Methodenartikel

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

DOI:

10.3791/62393

⸱

14 mei 2021

 ,  ,  , 
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De covalente hechting van ubiquitine (Ub) aan interne lysineresidu(en) van een substraateiwit, een proces dat ubiquitylatie wordt genoemd, vertegenwoordigt een van de belangrijkste posttranslationele modificaties in eukaryote organismen. Ubiquitylatie wordt gemedieerd door een sequentiële cascade van drie enzymklassen, waaronder ubiquitine-activerende enzymen (E1-enzymen), ubiquitine-conjugaterende enzymen (E2-enzymen) en ubiquitine-ligases (E3-enzymen) en soms ubiquitine-keten elongatiefactoren (E4-enzymen). Hier worden in vitro protocollen voor ubiquitylatie-assays verstrekt, die de beoordeling van E3-ubiquitineligase-activiteit, de samenwerking tussen E2-E3-paren en substraatselectie mogelijk maken. Samenwerkende E2-E3-paren kunnen worden gescreend door de generatie van vrije poly-ubiquitineketens en/of auto-ubiquitylatie van het E3-ligase te monitoren. Substraat alomtegenwoordigheid wordt gedefinieerd door selectieve binding van het E3-ligase en kan worden gedetecteerd door western blotting van de in vitro reactie. Verder wordt een E2~Ub-lozingstest beschreven, wat een nuttig hulpmiddel is voor de directe beoordeling van functionele E2-E3-samenwerking. Hier wordt de E3-afhankelijke overdracht van ubiquitine gevolgd van het overeenkomstige E2-enzym naar vrije lysine-aminozuren (het nabootsen van substraat-ubiquitylatie) of interne lysines van het E3-ligase zelf (auto-ubiquitylatie). Kortom, er worden drie verschillende in vitro protocollen verstrekt die snel en gemakkelijk uit te voeren zijn om de E3 ligase katalytische functionaliteit aan te pakken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitylatie is het proces waarbij Ub covalent wordt gekoppeld aan een substraateiwit1. De Ub-modificatie wordt gekatalyseerd door opeenvolgende enzymatische reacties met de werking van drie verschillende enzymklassen, d.w.z.Ub-activerende enzymen (E1s), Ub-conjugaterende enzymen (E2s), Ub-ligases (E3s) en mogelijk Ub-ketenverlengingsfactoren (E4s)2,3,4,5. Na adenosinetrifosfaat (ATP)- en magnesium (Mg2+)-afhankelijke activering van Ub door E1, valt de actieve site cysteïne van E1 de C-terminale glycine van Ub aan en vormt een thioestercomplex (Ub ~ E1). De energie die wordt onttrokken aan ATP-hydrolyse zorgt ervoor dat de Ub een overgangstoestand met hoge energie bereikt, die gedurende de volgende enzymcascade wordt gehandhaafd. Vervolgens brengt het E2-enzym de geactiveerde Ub over naar zijn interne katalytische cysteïne, waardoor een voorbijgaande Ub ~ E2-thioesterbinding wordt gevormd. Vervolgens wordt Ub overgebracht naar het substraateiwit.

Dit kan op twee manieren. Ofwel kan de E3 ligase eerst binden aan E2, ofwel de E3 ligase kan direct binden Ub. De laatste manier resulteert in de vorming van een E3~Ub intermediair. In beide gevallen is Ub gekoppeld aan het substraateiwit door de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminale carboxylgroep van Ub en de lysine Ɛ-aminogroep van het substraat6. Het menselijk genoom codeert voor twee E1's, ongeveer 40 E2's en meer dan 600 vermeende ubiquitine-ligases7. Op basis van het Ub-overdrachtsmechanisme van de E3 zijn Ub-ligases onderverdeeld in drie categorieën met betrekking tot homologe tot E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING) / U-box-type en RING tussen RING (RBR) -type ligases8. In deze studie wordt de U-box met ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), gebruikt als representatief E3-enzym. In tegenstelling tot HECT-type E3 enzymen die Ub~E3 thioesters vormen, bindt het U-box domein van CHIP E2~Ub en bevordert de daaropvolgende Ub/substraat overdracht direct van het E2 enzym8,9. Op basis van het belang van de U-box voor de enzymatische functie, wordt een inactieve CHIP U-box mutant, CHIP (H260Q), gebruikt als een controle. CHIP (H260Q) bindt niet aan zijn verwante E2's, waardoor zijn E3-ligaseactiviteitverloren gaat 10.

Eiwit ubiquitylatie speelt een cruciale rol bij het reguleren van een veelheid aan cellulaire gebeurtenissen in eukaryote cellen. De diversiteit van cellulaire uitkomsten die worden bevorderd door de omkeerbare hechting van Ub-moleculen aan substraateiwitten kan worden toegeschreven aan de moleculaire kenmerken van Ub. Omdat Ub zelf zeven lysine (K) residuen bevat voor verdere alomtegenwoordigheid, is er een rijke verscheidenheid aan Ub-ketentypen met verschillende maten en/of topologieën11. Substraten kunnen bijvoorbeeld worden gewijzigd door een enkel Ub-molecuul op één (mono-ubiquitylatie) of meerdere lysines (multi mono-ubiquitylatie), en zelfs door Ub-ketens (poly-ubiquitylatie)11. Ub-ketens worden homo- of heterotypisch gevormd via dezelfde of verschillende lysineresiduen van Ub, wat zelfs kan resulteren in vertakte Ub-ketens9. Eiwit-alomtegenwoordigheid leidt dus tot diverse arrangementen van Ub-moleculen die specifieke informatie verstrekken, bijvoorbeeldvoor afbraak, activering of lokalisatie van geconjugeerde eiwitten12,13. Deze verschillende Ub-signalen maken een snelle herprogrammering van cellulaire signaalroutes mogelijk, wat een belangrijke vereiste is voor het vermogen van de cel om te reageren op veranderende omgevingsbehoeften.

Een centraal aspect van alomtegenwoordigheid is gerelateerd aan eiwitkwaliteitscontrole. Verkeerd gevouwen of onomkeerbaar beschadigde eiwitten moeten worden afgebroken en vervangen door nieuw gesynthetiseerde eiwitten om eiwithomeostase of proteostase te behouden14. De kwaliteitscontrole E3 ligase, CHIP, werkt samen met moleculaire chaperonnes in de Ub-afhankelijke afbraak van beschadigde eiwitten9,15,16,17. Afgezien daarvan reguleert CHIP de stabiliteit van de myosine-gerichte chaperonne, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), die nauw is gecoördineerd met de spierfunctie en afwijkingen van de optimale niveaus leiden tot menselijke myopathie18,19,20,21. Degradatie van UNC-45B door het 26S-proteasoom wordt gemedieerd door bevestiging van een K48-gekoppelde poly-Ub-keten9. Bij afwezigheid van substraateiwitten voert CHIP auto-ubiquitylatie10,22,23uit,wat kenmerkend is voor RING / U-box E3 ubiquitine-ligases24,25 en wordt beschouwd als het reguleren van ligase-activiteit26. Toepassing van de in vitro ubiquitylatie-assaymethoden beschreven in dit artikel hielp bij het systematisch identificeren van E2-enzymen die samenwerken met CHIP om de vorming van vrije poly-Ub-ketens en / of auto-ubiquitylatie van CHIP te bevorderen (protocolsectie 2). Bovendien werd CHIP-afhankelijke alomtegenwoordigheid van UNC-45B waargenomen, wat een bekend substraat is van het E3-ligase18,19 (protocolsectie 3). Uiteindelijk werd chip-afhankelijke overdracht van geactiveerde Ub van de Ub~E2 thioester gecontroleerd (protocol sectie 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: Buffers en reagentia die handmatig in het laboratorium zijn bereid, worden hieronder vermeld. Alle andere buffers en reagentia die in de protocollen werden gebruikt, werden bij verschillende bronnen gekocht en gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Bereid 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x PBS). Meng hiervoor 1,37 M natriumchloride (NaCl), 27 mM kaliumchloride (KCl), 80 mM dinatrium-waterstoffosfaatdihydraat (Na2HPO4.2 H2O) en 20 mM kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) in 1 L dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O). Autoclaaf de 10x PBS en bereid een 1x PBS-oplossing in ddH2O.
    1. Autoclaveren wordt gedurende 15 minuten uitgevoerd bij 121 °C en 98,9 kPa.
      OPMERKING: Autoclaveren wordt onder deze omstandigheden uitgevoerd voor alle buffers en oplossingen. Indien niet anders aangegeven, worden oplossingen bewaard bij kamertemperatuur (RT).
  2. Bereid 1 l PBS-Tween (PBS-T) oplossing voor door 0,1% Tween toe te voegen aan 1 L 1x PBS.
  3. Bereid 10 ml van een L-lysine-stamoplossing van 0,5 M door L-lysine op te lossen in ddH2O. Aliquot L-lysine in porties van 1 ml en bewaar ze bij -20 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: L-lysine kan herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid.
  4. Bereid een 0,25 M ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) oplossing door EDTA op te lossen in 200 ml ddH2O.
    1. Stel de pH in op 8,0 met natriumhydroxide (NaOH).
    2. Stel het volume in op 250 ml met ddH2O.
    3. Autoclaaf de oplossing.
  5. Bereid 10 ml van een 20 mg/ml bovien serumalbumine (BSA)-oplossing door BSA op te lossen in ddH2O. Bewaren bij -20 °C in 200 μL aliquots.
    OPMERKING: BSA kan herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid.
  6. Bereid 1 L 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) lopende buffer door 50 mM MES, 50 mM Tris base, 3,47 mM natriumdodecylsulfaat (SDS) en 1,03 mM EDTA op te lossen in 0,9 l ddH2O. Stel na het goed mengen het volume in op 1 L.
    1. De pH van de 1x buffer is 7,6. Pas de pH niet aan met zuur of base.
  7. Bereid 200 ml blokkerende oplossing (5% melk) door 10 g melkpoeder op te lossen in 1x PBS-T. Bewaar de blokkeringsoplossing bij 4 °C gedurende maximaal één week.
  8. Bereid 1 L overdrachtsbuffer voor (zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Bereid 2x SDS-monsterbuffer door 125 mM Tris-base, 4% SDS, 4% glycerol, 0,03% broomfenolblauw en 50 μL/ml β-mercaptoethanol op te lossen in 50 ml ddH2O. Aliquot in porties van 1 ml en bewaar bij -20 °C tot gebruik.

2. In vitro auto-ubiquitylatie assay

  1. Voorbereiding en uitvoering van assays
    1. Bereken het volume van elk reagens dat per reactie nodig is op basis van de gegeven molariteiten van de eiwitten en de eiwitconcentraties van de eiwitoplossingen. Gebruik per auto-ubiquitylatiereactie 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 en 50 μM Ub. Stel het volume van de reactie in op 20 μL met ddH2O.
      OPMERKING: ATP-oplossing en alomtegenwoordigheidsbuffer werden gekocht als 10x voorraadoplossingen en gebruikt op 1x.
    2. Bereid een pipetterschema voor voor alle reacties. Test negen verschillende E2-enzymen op hun vermogen om te functioneren (I) met CHIP, (II) met een katalytisch inactieve CHIP (H260Q) mutant en (III) zonder CHIP in individuele alomtegenwoordige reacties.
    3. Om pipetteerfouten te voorkomen, bereidt u een mastermix op ijs die het volume bevat dat nodig is voor alle reacties plus één extra reactie. Bereken de benodigde hoeveelheid mastermix per reactie.
      OPMERKING: Hoofdmixcomponenten zijn reagentia die voor elke reactie evenzeer nodig zijn, d.w.z.E1, E3, Ub, ATP en alomtegenwoordigheidsbuffer.
    4. Voeg ddH2O en mastermix toe aan de polymerasekettingreactiebuizen (PCR). Houd de buizen op ijs.
    5. Voordat u de alomtegenwoordige reacties start door de E2-enzymen toe te voegen, stelt u een PCR-thermische cycler in met het volgende programma: 2 uur, 37 °C gevolgd door 4 °C, oneindig.
    6. Voeg 1 μM van de E2-enzymen toe aan de respectieve buizen en incubeer de monsters in de PCR-thermische cycler gedurende de aangegeven periode.
    7. Voeg na 2 uur sds-monsterbuffer toe aan elke reactie en meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Het vereiste volume van de monsterbuffer is afhankelijk van de voorraadconcentratie van de monsterbuffer. Hier werd aan elke reactie 20 μL van 2x SDS-monsterbuffer toegevoegd.
    8. Kook de monsters onmiddellijk bij 95 °C gedurende 5 minuten en ga verder met polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Bewaar de gedenatureerde eiwitten bij -20 °C.
  2. Gel elektroforese en western blot
    1. Draai na het ontdooien de monsters ongeveer 10 s naar beneden en laad de SDS-PAGE-gel. Gebruik een eiwitladder als maatreferentie.
      OPMERKING: Hier werden 4-12% Bis-Tris gradiëntgels en 3 μL eiwitladder gebruikt. Verdeel de monstervolumes en laad twee gels gelijkelijk met 20 μL van elk monster.
    2. Laat de gel ongeveer 30-45 minuten op 160-200 V lopen, zodat het monster aan de voorkant de bodem van de gel bereikt.
    3. Breng elke gel over in een plastic container gevuld met semidry dempingsbuffer en incubeer deze gedurende 2-5 minuten bij RT. Verwijder de stapelgel.
    4. Bereid twee stukjes gel-formaat vloeipapier en een gel-formaat nitrocellulose membraan per SDS gel gel en voor te weken in semidry blotting buffer. Monteer de western blot (WB) sandwich in een WB-kamer van onder naar boven in de volgende volgorde: vloeipapier, nitrocellulosemembraan, SDS-PAGE-gel, vloeipapier.
    5. Verwijder luchtbellen die mogelijk tussen de sandwichlagen zijn opgesloten. Gebruik hiervoor een roller om de boterham een paar keer voorzichtig over te rollen.
    6. Sluit de kamer en laat overtollige devlekbuffer uitlekken.
    7. Plaats de kamer in het betreffende debietapparaat en gebruik het volgende programma voor semidroogdempen: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Breng het uitgeveegde membraan over in een plastic container gevuld met blokkerende oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    9. Bereid de primaire antilichaamoplossing door het antilichaam toe te voegen aan 10 ml PBS-T die een blokkerend reagens bevat (zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: De werkconcentratie van het antilichaam is antilichaamspecifiek. In dit geval werd een monoklonaal anti-ubiquitine antilichaam van de muis gebruikt bij een verdunning van 1:5.000. Voor de tweede gel werd een monoklonaal konijn anti-CHIP antilichaam gebruikt bij 1:5.000 in PBS-T/blokkerend reagens.
    10. Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamoplossing en incubeer een nacht bij 4 °C op een wip.
    11. Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten met PBS-T.
    12. Bereid de secundaire antilichaamoplossing door het betreffende antilichaam toe te voegen aan 10 ml PBS-T.
      OPMERKING: Hier worden anti-muis en muis anti-konijn antilichamen tegen geiten gebruikt bij een verdunning van 1:10.000.
    13. Incubeer het membraan met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij RT op een rocker.
    14. Was het membraan drie keer gedurende 5 minuten met PBS-T.
  3. Data-analyse
    1. Voeg western blot detectiereagentia voor mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde antilichamen toe aan het gewassen membraan volgens de instructies van de fabrikant en leg het HRP-signaal vast met behulp van röntgenfilms of een opgeladen apparaatcamera(figuur 1).

