Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

Summary

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Abstract

Dit werk presenteert een nieuw, kosteneffectief en betrouwbaar microfluïdisch platform met het potentieel om complexe meerlagige weefsels te genereren. Als proof of concept is een vereenvoudigde en ongedifferentieerde menselijke huid gemodelleerd met een dermale (stromale) en een epidermale (epitheliale) compartiment. Om dit te bereiken, is een veelzijdig en robuust, op vinyl gebaseerd apparaat ontwikkeld, verdeeld in twee kamers, waarbij enkele van de nadelen van microfluïdische apparaten op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor biomedische toepassingen, zoals het gebruik van dure en gespecialiseerde apparatuur of de absorptie van kleine, hydrofobe moleculen en eiwitten, worden overwonnen. Bovendien werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van parallelle stroming, die de in situ depositie van zowel de huid- als epidermale compartimenten mogelijk maakt. Het huidconstruct bestaat uit een fibrinematrix met menselijke primaire fibroblasten en een monolaag van onsterfelijke keratinocyten die bovenop zijn gezaaid, die vervolgens wordt onderhouden onder dynamische kweekomstandigheden. Dit nieuwe microfluïdische platform opent de mogelijkheid om menselijke huidziekten te modelleren en de methode te extrapoleren om andere complexe weefsels te genereren.

Introduction

Onlangs is vooruitgang geboekt in de richting van de ontwikkeling en productie van in vitro menselijke huidmodellen voor de analyse van de toxiciteit van cosmetische en farmaceutische producten¹. Onderzoekers in de farmaceutische en huidverzorgingsindustrie hebben dieren gebruikt, muizen zijn de meest voorkomende, om hun producten te testen^2,3,4,5. Het testen van producten op dieren is echter niet altijd voorspellend voor de respons bij mensen, wat vaak leidt tot falen van geneesmiddelen of nadelige effecten ....

Protocol

1. Chipontwerp en microbewerkingsparameters

1. Ontwerp de microfluïdische chiplagen met FreeCAD open-source ontwerpsoftware; zie tabel 1 voor de afmetingen van de kanalen. Neem vier gaten met een diameter van 2,54 mm op in het ontwerp om een op maat gemaakte aligner te gebruiken voor een juiste laagsuperpositie.

	Lengte (μm)	Breedte (μm)
Tweede kamer	28,400	800
Bovenkamer	31,000	800

Results

De ontworpen chip bestaat uit twee vloeibare kamers gescheiden door een 5 μm poriegrootte PC-membraan dat de groei van de cel mogelijk maakt door de doorgang van groeibevorderende moleculen uit de onderste kamer mogelijk te maken. De bovenste kamer bevat het weefselconstruct, in dit geval een monolaag van hKCs op een fibrinehydrogel die hFBs bevat.

De hoogte van de kanalen wordt bepaald door het aantal lijmplaten dat aan elk kanaal wordt toegevoegd. De onderste kamer bestaat uit 4 lagen (380 μ.......

Discussion

De motivatie om deze methode te ontwikkelen was de wens om huidziekten te modelleren en de effecten van nieuwe en innovatieve therapieën te bestuderen in een high-throughput platform. Tot op heden produceert dit laboratorium deze dermo-epidermale equivalenten door handmatig of met behulp van de 3D-bioprinttechnologie de fibrinegel met fibroblasten in een celkweekinbrengplaat te gieten en de keratinocyten er bovenop te zaaien. Zodra de keratinocyten samenvloeiing bereiken, wordt de 3D-cultuur blootgesteld aan de lucht-vlo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID