Methodenartikel

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

DOI:

10.3791/62353

⸱

17 mei 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk presenteert een nieuw, kosteneffectief en betrouwbaar microfluïdisch platform met het potentieel om complexe meerlagige weefsels te genereren. Als proof of concept is een vereenvoudigde en ongedifferentieerde menselijke huid gemodelleerd met een dermale (stromale) en een epidermale (epitheliale) compartiment. Om dit te bereiken, is een veelzijdig en robuust, op vinyl gebaseerd apparaat ontwikkeld, verdeeld in twee kamers, waarbij enkele van de nadelen van microfluïdische apparaten op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor biomedische toepassingen, zoals het gebruik van dure en gespecialiseerde apparatuur of de absorptie van kleine, hydrofobe moleculen en eiwitten, worden overwonnen. Bovendien werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van parallelle stroming, die de in situ depositie van zowel de huid- als epidermale compartimenten mogelijk maakt. Het huidconstruct bestaat uit een fibrinematrix met menselijke primaire fibroblasten en een monolaag van onsterfelijke keratinocyten die bovenop zijn gezaaid, die vervolgens wordt onderhouden onder dynamische kweekomstandigheden. Dit nieuwe microfluïdische platform opent de mogelijkheid om menselijke huidziekten te modelleren en de methode te extrapoleren om andere complexe weefsels te genereren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlangs is vooruitgang geboekt in de richting van de ontwikkeling en productie van in vitro menselijke huidmodellen voor de analyse van de toxiciteit van cosmetische en farmaceutische producten1. Onderzoekers in de farmaceutische en huidverzorgingsindustrie hebben dieren gebruikt, muizen zijn de meest voorkomende, om hun producten te testen2,3,4,5. Het testen van producten op dieren is echter niet altijd voorspellend voor de respons bij mensen, wat vaak leidt tot falen van geneesmiddelen of nadelige effecten ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chipontwerp en microbewerkingsparameters

  1. Ontwerp de microfluïdische chiplagen met FreeCAD open-source ontwerpsoftware; zie tabel 1 voor de afmetingen van de kanalen. Neem vier gaten met een diameter van 2,54 mm op in het ontwerp om een op maat gemaakte aligner te gebruiken voor een juiste laagsuperpositie.
Lengte (μm)Breedte (μm)
Tweede kamer28,400800
Bovenkamer31,000800

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontworpen chip bestaat uit twee vloeibare kamers gescheiden door een 5 μm poriegrootte PC-membraan dat de groei van de cel mogelijk maakt door de doorgang van groeibevorderende moleculen uit de onderste kamer mogelijk te maken. De bovenste kamer bevat het weefselconstruct, in dit geval een monolaag van hKCs op een fibrinehydrogel die hFBs bevat.

De hoogte van de kanalen wordt bepaald door het aantal lijmplaten dat aan elk kanaal wordt toegevoegd. De onderste kamer bestaat uit 4 lagen (380 μ.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De motivatie om deze methode te ontwikkelen was de wens om huidziekten te modelleren en de effecten van nieuwe en innovatieve therapieën te bestuderen in een high-throughput platform. Tot op heden produceert dit laboratorium deze dermo-epidermale equivalenten door handmatig of met behulp van de 3D-bioprinttechnologie de fibrinegel met fibroblasten in een celkweekinbrengplaat te gieten en de keratinocyten er bovenop te zaaien. Zodra de keratinocyten samenvloeiing bereiken, wordt de 3D-cultuur blootgesteld aan de lucht-vlo.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán en Juan Francisco Rodríguez oprecht voor zeer nuttige suggesties, discussies en/of voorlopige gegevens. We bedanken ook de bijdragen van Sergio Férnandez, Pedro Herreros en Lara Stolzenburg aan dit project. Speciale dank gaat uit naar Dr. Marta García voor GFP-gelabelde hFBs en hKCs. Tot slot erkennen we de uitstekende technische assistentie van Guillermo Vizcaíno en Angélica Corral. Dit werk werd ondersteund door het "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dit werk werd ook ondersteund door het "Programa de ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AmchafibrinRottafarmTranexamzuur
Antibioticum/antimycoticumThermo Scientific HyClone
CalciumchlorideSigma Aldrich
KweekplatenFisher
DMEMInvitrogen Life Technologies
Dubbelzijdig plakband vynilATP Adhesive SystemsGM 107CC, 12 µm dik
RandplotterBrotherScanncut CM900
FBSThermo Scientific HyClone
FibrinogeenSigma AldrichGeëxtraheerd uit menselijk plasma
Glazend diaThermo Scientific
GFP-Menselijke dermale fibroblasten-Primair. Cadeau van Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT-cellijnATCCGeïmmortaliseerde keratinocyten. Cadeau van Dr. Marta García
Live/dead-kitInvitrogen
PBSSigma Aldrich
PolycarbonaatmembraanMerk TM5 µm poriegrootte
PolydimethylsiloxaanDow CorningSylgard 184
NatriumchlorideSigma Aldrich
SpuitenTerumo5 mL
TrombineSigma Aldrich10 NIH/fles
Transparant kleefvinylMactacJT 8500 CG-RT, 95 µm dik
Trypsine/EDTASigma Aldrich
BuizenIDEXTeflon, 1/16” OD, 0.020” ID

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vinyl microfluidicaparallelstroommethodedermaal compartimentepideraal compartimentfibrinematrixhumane primaire fibroblastenkeratinocytenmonolaag

Gerelateerde artikelen