 maanden).
    9. Bedek de onderste binnenkant van plastic petrischalen met een diameter van 10 cm met paraffinefolie. De paraffinefilm voorkomt dat de afdekstroken in de petrischaal glijden en helpt de oplossing voor de volgende stappen van functionalisering op de dekstroken te houden. Plaats de afgekoelde amine-gemodificeerde coverslips in de petrischaaltjes. De te functionaliseren kant moet naar boven gericht zijn.
    10. Om de aminegroepen op de coverslips te wijzigen, voegt u 300 μL 0,5% m/v liponzuur PEG NHS (LA-PEG-SC) en 2,5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) in 0,1 M NaHCO3 toe aan elke coverslip en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (figuur 3C). Weeg voor elke 25 mm coverslip 1,5 mg LA-PEG-SC en 7,5 mg mPEG-SC af. Los de NHS-reagentia onmiddellijk op voordat u ze aan de oppervlakken toevoegt, omdat ze een korte halfwaardetijd (~ 10 min) hebben in een waterige oplossing bij kamertemperatuur. Spoel na de reactie oppervlakken 3 keer af met water.
      OPMERKING: De NHS-reactie kan 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd. NHS-reagentia hebben een langere halfwaardetijd vóór hydrolyse bij 4 ° C, wat ongeveer 4-6 uur is. Dit zal resulteren in een driedaagse oppervlaktevoorbereidingsprocedure.
    11. Voeg 100 μL 0,1 M NaHCO3 met 1 mg/ml sulfo-NHS-acetaat toe aan een set "sandwich" coverslips (twee coverslips naar elkaar gericht met reactiebuffer ertussen). Laat passivering minstens 30 minuten plaatsvinden. Om reagens te besparen, kan deze stap worden uitgevoerd met 50 μL van 1 mg / ml sulfo-NHS-acetaat. Spoel na passivering drie keer af met water.
    12. Voeg 0,5 ml gouden nanodeeltjes (AuNP, 8,8 nm, looizuur, 0,05 mg / ml) toe aan elke coverslip en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (figuur 3D). Om het reagens te besparen, kan deze stap worden uitgevoerd door ook twee coverslips te sandwichen. Zorg ervoor dat er geen zouten aanwezig zijn in het systeem uit eerdere stappen om aggregatie van gouden nanodeeltjes te voorkomen. Laat de coverslips na deze stap niet drogen.
    13. Pre-hybridiseer ondertussen 4,7 pN-haarspeld, Cy3B-ligandstreng en BHQ2-ankerstreng die de DNA-spanningsondes vormen in een verhouding van 1,1: 1: 1 in 1 M NaCl bij 300 nM in een PCR-buis. Gloei de strengen door de oplossing gedurende 5 minuten tot 95 °C te verwarmen en koel vervolgens geleidelijk af door de temperatuur gedurende 30 minuten in een thermische cyclus te verlagen tot 20 °C.
    14. Spoel de coverslips drie keer af met water na 30 minuten incubatie met gouden nanodeeltjes. Voeg extra BHQ2-ankerstreng (van 100 μM-voorraad) toe aan de gegloeide DNA-oplossing om de verhouding tussen BHQ2-ankerstreng en Cy3B-ligandstreng 10:1 te maken. Op dit punt moet de DNA-oplossing 300 nM spanningsondeconstructie en 2,7 μM BHQ2-streng bevatten. Voeg 100 μL per twee coverslips toe om de "sandwich" te maken (figuur 3E).
    15. Plaats voorzichtig een natte labtissuebal in de petrischaal (uit de buurt van afdekplaten) en sluit de schaal af met paraffinefilm om te voorkomen dat de oplossing opdroogt. Bedek de schaal met folie en incubeer een nacht bij 4 °C.
  2. Dag 2
    1. Was de overtollige sondes van de coverslips af met 1x PBS. Controleer de kwaliteit van het oppervlak van de DNA-spanningsonde onder een epifluorescentiemicroscoop.
    2. Bereid 40 μg/ml streptavidin in 1x PBS en incubeer gedurende 30 minuten op dekbedden bij kamertemperatuur (figuur 3F). Meestal is 100 μL voldoende voor een 25 mm coverslip. Spoel na incubatie 3 keer met PBS om de overtollige hoeveelheid streptavidin weg te spoelen.
    3. Bereid 40 μg/ml gebiotinyleerd antilichaam/ligand in 1x PBS. Voeg 50-100 μL per sandwich toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (figuur 3G). Spoel na incubatie driemaal met PBS om de overtollige hoeveelheid gebiotinyleerd antilichaam/ligand weg te spoelen.
    4. Monteer de schone beeldvormingskamers met oppervlakken zorgvuldig. Oppervlakken kunnen gemakkelijk worden gebarsten bij het aanspannen van de kamers. Voeg 0,5-1 ml van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan de beeldvormingskamers en houd ze klaar voor beeldvorming met cellen (figuur 3H).

3. Beeldvorming van celreceptorkrachten

  1. Bereid immuuncellen van belang voor HBSS voor op 1-2 x 106 cellen / ml.
    OPMERKING: OT-1 CD8+ naïeve cellen worden in dit artikel als voorbeeld gebruikt. Zuiver OT-1 CD8+ naïeve T-cellen a uit de milt van geofferde muizen met behulp van de MACS-muis CD8+ T-celisolatiekit met een MACS-separator volgens de instructies van de fabrikant. Isoleer en verrijk de CD8+ T-cellen door alle niet-CD8+ T-cellen te verwijderen waaraan magnetische uitputtende antilichaamcocktails zijn gebonden. Resuspendeerde gezuiverde OT-1 CD8+ naïeve T-cellen in HBSS bij 2 x 106 cellen/ml en voor gebruik op ijs houden.
  2. Controleer de kwaliteit van het oppervlak van de DNA-haarspeldspanningsonde onder een fluorescentiemicroscoop (100x objectief) voor kwaliteitscontrole voordat u liganden of platingcellen toevoegt. Beeld en kwantificeer de gemiddelde achtergrondintensiteit in het Cy3B-kanaal van een DNA-haarspeldspanningssondeoppervlak vanuit ten minste 5 verschillende posities en 3 replicaties. Houd de beeldacquisitiecondities consistent, zodat deze waarde kan worden gebruikt als een betrouwbare marker voor oppervlaktekwaliteit en sondedichtheid (figuur 4C).
    OPMERKING: Kwantificeer het aantal DNA-strengen per gouden nanodeeltje en het aantal gouden nanodeeltjes per μm2 de eerste paar keer van oppervlaktevoorbereiding volgens literatuur12, die kan worden gebruikt als een andere betrouwbare marker van oppervlaktekwaliteit.
  3. Plaat ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 cellen op elke DNA-spanningsonde gefunctionaliseerde coverslip en laat ze hechten en verspreiden gedurende ~ 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Terwijl cellen op de DNA-haarspeldspanningsondes worden geplaatst en zich beginnen te verspreiden, beeldt u de fluorescentiesignalen in die worden gegenereerd in het Cy3B-kanaal met het 100x-objectief (figuur 3I).
  5. Nadat cellen beginnen met het produceren van real-time spanningssignaal op het DNA-haarspeldspanningssondeoppervlak in het Cy3B-kanaal, verkrijgen beelden in zowel Cy3B- als Atto647N-kanalen (TIRF-microscopie geeft een betere signaal-ruisverhouding dan epifluorescentie). Voeg vervolgens de Atto647N-streng toe aan de beeldvormingskamers met een eindconcentratie van 200 nM voor mechanisch selectieve hybridisatie.
  6. Verwijder na 10 minuten incubatie snel en voorzichtig de buffer met de fluorescerende Atto647N-vergrendelingsstreng en vervang deze door verse Hank's gebalanceerde zouten. Beeld in zowel Cy3B- als Atto647N-kanalen opnieuw en bepaal de correlatiecoëfficiënt van Pearson met Fiji-software15.
  7. Introduceer op het tijdstip van belang voor het onderzoek niet-fluorescerende vergrendelingsstreng in de cellen in de beeldvormingskamer om het spanningssignaal op te slaan. Bereid de bouillon van de vergrendelingsstreng (100 μM) voor en voeg deze toe aan de cellen in een eindconcentratie van 1 μM. Pipeteer voorzichtig om te mengen. De duur van het vergrendelen kan variëren, maar 10 minuten is de aanbevolen tijd.
  8. Verkrijg time-lapse-films of eindpuntbeelden in epifluorescentie voor zowel kwalitatieve spanningskartering als kwantitatieve analyse indien nodig (figuur 3J en figuur 5).
    OPMERKING: Als spanningsmeting op meerdere tijdstippen gewenst is, start dan het wissen van opgeslagen spanningssignalen door de toevoeging van een ontgrendelingsstreng. Om overmatig spoelen te voorkomen, wordt een hogere eindconcentratie van de ontgrendelingsstreng bij 2 μM gebruikt om gedurende 3 minuten een door de teenklem gemedieerde strengverplaatsingsreactie met de vergrendelingsstreng te initiëren, waardoor de opgeslagen signalen worden gewist (figuur 3J). Spoel de overtollige oligonucleotiden voorzichtig af met HBSS. De DNA-haarspeldspanningsonde en de cellen zijn klaar voor een nieuwe ronde van spanningsopslag en mapping. Het ontsluiten van spanningssignalen is niet nodig als slechts één tijdspunt van belang is in het onderzoek.

