Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Samenvatting

Leverfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd, en de sterfte aan chronische leverziekte neemt sterk toe in de Verenigde Staten. Gezonde levers zijn in staat om te regenereren van toxische schade, maar bij gevorderde leverziekte is het natuurlijke vermogen van de lever om te regenereren aangetast. Zebravissen zijn ontstaan als een krachtig experimenteel systeem voor het bestuderen van regeneratie. Ze zijn een ideaal model voor het bestuderen van leverregeneratie van gedeeltelijke hepatectomie, een procedure met directe klinische relevantie waarbij een deel van de lever chirurgisch wordt verwijderd, waardoor de rest intact blijft. Er is geen standaardprotocol voor gedeeltelijke hepatectomie; eerdere studies met dit model hebben iets verschillende protocollen gebruikt en ongelijksoortige resultaten gerapporteerd. Hier beschreven is een efficiënt, reproduceerbaar protocol voor het uitvoeren van een gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen. We gebruiken deze techniek om aan te tonen dat zebravissen in staat zijn tot epimorfe regeneratie van de gereseceerde kwab. Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen die nodig zijn voor leverregeneratie bij zebravissen verder te ondervragen.

Inleiding

Onder de vaste organen bij mensen is de lever het enige orgaan dat in staat is tot regeneratie¹. Dit is van cruciaal belang, omdat de lever een essentieel orgaan is, verantwoordelijk voor belangrijke metabolische functies, energieopslag, bloedontgifting, afscheiding van plasma-eiwitten en galproductie². Hepatocyten die verloren gaan als gevolg van toxische of inflammatoire schade worden voornamelijk vervangen door deling van de resterende hepatocyten¹. Een klassiek experimenteel model voor het bestuderen van leverregeneratie is gedeeltelijke hepatectomie, waarbij individuele kwabben van de lever worden verwijderd, waardoor de resterende kwabben intact blijven³. Deze procedure werd aanvankelijk ontwikkeld bij ratten, waarbij ongeveer tweederde van de levermassa wordt verwijderd. Na gedeeltelijke hepatectomie bij zoogdieren vindt compenserende regeneratie plaats in de resterende kwabben totdat de lever zijn oorspronkelijke massa herstelt. Met name de zoogdierlever vervangt de ontbrekende kwabben niet.

Zebravis (Danio rerio) vertegenwoordigt een tracteerbaar model voor het bestuderen van volwassen orgaanregeneratie⁴. De zebravislever, hoewel structureel verschillend van de zoogdierlever, bestaat uit dezelfde celtypen en vervult dezelfde functie als bij zoogdieren². Het bestaat uit drie lobben, met twee dorsale lobben en een enkele ventrale kwab die langs de darm zijn afgeplat. Gedeeltelijke hepatectomie is eerder uitgevoerd bij zebravissen, met tegenstrijdige rekeningen over de precieze wijze van regeneratie. Meestal wordt een derde gedeeltelijke hepatectomie uitgevoerd door verwijdering van de hele ventrale kwab. Eerste rapporten gaven aan dat na verwijdering van de ventrale kwab, het volledig werd geregenereerd binnen een week^5,6,7, wat suggereert dat in tegenstelling tot de zoogdierlever, de zebravislever in staat is tot epimorfe regeneratie. Latere studies toonden aan dat verwijdering van de ventrale kwab resulteerde in compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, in plaats van de regeneratie van de ontbrekende ventrale kwab, en uiteindelijk het herstel van levermassa binnen een week^8,9. Transcriptomische profilering van de dorsale kwabben na resectie van de ventrale kwab bracht significante veranderingen aan het licht die verband houden met compenserende regeneratie¹⁰. Gezien het feit dat de wijze van leverregeneratie kan variëren met de omvang van de verwonding⁸, speculeerden we dat de verschillen in resultaten te wijten kunnen zijn aan technische variatie in het partiële hepatectomieprotocol tussen onderzoeksgroepen.

Dit protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van een derde gedeeltelijke hepatectomie op volwassen zebravissen door het verwijderen van de ventrale kwab. Deze techniek zal waardevol zijn voor het beoordelen van mechanismen van leverregeneratie.

Protocol

Zebravissen werden gefokt volgens standaardprocedures. Experimenten werden goedgekeurd door het Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Volwassen zebravissen werden 24 uur gevast voor het begin van het protocol. Systeemwater verwijst naar het water in zebravishuistanks in de aquatische faciliteit.

1. Voorbereiding en anesthesie

1. Bereid 0,016% Tricaine-oplossing in systeemwater.
   LET OP: Tricaine is irriterend als het in contact komt met de ogen, huid of luchtwegen.
2. Bereid een spons voor om verdoofde zebravissen vast te houden tijdens het dissectieprotocol. Snijd een volle spons in vieren. Verwijder met een scheermesje een dun sponswigje dat parallel loopt aan de lange as van het sponskwart.
   1. De spleet moet lang genoeg zijn voor een volwassen vis (dit zal variëren tussen verschillende groottes van vissen). Voor een volwassen vis met een lengte van 35 mm moet de lengte van de spleet bijvoorbeeld 20 mm zijn. Het hoofd en het lichaam worden goed vastgehouden in de spons, maar de staart loopt langs de rand van de spons (Figuur 1B).
3. Week de spons in 0,016% Tricaine-oplossing.
4. Plaats volwassen zebravissen (mannelijk of vrouwelijk) in 625 ml 0,016% Tricaine-oplossing.
5. Incubeer gedurende 6 minuten of totdat de vis niet reageert om aan te raken.
6. Verwijder met een tang de vis voorzichtig uit de Tricainetank en plaats de visventerale kant omhoog in de groef van de spons (afbeelding 1A - B).
7. Plaats de spons onder een ontleedmicroscoop met top-down verlichting.

2. Chirurgie

1. Knijp met behulp van een fijne tang de huid en schubben mediair, net achter het hart (figuur 1B).
2. Maak met een veerbelaste schaar een snede onder de tang om een gat in de lichaamsholte te maken (figuur 1C - D). Zorg ervoor dat u het hart of een groot bloedvat niet verwondt, omdat dit zal leiden tot verhoogde mortaliteit.
3. Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie van 3-4 mm langs de buik, die posterieure verwerking tot de incisie bij de bekkenvinnen aankomt (Figuur 1D - E). Op dit punt kan de ventrale kwab van de lever zichtbaar zijn door de incisie.
4. Knijp met één hand in de zijkanten van de spons om de viscerale organen uit de lichaamsholte te dwingen. De ventrale kwab van de lever zal zichtbaar zijn op de top van de darm (Figuren 1F,2A-B). De lever zal verschijnen als een roze of oranje structuur verspreid over de goudbruine darm. Dieren die zijn aangewezen als schijncontroles worden op dit punt teruggevonden.
5. Knijp in de fijne tang zodat de twee tanden elkaar raken. Terwijl u druk op de spons houdt, schuift u de tanden van de fijne tang tussen de lever en de darm (figuur 1G). Zorg ervoor dat u de darm niet doorboort, omdat dit zal leiden tot verhoogde mortaliteit.
6. Ontspan langzaam de druk op de tang, zodat de tanden van elkaar af bewegen (figuur 1H). Deze glijdende werking doorbreekt de talrijke poortaderaanhechtingen tussen de ventrale kwab en de darm (figuur 2B), en is noodzakelijk om de ventrale kwab netjes te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle portalverbindingen tussen de lever en darm zijn verbroken.
7. Pel de ventrale kwab terug uit de darm met behulp van een fijne tang en snijd de ventrale kwab vrij van de rest van de lever (figuur 1I).
8. Deze procedure resulteert in een derde gedeeltelijke hepatectomie (figuur 1J).

3. Herstel

1. Verwijder de vis voorzichtig uit de spons en plaats deze in een tank met systeemwater.
2. Pipetsysteem water over de kieuwen gedurende een paar minuten totdat de vis op zichzelf zwemt (Figuur 1K).
3. Houd de vis 2-4 uur in de gaten voordat u ze weer op het systeem plaatst. Voer de vis na de operatie niet gedurende 24 uur.
4. Controleer vis dagelijks gedurende de duur van het experiment.
5. Na verloop van tijd zal de incisie in de lichaamswand op natuurlijke wijze genezen zonder dat hechtingen nodig zijn(figuur 1L,2C).

4. Ventrale kwab tot darmlengte analyse

1. Euthanaseer alle dieren die bestemd zijn voor analyse in ijswater gedurende 10 minuten totdat alle operculaire bewegingen stoppen.
2. Haal de vis uit het ijswater en plaats hem ventrale kant omhoog in de groef van een spons.
3. Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie in de ventrale lichaamswand in de voorste-achterste positie van het hart. Maak dan nog twee incisies die langs de voorste-achterste as lopen vanaf de eerste incisie helemaal tot aan de bekkenvinnen. (Figuur 2A).
4. Pel de huid en spieren terug om de viscerale organen te onthullen (figuur 2A).
5. Verkrijg heldere veld- en fluorescerende beelden van de viscerale organen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. Dit gezichtsveld omvat het gebied waar de ventrale kwab werd gereseceerd. Omdat dieren vóór de analyse worden geëuthanaseerd, sluit dit soort analyse langdurige beeldvorming van dezelfde vis uit.

5. Analyse van de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht

1. Euthanaseer alle dieren die bestemd zijn voor analyse in ijswater gedurende 10 minuten totdat alle operculaire bewegingen stoppen.
2. Plaats vis in een conische buis van 50 ml.
3. Voeg 25 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS en 0,3% Tween toe aan de buis.
   LET OP: Formaldehyde is giftig en oplossingen die formaldehyde bevatten, moeten altijd in een chemische kap worden verwerkt.
4. Nutate gedurende 48 uur bij 4 °C.
5. Voer vier wasbeurten van 10 minuten uit in 1x PBS en 0,3% Tween.
6. Haal vis met tang en vlek droog op een papieren handdoek.
7. Noteer het gewicht van de hele vis.
8. Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie in de ventrale lichaamswand in de voorste-achterste positie van het hart. Maak vervolgens nog twee incisies die langs de voorste-achterste as lopen vanaf de eerste incisie helemaal tot aan de bekkenvinnen. (Figuur 2A).
9. Pel de huid en spieren terug om de viscerale organen te onthullen (figuur 2A).
10. Verkrijg heldere veldbeelden van de lever met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
11. Ontleed de lever en plaats de stukjes lever op een weegboot.
12. Noteer het gewicht van de lever.

Resultaten

Om het regeneratieve potentieel van de volwassen zebravislever te onderzoeken, voerden we gedeeltelijke hepatectomie (PHX) uit bij volwassen zebravissen. Over het algemeen werden grote volwassenen (30-40 mm lang) geselecteerd, variërend van 1,5-2,5 jaar oud. Binnen individuele experimenten werden dieren uit dezelfde tank geselecteerd en waren ze qua leeftijd en grootte op elkaar afgestemd. Als een geschikte controle maakten we gebruik van schijnoperaties waarbij het dier zowel verdoofd was als een grote incisie kreeg in ...

Discussie

De anatomische verschillen tussen zebravissen en zoogdiermodellen voor leverregeneratie vormen unieke uitdagingen voor leverresectie. De lever bij zebravissen bevindt zich in de nabijheid van het hart en de darm; onbedoeld beschadigen van beide organen leidt tot verhoogde mortaliteit. De zebravislever is niet ingekapseld, waardoor het moeilijker is om van de darm te scheiden. De lever ontvangt voedingsrijk bloed uit de darm via poortaders. Bij zoogdieren komen aders die de darm verlaten samen op een primaire poortader di...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500