Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving

Summary

De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.

Abstract

Cryogene elektronentomografie (cryoET) is een krachtige methode om de 3D-structuur van biologische monsters in een bijna-inheemse staat te bestuderen. De huidige state-of-the-art cryoET in combinatie met subtomogram middelingsanalyse maakt de hoge resolutie structurele bepaling van macromoleculaire complexen mogelijk die in meerdere kopieën aanwezig zijn binnen tomografische reconstructies. Tomografische experimenten vereisen meestal een enorme hoeveelheid kantelreeksen die moeten worden verkregen door middel van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscopen met belangrijke operationele bedrijfskosten. Hoewel de doorvoer en betrouwbaarheid van geautomatiseerde gegevensverwervingsroutines de afgelopen jaren voortdurend zijn verbeterd, kan het proces van het selecteren van interessegebieden waarbij een kantelreeks wordt verkregen niet gemakkelijk worden geautomatiseerd en is het nog steeds afhankelijk van de handmatige invoer van de gebruiker. Daarom is het opzetten van een grootschalige dataverzamelingssessie een tijdrovende procedure die de resterende microscooptijd die beschikbaar is voor het verkrijgen van tilt-series aanzienlijk kan verkorten. Hier beschrijft het protocol de recent ontwikkelde implementaties op basis van het SerialEM-pakket en de PyEM-software die de tijdefficiëntie van netscreening en grootschalige gegevensverzameling van tilt-series aanzienlijk verbeteren. Het gepresenteerde protocol illustreert hoe serialem-scriptfunctionaliteiten kunnen worden gebruikt om rastertoewijzing, rastervierkantmapping en het verkrijgen van kantelreeksen volledig te automatiseren. Bovendien beschrijft het protocol hoe PyEM kan worden gebruikt om extra acquisitiedoelen in de offline modus te selecteren nadat geautomatiseerde gegevensverzameling is gestart. Om dit protocol te illustreren, wordt de toepassing ervan in de context van high-end gegevensverzameling van Sars-Cov-2 tilt-serie beschreven. De gepresenteerde pijpleiding is bijzonder geschikt voor het maximaliseren van de tijdsefficiëntie van tomografie-experimenten die een zorgvuldige selectie van acquisitiedoelen vereisen en tegelijkertijd een grote hoeveelheid kantelreeksen die moeten worden verzameld.

Introduction

Cryogene elektronenmicroscopiemethoden (cryoEM) zijn gebaseerd op de beeldvorming van biologische monsters door middel van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) na hun snelle vitrificatie, een monstervoorbereidingsproces dat de moleculaire en cellulaire structuren van specimens in een dicht bij-inheemse en gehydrateerde toestand behoudt^1,2. In cryogene elektronentomografie (cryoET) wordt een 3D-model van het verglaasde monster bereikt door een aantal beelden te verkrijgen van dezelfde interesseregio uit verschillende oriëntaties, de zogenaamde kantelreeks, gevolgd door de computationele reconstructie van het tomografische volume³. Deze geavanceerde beeldvormingstechniek is uitgegroeid tot een krachtige methode voor het structurele onderzoek van biologische processen in de context van hun inheemse cellulaire omgevingen^4,5,6.

Naast de ultrastructurele analyse van het verglaasde monster kunnen reconstructies met hoge resolutie van macromoleculaire complexen die in meerdere kopieën binnen het tomografische volume aanwezig zijn, worden verkregen door subtomogrammiddeling⁵toe te passen. Deze reconstructiebenadering is gebaseerd op de iteratieve uitlijning en middeling van subvolumes die de structuur van belang bevatten en is gericht op het verhogen van de signaal-ruisverhouding en de oplossing van de definitieve reconstructie^7,8. Subtomogram middeling is afhankelijk van het verzamelen en verwerken van een grote hoeveelheid gegevens die vaak de aanschaf van honderden tilt-series vereist door middel van high-end TEMs met zware operationele bedrijfskosten.

Momenteel is de installatie van dergelijke geautomatiseerde cryoET-sessies een tijdrovend proces dat meestal afhankelijk is van de handmatige invoer van de gebruiker^9,10,11. Doelen worden meestal geïdentificeerd door visuele inspectie van het toegewezen raster en vervolgens ingesteld voor geautomatiseerde gegevensverzameling. De efficiëntie van de gebruiker bij het identificeren van acquisitiepunten wordt vaak beïnvloed door de aard van het monster, wat bijzonder uitdagend wordt bij het analyseren van gezuiverde macromoleculen met suboptimale concentratie of in het geval van zeldzame gebeurtenissen in drukke cellulaire omgevingen, wat het gebruik van correlatieve benaderingen impliceert¹². Bovendien vereisen de huidige werkstromen de verwerving van afbeeldingen tijdens de installatie bij verschillende vergrotingen die later zullen worden gebruikt voor nauwkeurige lokalisatie en centreren van het doel tijdens geautomatiseerde acquisitie^11,13,14. Deze uiterst nauwkeurige stappen voor het opnieuw uitlijnen zijn cruciaal voor toepassingen met een hoge resolutie, die vereisen dat de beeldvorming met een hoge vergroting wordt uitgevoerd en nauwkeurige centreerstappen vereisen om het interessegebied binnen het resulterende kleine gezichtsveld te behouden. In totaal worden enkele uren van elke gegevensverzamelingssessie vastgelegd voor deze tijdrovende procedure waarbij de TEM niet bezig is met de verwerving van tilt-serie. Afhankelijk van de hoeveelheid vereiste kantelreeksen kan de identificatie en opstelling van acquisitiepunten een aanzienlijke impact hebben op de microscooptijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens tijdens een cryoET-sessie.

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven op basis van het SerialEM-softwarepakket¹⁵ en de nieuwste versie de PyEM-software¹⁶ om rasters in kaart te brengen, rastervierkanten in kaart te brengen, doelen te selecteren en geautomatiseerde gegevensverzameling in te stellen voor grootschalige verzameling van kantelreeksen. Het belangrijkste concept van deze aanpak is om SerialEM te voorzien van computationeel gegenereerde afbeeldingen door PyEM voor elk acquisitie-item, virtuele kaarten genoemd, voor de nauwkeurige lokalisatie en centreering van het doel. Om daadwerkelijke acquisitietijd te verkrijgen, worden de selectie van de doelen en het maken van de virtuele kaarten offline uitgevoerd met behulp van een tweede dummy-exemplaar van SerialEM, waarbij het selectieproces van acquisitiedoelen wordt ontkoppeld van TEM-bewerkingen. Hoewel dit protocol niet gaat over het verhogen van de gegevenskwaliteit^13,17 of de snelheid van het verkrijgen van tilt-serie^18,19, is dit protocol voornamelijk gericht op strategieën om de tijdefficiëntie van grootschalige geautomatiseerde cryoET-sessies te optimaliseren. Daarom is de implementatie van het gepresenteerde protocol bedoeld voor die wetenschappers die cryoET-workflows voor gegevensverzameling opzetten die de opbrengst van geautomatiseerde gegevensverwerving willen maximaliseren door de beschikbare microscooptijd voor het verkrijgen van tilt-series te vergroten.

Protocol

Het hier beschreven protocol maakt deel uit van een uitgebreider document dat is geproduceerd door het EMBL CryoEM Service Platform met grondige stapsgewijze instructies en screenshots die de hele procedure van een typische cryoET-sessie illustreren, inclusief monsterbelasting, rastermapping, microscoopafstemming, installatie van acquisitiepunten en geautomatiseerde gegevensverzameling. Het volledige protocol is te downloaden via de volgende link: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Voorwaarden

1. Installeer SerialEM versie 3.8 en stel deze in om de microscoop en detector (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm) te bedienen.
2. Installeer een dummy-exemplaar van SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. Installeer PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Rastertoewijzing

1. Plaats een cassette met roosters in de microscoopautoloader.
2. Stel beeldvormingsomstandigheden in die geschikt zijn voor het toewijzen van het hele raster. Doe dit bij de laagst mogelijke vergroting rekening houdend met het gezichtsveld van de gebruikte detector (EFTEM SA 2250x). Sla de beeldomstandigheden op als een SerialEM Imaging State om dingen gemakkelijk te maken voor later gebruik.
3. Volledige montage instellen
   1. Open het menu SerialEM Navigator.
   2. Selecteer Montaging & Grids.
   3. Selecteer Volledige montage instellen.
4. Start het script Grid_Mapping. Laat het script wachten tot de autoloader is afgekoeld. inventariseer en breng vervolgens elk raster in kaart dat de voorraadprocedure heeft gevonden. Voer een e-mail in via het Tilt Series Menu, zodat het script gemakkelijk een e-mail kan verzenden wanneer u klaar bent.
5. Navigator opslaan .
6. Inspecteer alle rasterkaarten van de SerialEM Navigator en kies welk raster verder moet worden toegewezen bij een hogere vergroting.
   OPMERKING: Veel TEM's die zijn uitgerust met een autoloader-systeem, tonen een rotatie van het raster wanneer ze opnieuw worden geladen. Het is het beste om elk raster opnieuw toe te wijzen nadat u het opnieuw hebt geladen. Alternatieve systemen hebben meestal slechts enkele verschuivingen, die kunnen worden gecorrigeerd in SerialEM met een Shift To Marker-procedure.

3. Stel de SerialEM lage dosis in

1. Stel de vergroting in van serialem lage dosis weergave- en voorbeeldmodi (dit is vereist voor stap 6).
2. Een weergaveafbeelding verkrijgen en opslaan als een kaart in de navigator.
3. Een voorbeeldafbeelding verkrijgen en opslaan als een kaart in de navigator.
   1. Stel beide modi in op dezelfde binning (binning 4 wordt voorgesteld). Hierdoor kunnen de twee kaarten in één afbeeldingsstapel worden opgeslagen.
   2. Wijzig in het venster SerialEM Navigator het label van de weergavekaart in Weergave en het label van de voorbeeldkaart in Voorbeeld.
   3. Sla het navigatorbestand op en sluit het.
      OPMERKING: Er is geen doel nodig voor de eerste weergave- en voorbeeldafbeeldingen, PyEM gebruikt alleen hun beeldinstellingen.

4. Raster vierkante mapping

1. Stel de beeldomstandigheden in om rastervierkanten toe te kaarten. Het is van groot belang om de steekproef van belang en de fiduciale kraalverdeling te kunnen zien. Voer de volgende stappen uit om een optimaal contrast voor rastervierkantkaarten te garanderen.
   1. Plaats een objectief diafragma.
   2. Plaats indien van toepassing de energiefilterspleet.
   3. Gebruik een defocus van -100 μm.
2. Scherm voor goede rastervierkanten geschikt voor verdere mapping. Na visuele inspectie van de vierkanten van de rasterkaart, maakt u testafbeeldingen van het vierkant met de beeldomstandigheden die moeten worden gebruikt voor rastervierkantkaarten.
3. Wanneer een goed vierkant wordt geïdentificeerd, markeert u het midden in de rasterkaartafbeelding met behulp van de functie Punten toevoegen van de SerialEM Navigator.
4. Zodra alle punten zijn toegevoegd, drukt u in de SerialEM Navigator op Shift + A op het eerste punt en drukt u vervolgens op Shift + A op het laatste punt.
   OPMERKING: Alle toegevoegde punten worden nu gemarkeerd met een A, wat betekent dat het allemaal acquisitiepunten zijn.
5. Druk op Shift + N (maak een nieuw bestand bij item) op het eerste punt en vervolgens opnieuw op het laatste punt. Selecteer Montaged Imagesin het dialoogvenster dat wordt weergegeven.
6. Wanneer het montagedialoogvenster verschijnt, stelt u een montagegrootte in die één rastervierkant bedekt. Dit is afhankelijk van de vergroting en de maaswijdte van de gebruikte rasters en vereist meestal 2 x 2 tot 4 x 4 montages. Geef het een naam met een nummer (bijv. squaremap_01.mrc) zodat de SerialEM gemakkelijk alle bestanden per rastervierkant automatisch kan nummeren.
7. Start de rastertoewijzing door het menu SerialEM Navigator te openen en klik op Verwerven bij items.
8. Selecteer in het pop-upmenu de volgende opties.
   1. Selecteer Ruwe eucentriciteit.
   2. Selecteer Kaartafbeelding verkrijgen.
   3. Selecteer Kolomkleppen sluiten aan het einde.
   4. Selecteer E-mail verzenden aan het einde.

5. Het selecteren van de doelen

1. Open een dummy SerialEM-exemplaar. Dit kan worden ingesteld op de SerialEM-pc die de microscoop bestuurt of op een andere (ondersteunings)pc als beide computers een netwerkverbinding delen.
2. Zodra het eerste rastervierkant is toegewezen, gebruikt u de menuoptie SerialEM Navigator Merge om de montage in het dummy SerialEM-exemplaar te zien.
3. Dubbelklik op het Navigator-venster om de vierkante kaart van het raster te openen.
4. Doorzoek de kaart en gebruik de dummy SerialEM Navigator-optie Punten toevoegen om punten voor het verkrijgen van afbeeldingen toe te voegen aan het doel van belang.
5. Wanneer u klaar bent en de nieuwe vierkanten in kaart hebt gebracht, slaat u het Navigator-bestand op en voegt u de Navigator opnieuw samen. doorgaan totdat alle rastervierkanten zijn toegewezen.

6. Genereer virtuele kaarten

1. Voeg nogmaals het navigatorbestand samen met het dummy SerialEM-exemplaar.
2. Voer het script voor virtuele PyEM-kaarten uit vanuit het dummy SerialEM-menu, Extra en selecteer Virtuele ankertoewijzingen. Dit kan enige tijd duren, afhankelijk van de grootte en het bedrag van de vierkante rasterkaarten en de binning van de weergave- en voorbeeldkaarten.
   OPMERKING: PyEM start een opdrachtvenster dat automatisch wordt gesloten wanneer het klaar is, waarna het nieuwe navigatorbestand kan worden geopend. Per gemontagete kaart die geselecteerde punten bevat, schrijft PyEM één samengevoegde kaart en alle weergave- en voorbeeldkaarten. Ten slotte schrijft het een nieuw Navigator-bestand met de naam <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Microscoop tuning

1. Controleer de microscoopafstemming. Gebruik dezelfde vergrotings- en bundelgrootte-instelling voor gegevensverzameling om de juiste microscoopprestaties te garanderen, in de volgende volgorde.
   1. Voer SeriaLEM Coma-free alignment uit door CTF (Zemlin tableau).
   2. Een objectief diafragma invoegen en centreren.
   3. Voer SerialEM Correct Astigmatism uit door CTF (auto-stigmate).
   4. Voer GIF Quick Tune uit (d.w.z. alleen scherpstellens voor spleten).
      OPMERKING: Aangezien de stappen 7.1.1, 7.1.3 en 7.1.4 mogelijk meer dosissnelheid vereisen, moet alleen de spotgrootte worden gewijzigd; de straalgrootte mag niet worden gewijzigd, omdat dit een kanteling van de bundel veroorzaakt, waardoor de stemmingen onjuist zijn. Stap 7.1.1, 7.1.2 en 7.1.3 zijn semi-geautomatiseerd in dit openbaar beschikbare script (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Navigator instellen

1. Open in SerialEM het nieuwe navigatorbestand met de naam _automaps.nav.
   OPMERKING: V_yyyy zijn de kaarten weergeven en P_yyyy zijn de voorbeeldkaarten. De voorbeeldtoewijzingen zijn ingesteld als acquisitiepunten.
2. Schakel in het venster SerialEM Navigator alle A-punten uit, selecteer de eerste V_yyyy kaart, selecteer Samenvouwen, klik tweemaal op A en schakel Samenvouwen uit.
3. Selecteer de eerste V_yyyy positie, druk op Shift + T, selecteer vervolgens de allerlaatste V_yyyy positie en druk nogmaals op Shift + T.
4. Kies Afbeeldingen met één frame in de eigenschappen van het bestand dat u wilt openen.
5. Selecteer in het volgende dialoogvenster Bestandseigenschappen de gewenste parameters op basis van de beeldbehoeften en de instelling van het instrument.
6. Geef op de vraag een naam met een nummer (bijv. TS_001.mrc) en klik op Opslaan.
   OPMERKING: SerialEM nummert automatisch de bestandsnamen voor alle kantelreeksen.
7. Stel de controller van de tilt-serie in voor de eerste TS-positie. Als u klaar bent, klikt u op OK om deze parameters in te stellen voor alle kantelreeksen na dit acquisitie-item. Alle Preview-kaarten zijn nu geselecteerd als TS (Tilt Series) met genummerde bestandsnaam TS_xxx.mrc.
   OPMERKING: Men kan de parameters later handmatig wijzigen met behulp van de Navigator TSparams-functie; wijzigingen worden toegepast voor alle items naar beneden in de lijst. De gebruiker heeft de mogelijkheid om een aangepast script uit te voeren in plaats van de kantelreeks.

9. Stel de focus/track posities in

1. Stel indien nodig de scherpstel-/spoorafstand voor elk doel in (zorg ervoor dat SerialEM Low Dose is ingeschakeld).
2. Dubbelklik op de kaart weergeven om deze te laden.
3. Selecteer de voorbeeldtoewijzing in de lijst Navigator.
4. Selecteer Focus bewerken in het venster Navigator.
5. Schakel in het deelvenster Lage dosiscontrole de optie Tussengebiedas roteren uit om Proef en focus langs de kantelas van het werkgebied te plaatsen.
6. Klik op het gewenste gebied in de geladen weergavekaart om de focus/proefpositie voor deze kantelreeks in te stellen.
7. Zorg ervoor dat het Navigator-item nu TSP heeft ingesteld; herhaal de procedure voor alle artikelen.
   OPMERKING: Scherpstel-/spoorposities worden automatisch naar beneden gekopieerd in de Navigator. Als de scherpstel-/spoorpositie voor het vorige item aan de juiste kant en van de juiste afstand is, hoeft u deze daarom niet te wijzigen voor het huidige item.

10. Stel extra scripts in

1. Twee scripts behandelen het Focus-bereik: pretomo en duringtomo. Het pretomo-script wordt uitgevoerd vóór elke kantelreeks en het duringtomo-script tijdens elke kanteling.
2. Bewerk het scherpstelbereik in het script pretomo.
3. Schakel in het menu SerialEM Tilt Series het script uitvoeren in TS in en selecteer het scriptnummer van het duringtomo-script.

11. Rennen

1. Controleer het niveau van de stikstoftank.
2. Controleer of de Autoloader turbo off is geselecteerd.
3. Controleer de vrije ruimte voor gegevensopslag.
4. Schakel in het menu SerialEM-bestand continue opslag voor het logboekbestand uit en sluit elk momenteel geopend logboekbestand. Elke tilt-serie krijgt zijn eigen logbestand.
5. Klik in het menu Navigator op Verwerven bij Items.
6. Voer het script PreTomo uit.
7. Selecteer Primaire taak De kantelreeksen verwerven.
8. Selecteer Script uitvoeren na PostTomo.
9. Selecteer Kolomkleppen sluiten aan het einde.
10. Selecteer E-mail verzenden aan het einde.
11. Klik op GO.
    OPMERKING: SerialEM stuurt een e-mail per tilt-serie, succesvol of fout; fout kan echter ook betekenen dat het volledige kantelbereik niet is bereikt.

Results

Deze procedure werd gebruikt om de Sars-Cov-2 tilt-serie te verwerven die wordt beschreven in Turonova et al. 2020²⁰; de hele dataset werd geproduceerd met behulp van drie verschillende rasters gedurende drie microscopiesessies in EMBL Heidelberg. De huidige studie zal zich richten op en beschrijven van de eerste 3-daagse (~ 72 uur) sessierun met het eerste raster.

Nadat het hele raster bij een lage vergroting (~10 min, zie stap 2) in kaart was gebracht, werden 71 geschikte vierkanten geselecteerd op de rasterkaart en werden middelgrote vergrotingskaarten (vierkante kaarten) verkregen met instellingen (vergroting, belichting, defocus) die de directe visualisatie en identificatie van het interessemonster mogelijk maken, coronavirussen in dit geval (zie stap 4) (Figuur 1A). De acquisitietijd was ~ 3 min per vierkant, 3 uur 45 min in totaal.

Zodra de eerste vierkante kaart werd gemaakt, werd een dummy SerialEM-exemplaar (zonder enige controle op camera of microscoop) geopend op een aparte computer om de vierkante kaart te visualiseren en punten toe te voegen aan doelen die geschikt zijn voor het verkrijgen van tiltseries (zie stap 5) (Figuur 1B). Nieuw verworven vierkante kaarten werden opgehaald door de huidige dummy SerialEM-navigator samen te voegen met de navigator uit het verkrijgende SerialEM-exemplaar. Na ~2 uur raster vierkante acquisitie en selectie, konden 50 initiële doelen worden geïdentificeerd.

Nadat de vierkante kaartaanwinsten waren voltooid, werd SerialEM low-dose ingesteld en werden referentieweergave- en voorbeeldafbeeldingen gemaakt en opgeslagen als kaarten (zie stap 3). De laatste kaarten kunnen vervolgens onmiddellijk op het dummy SerialEM-exemplaar worden gebruikt om vanuit de bijbehorende vierkante kaartafbeeldingen de virtuele weergave (figuur 1C) en virtuele voorbeeldkaarten (figuur 1D) van de 50 geselecteerde doelen met de PyEM-softwaresuite te genereren voor een verwerkingstijd van ~ 30 minuten (zie stap 6). Deze verwerkingstijd op de dummy SerialEM-sessie werd gebruikt om de laatste voorbereidingen van de microscoop voor acquisitie uit te voeren: energiefiltertuning, nieuwe camera-versterking referentiebeeldacquisitie, astigmatisme- en comavrije uitlijning van de objectieve lens.

Zodra de microscoopafstemming was voltooid en virtuele kaarten van de 50 initiële doelen waren gegenereerd, werd de eigenlijke SerialEM-navigator ingesteld die voor acquisitie moest worden gebruikt (zie stap 8), werden focus- en trackposities ingesteld (stap 9) en kon de acquisitie van tilt-reeksen worden gestart (zie stap 10 en 11). De Virtual View-kaarten (Figuur 1C) werden gebruikt voor een eerste centreren van het doel ( Figuur1E) gevolgd door een laatste centreering uitgevoerd bij de daadwerkelijke vergroting van de vergroting van de kantelreeks (Figuur 1F) met behulp van de Virtual Preview-kaart (Figuur 1D).

Beginnend met grid mapping om 9:30 in de ochtend, begon de acquisitie van de tilt serie voor de 50 initiële doelen om ongeveer 15:00. Met de instellingen die worden gebruikt voor tomografische acquisitie (zie de referentie voor details), duurde het ~ 20 minuten om een kantelreeks te verwerven, met voldoende doelen om vervolgens de hele nacht door te lopen. Terwijl de overname werd uitgevoerd, kon de rest van de vierkante kaarten worden geïnspecteerd en meer doelen worden toegevoegd, nog steeds offline via het dummy SerialEM-exemplaar. 121 meer doelen werden geselecteerd uit de resterende vierkante kaarten en toegevoegd aan de acquisitie SerialEM navigator nadat virtuele kaarten waren gemaakt voor deze nieuwe doelen, genoeg om te draaien tot de voltooiing van de 72 uur sessie.

Deze procedure (samengevat in figuur 2) maakte het mogelijk om in één werkdag 171 doelen voor geautomatiseerde tomografische verwervingen in te stellen voor een microscoopsessie van 72 uur (3 dagen).

Figuur 1: Voorbeeld van een vierkante kaart met representatieve virtuele kaarten en bijbehorende aanwinsten na centreren. (A) Representatieve vierkante kaart van een Sars-Cov-2 cryoEM-raster gebruikt in Turonova et al.²⁰. Vier regio's van belang zijn gemarkeerd met een rood kruis. Microscoopvergroting is 2.250x. (B) Bijsnijden uit de vierkante kaart met de gebieden die zijn gebruikt om de virtuele weergave (oranje) en virtuele voorbeeld (geel) kaarten te genereren voor de geselecteerde doelkaart (rode kruis) (C) virtuele weergavekaart. (D) Virtuele voorbeeldkaart. (E) Werkelijke weergave-acquisitie na centreren met behulp van de virtuele weergavekaart als referentie. Microscoopvergroting is 11.500x. (F) 0° tilt acquisitie uit de tilt serie na centreren met behulp van de Virtual Preview kaart als referentie. Microscoopvergroting is 64.000x. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: CryoET sessie workflow met SerialEM met PyEM tools. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Vanuit een nichetechniek is cryoET nu uitgegroeid tot een wijdverspreide methode om structurele studies uit te voeren op cellulair en moleculair niveau met een ongekende bereikbare resolutie^21,22. De steeds toenemende vraag naar cryoEM-beeldvorming heeft de beperkte middelen die beschikbaar zijn om toegang te krijgen tot deze technologie onder druk gezet. Ondanks de opening van een aantal nationale cryoEM-faciliteiten en de inspanningen van wetenschappelijke instituten om hun TEM-capaciteit te vergroten om de behoeften van de gemeenschap wereldwijd te ondersteunen, is de toegang tot cryoEM-instrumenten nog steeds beperkt en moet de tijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens daarom efficiënt door de gebruikers worden gebruikt om de opbrengst van elke microscopiesessie te maximaliseren. De noodzaak om honderden tilt-series te verwerven in combinatie met de beperkte tijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens, vroeg om nieuwe beeldverwervingsroutines om een betere doorvoer te bereiken zonder de gegevenskwaliteit in gevaar te brengen. Recente ontwikkelingen in hardware- en imagingworkflows hebben de snelheid van de acquisitie van tilt-series^18,19aanzienlijk verhoogd , wat heeft resulteren in een dramatische verschuiving van de verhouding tussen de tijd die is besteed aan het opzetten van een acquisitiepunt en de tijd die nodig is voor de daadwerkelijke acquisitie van de tilt-serie. Al met al wordt de procedure voor het opzetten van acquisitiepunten een van de belangrijkste knelpunten voor de haalbare doorvoer van cryoET-sessies.