4. Data-analyse

OPMERKING: Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van Fiji-software en de kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd met behulp van analysesoftware.

  1. Corrigeer eventuele drift tijdens beeldacquisitie met de opdracht Correct 3D drift in Registratie onder het menu Plug-ins .
  2. Verwijder de camera-achtergrond van de afbeelding met de opdracht Aftrekken in het menu Proces .
  3. Bepaal de correlatiecoëfficiënt van Pearson met de functie Colocalisatie onder het menu Analyseren .
  4. Gemiddelde en trek de fluorescentieachtergrond af die wordt geproduceerd door de ongeopende sondes uit drie verschillende lokale achtergrondregio's. Teken ROI's van cellen op afbeeldingen die op de achtergrond zijn afgetrokken of op RICM-afbeeldingen (reflectie-interferentiecontrastmicroscopie) met het gereedschap Selecties uit de vrije hand van afbeelding J. Meet elke metriek van belang van de ROI's, bijvoorbeeld geïntegreerde fluorescentie-intensiteit en spanningsbezetting met behulp van het gereedschap Meten onder het menu Analyseren (afbeelding 6).
  5. Exporteer de metingen voor kwantitatieve analyse met analysesoftware.
  6. Plot de gegevens met elke analysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier tonen we representatieve beelden van oppervlaktekwaliteitscontrole (figuur 4). Een oppervlak van hoge kwaliteit moet een schone achtergrond hebben in het RICM-kanaal (figuur 4B) en een uniforme fluorescentie-intensiteit in het Cy3B-kanaal (figuur 4C). Met dezelfde beeldvormingsapparatuur en identieke fluorescentiebeeldvormingsverwervingsomstandigheden moet de achtergrondfluorescentie-intensiteit elke keer consistent en reproduc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met de gedetailleerde procedures die hier worden gegeven, kan men DNA-haarspeldspanningsondesubstraten voorbereiden om de receptorspanning geproduceerd door immuuncellen in kaart te brengen en te kwantificeren. Wanneer cellen op het substraat van de DNA-haarspeldspanningsonde worden geplaatst, landen, hechten en verspreiden ze zich terwijl de receptoren de liganden zowel chemisch als mechanisch waarnemen, waarvan de laatste wordt gedetecteerd door onze sondes. In sommige gevallen kunnen cellen zich echter niet verspreide...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 en NSF CAREER 1350829. We danken de NIH Tetramer Facility voor pMHC-liganden. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Emory Comprehensive Glycomics Core.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)Sigma56197maldi-TOF-MS matrix
 mPEG-SCBiochempegMF001023-2Koppervlaktevoorbereiding
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneAcrosAC430941000oppervlaktevoorbereiding
10x Red blood cell lysis bufferBiolegend00-4333-57buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acidNanocomposixcustomized orderoppervlaktevoorbereiding
Atto647N NHS esterSigma18373-1MG-Ffluorofoor, oligo voorbereiding
Attofluor Cell Chamber, for microscopyThermo Fisher ScientificA7816beeldvorming
BD Syringes only with Luer-LokBD bioscience309657cellen
biotinylated anti-mouse CD3eebioscience13-0031-82antilichaam/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)NIH Tetramer Core Facility at Emory UniversityNAantilichaam/ligand
bovine serum albuminSigma735078001blokkeer niet-specifieke interacties
Cell strainersBiologix15-1100cellen
Coverslip Mini-Rack, teflonThermo Fisher ScientificC14784oppervlaktevoorbereiding
Cy3B NHS esterGE HealthcarePA63101fluorofoor, oligo voorbereiding
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CMbuffer
ethanolSigma459836oppervlaktevoorbereiding
Hank’s balanced salts (HBSS)SigmaH8264buffer
hydrogen peroxideSigmaH1009oppervlaktevoorbereiding
LA-PEG-SCBiochempegHE039023-3.4Koppervlaktevoorbereiding
Midi MACS (LS) startup kitMiltenyi Biotec130-042-301cellen
mouse CD8+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec130-104-075cellen
Nanosep MF centrifugal devicesPall laboratoryODM02C35oligo voorbereiding
No. 2 round glass coverslipsVWR48382-085oppervlaktevoorbereiding
NTA-SAMDojindo Molecular TechnologiesN475-10oppervlaktevoorbereiding
P2 gelBio-rad1504118oligo voorbereiding
sufuric acidEMD Millipore CorporationSX1244-6oppervlaktevoorbereiding
Sulfo-NHS acetateThermo Fisher Scientific26777oppervlaktevoorbereiding
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm653950-702oligonucleotide voorbereiding
Barnstead Nanopure water purifying systemThermo Fisherwater
CFI Apo 100× NA 1.49 objectiveNikonMicroscopie
Cy5 cubeCHROMAMicroscopie
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)PhotometricsMicroscopie
High-performance liquid chromatographyAgilent 1100oligonucleotide voorbereiding
Intensilight epifluorescence sourceNikonMicroscopie
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)Voyager STRoligonucleotide voorbereiding
Nanodrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisheroligonucleotide voorbereiding
Nikon Eclipse Ti inverted microscopeNikonMicroscopie
Nikon Perfect Focus SystemNikonMicroscopie
NIS Elements softwareNikonMicroscopie
quad band TIRF 405/488/561/647 cubeCHROMAMicroscopie
RICM cubeCHROMAMicroscopie
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nmCoherentMicroscopie
TRITC cubeCHROMAMicroscopie
oligo naam5' modificatie / 3' modificatiesequentie (5' naar 3')Gebruik
15mer amine locking strand5' modificatie: geen modificatie
3' modificatie: /3AmMO/		AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TAlocking real-time spanningssignaal
15mer Atto647N locking strand5' modificatie: Atto647N
3' modificatie: /3AmMO/		AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TAlocking real-time spanningssignaal
15mer non-fluorescente locking strand5' modificatie: geen modificatie
3' modificatie: geen modificatie		A AAA AAC ATT TAT AClocking real-time spanningssignaal voor kwantitatieve analyse
4.7 pN hairpin strand5' modificatie: geen modificatie
3' modificatie: geen modificatie		GTGAAATACCGCACAGATGCGT
TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT
ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC
CAGC		hairpin sonde
amine ligand strand5' modificatie: /5AmMC6/
3' modificatie: /3Bio/		CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTThairpin sonde
BHQ2 anker strand5' modificatie: /5ThiolMC6-D/
3' modificatie: /3BHQ_2/		TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCT

Referenties

  1. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
  2. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
  4. Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
  5. Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
  6. Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
  7. Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961(2019).
  8. Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
  9. Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  10. Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
  11. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167(2014).
  12. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  13. Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
  14. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
  15. Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
  16. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  17. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
  18. Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Moleculaire spanningssensorenimmuuncelkrachtenmechanotransductiefluorescentiemicroscopiehairpin lockinggoudnanodeeltjesTCR peptide MHCepifluorescentie-imagingtransiënte mechanische krachten
DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.