Het hier gepresenteerde geoptimaliseerde protocol stelde ons in staat om in off-line modus 171 posities in te stellen voor geautomatiseerde tomografische acquisitie binnen de eerste dag van een cryoET-sessie, terwijl de microscoop actief bezig was met andere bewerkingen (bijv. square mapping, tuning en geautomatiseerde tilt-serie acquisitie), dus zonder de microscooptijd te beïnvloeden die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens. Naast het maximaliseren van de doorvoer van een cryoET-sessie, vermindert deze pijplijn de hoeveelheid tijd die de gebruiker investeert in de voorbereidende fase van een geautomatiseerde sessie voor het verzamelen van gegevens drastisch. In het beschreven protocol wordt de gebruiker gevraagd door de toegewezen rastervierkanten te bladeren om geschikte gebieden van belang te identificeren en deze toe te voegen aan de Serial EM Navigator als acquisitiepunten. Alle doelen worden vervolgens automatisch in batch verwerkt binnen SerialEM door de PyEM-tool voor de productie van de virtuele kaarten¹⁶. De gepresenteerde computationele benadering is daarom aanzienlijk sneller dan het verkrijgen van echte verankeringskaarten door de wachttijden te elimineren die verband houden met fasebeweging, beeldverwerving, verandering van beeldomstandigheden tussen Weergave en Voorbeeld, en door de uiteindelijke herhaling van deze stappen terwijl ze zich centreren bij een hoge vergroting. Bovendien, aangezien elk verworven beeld leidt tot accumulatie van elektronendosis op het object van belang²³, vermindert het gebruik van virtuele kaarten voor de precieze herschikking van de doelen de stralingsschade die is geïntroduceerd in de voorbereidende fase van een cryoET-sessie vóór de daadwerkelijke verwerving van de kantelreeks. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van zowel virtuele projecties met een gemiddelde als een hoge vergroting (respectievelijk Preview en View) voor het opnieuw uitlijnen van het doel vóór de verwerving van de tilt-serie. Deze procedure kan eenvoudig worden gewijzigd om alleen de tussenliggende vergroting te gebruiken Beeldweergave wanneer de uitlijningsnauwkeurigheid van minder belang is, bijvoorbeeld in het geval van grote constructies waar de uiteindelijke doelnauwkeurigheid minder zorgwekkend is¹⁰ of voor monsters met één deeltjesanalyse die slecht zijn verspreid op het cryo-raster en waarvoor de gebruiker handmatige selectie van elk acquisitiepunt²⁴vereist^{, 25}. Ten slotte vergemakkelijkt een aanpak op basis van het off-line gebruik van een dummy SerialEM-exemplaar ook de installatie van acquisitiepunten via externe verbinding door de behoefte aan de fysieke aanwezigheid van de gebruiker onder de microscoop te minimaliseren, waardoor meer flexibiliteit mogelijk is in termen van operationele organisatie van de faciliteit.

De recente vooruitgang in technologie en methoden voor cryoET heeft de snelheid en betrouwbaarheid van geautomatiseerde dataverzamelingssessies drastisch verbeterd. Er zijn echter verdere ontwikkelingen nodig om de resterende tariefbeperkende stappen van deze methode aan te pakken. Het meest in het bijzonder wordt de eerste stap van raster- en vierkantsmapping nu een van de belangrijkste knelpunten van de sessie-instelling, waardoor de behoefte aan hardwareverbeteringen wordt gegenereerd die gericht zijn op het verhogen van de snelheid van microscooptrapbewegingen en van beeldverwerving door de directe elektronendetectoren. Bovendien zal de ontwikkeling van machine learning-benaderingen om het proces van doelidentificatie volledig te automatiseren van cruciaal belang zijn om de visuele inspectie van de gebruikers voor het selecteren van de betrokken regio's te elimineren, een tijdrovende procedure die afhankelijk is van de expertise van de gebruikers.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission Electron Microscope			Ons protocol is alleen gebaseerd op computationele workflows. De gebruiker heeft alleen toegang nodig tot een TEM van welke soort dan ook