3. In vitro substraat ubiquitylatie assay

  1. Voorbereiding en uitvoering van assays
    1. Bereken het volume van elk reagens dat per reactie nodig is, op basis van de gegeven molariteiten van de eiwitten en de eiwitconcentraties van de eiwitoplossingen. Gebruik per substraat alomtegenwoordigheidsreactie 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substraat en 50 μM Ub. Gebruik 10x ATP-oplossing en 10x ubiquitylatiebuffer bij 1x. Pas het volume van de substraat ubiquitylatiereactie aan op 20 μL met ddH2O.
    2. Bereid een pipetterschema voor voor alle reacties. Neem de juiste controlereacties op om te controleren of de alomtegenwoordigheid van het substraat E3-specifiek is. Gebruik het eiwit UNC-45B als representatief substraat van CHIP en een katalytisch inactieve CHIP-mutant (H260Q) als controle. Bereid de volgende reacties voor: E1, E2, Ub-mix (inclusief Ub, ATP, ubiquitylatiebuffer); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP (H260Q), UNC-45B; en E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Om pipetteerfouten te voorkomen, bereidt u een mastermix op ijs die het volume bevat dat nodig is voor alle reacties plus één extra reactie. Bereken het volume van de mastermix dat nodig is per reactie.
      OPMERKING: Mastermixcomponenten voor deze test omvatten E1, E2, Ub, ATP en ubiquitylatiebuffer.
    4. Voeg reactiecomponenten toe in de volgende volgorde: ddH2O, substraat, E3-ligase.
    5. Voordat u de alomtegenwoordigheidsreactie start door toevoeging van de mastermix, moet u een PCR-thermische cycler instellen met het volgende programma: 2 h, 37 °C gevolgd door 4 °C, oneindig.
    6. Voeg de mastermix toe aan elke buis en incubeer de monsters in de PCR thermische cycler gedurende de aangegeven periode.
    7. Voeg na 2 uur 2x SDS-monsterbuffer toe aan elke reactie en meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.
    8. Kook de monsters na de run onmiddellijk bij 95 °C gedurende 5 minuten en ga verder met PAGE. U kunt de gedenatureerde eiwitten ook bewaren bij -20 °C.
  2. Gel elektroforese en western blot
    1. Voer gel-elektroforese en western blot uit zoals beschreven in rubriek 2.2. Gebruik specifieke antilichamen voor de detectie van respectievelijk het substraat en het E3-ligase.
      OPMERKING: Hier is UNC-45B gefuseerd met een polypeptide-eiwitlabel afgeleid van het c-myc-genproduct waardoor het gebruik van een monoklonaal muis anti-MYC-antilichaam mogelijk is. Anti-MYC wordt gebruikt op 1:10.000.
  3. Data-analyse
    1. Voer gegevensanalyse uit zoals beschreven in punt 2.3(figuur 2).

4. Lysine-lozingstest

  1. Voorbereiding en uitvoering van assays
    1. Opladen van het E2-enzym met Ub door E1
      1. Bereken het volume van elk reagens dat per reactie nodig is op basis van de gegeven molariteiten van de eiwitten en de eiwitconcentraties van de eiwitoplossingen. Gebruik per laadreactie 2 μM E1, 4 μM E2 en 4 μM lysinevrij ubiquitine (Ub K0). Gebruik 10x ATP en 10x ubiquitylatiebuffer bij 1x. Stel het volume van de laadreactie in op 20 μL met ddH20.
        OPMERKING: De lysinevrije Ub K0-mutant wordt gebruikt om de exclusieve productie van mono-ubiquitylated E2 af te dwingen. Wild-type Ub kan ook worden gebruikt; dit kan echter leiden tot diverse E2~Ub-modificaties(bijv.Poly-ubiquitylatie van E2), die moeilijker te analyseren zijn. Bepaal voor het eerste gebruik of bij gebruik van een nieuw E2-enzym het niveau van Ub-lading op E2 dat kan worden bereikt door E1. Om het laadrendement te bepalen, visualiseer je ongeladen versus geladen E2 via Coomassie-kleuring. Hier werd ongeveer de helft van Ub K0 betrouwbaar geconverteerd naar UBE2D2 ~ Ub bij gebruik van equimolaire verhoudingen van UBE2D2 en Ub K0(aanvullende figuur S2A).
      2. Bereid een pipetterschema voor de laadreactie voor. Pas het volume van de laadreactie aan de volgende ontladingsreacties naar keuze aan, gebruik bijvoorbeeldCHIP en CHIP (H260Q) in individuele ontladingsreacties. Bereid dus het dubbele volume van één laadreactie voor.
        OPMERKING: Test voor het eerste gebruik verschillende concentraties van het E3-ligase naar keuze om optimale ontladingsomstandigheden te controleren en analyseer ze door western blotting. In een ideale toestand zal de afvoer van Ub uit E2 in de loop van de tijd toenemen totdat de respectieve E2 ~ Ub-eiwitband verdwijnt.
      3. Incubeer de laadreactie gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    2. Beëindiging van de laadreactie
      1. Stop de laadreactie door toevoeging van apyrase bij een eindconcentratie van 1,8 E/ml. Voer de incubatie uit met apyrase gedurende 5 minuten bij RT, gevolgd door toevoeging van EDTA bij een eindconcentratie van 30 mM. Stel het volume van de laadreactie in op 30 μL met ddH2O.
        OPMERKING: Apyrase wordt gebruikt om ATP-moleculen om te zetten in ADP-moleculen (adenosinedifosfaat). Omdat de activiteit van het E1-enzym ATP-afhankelijk is, kan E1 E2 niet meer opladen. EDTA wordt bovendien gebruikt om ervoor te zorgen dat E1 wordt geremd door Mg2+ ionen te doven die noodzakelijke co-factoren zijn voor E1. Het volume van apyrase dat nodig is om de reactie te stoppen, kan variëren tussen testomstandigheden. Hoewel apyrase alleen al beschikbare ATP-moleculen dooft, was een combinatie van apyrase en EDTA effectiever in het stoppen van de oplaadreactie voor het E1-UBE2D2-paar. Aangezien het stoppen van de reactie een kritische factor is voor de reproduceerbaarheid van de test, moet een efficiënte stop worden getest op nieuwe E1-E2-paren. Stel hiervoor een oplaadreactie in, stop deze en verzamel monsters op specifieke tijdstippen, bijvoorbeeldna 2, 5, 10 en 15 minuten. Niet-veranderende niveaus van E2 ~ Ub geven aan dat de reactie is gestopt en dat de thioester gedurende die periode stabiel was(aanvullende figuur S2B).
    3. Ontladen van E2~Ub door E3
      1. Bereid vier buizen voor die overeenkomen met de verschillende tijdstippen (t0, t1, t2, t3); voeg niet-reducerende monsterbuffer (6,7 μL 4x lithiumdodecylsulfaatbuffer (LDS) toe aan elke buis.
        OPMERKING: Gebruik geen reductiemiddel in de monsterbuffer.
      2. Verwijder 6 μL uit de gestopte laadreactie voor t0en stel het volume in op 20 μL met ddH2O.
      3. Incubeer het t0-monster gedurende 10 minuten bij 70 °C.
        OPMERKING: Kook het monster niet door de incubatietijd te verlengen, omdat thioesters labiel zijn bij hogere temperaturen.
      4. Bereken het volume van elk reagens dat per ontladingsreactie nodig is. Gebruik de resterende 24 μL van de geladen E2 en voeg 10 mM L-lysine, 1 mg/ml BSA en 500 nM van de E3-ligase toe. Gebruik de ubiquitylatiebuffer op 1x en stel het volume in op 80 μL met ddH2O.
      5. Bereid een pipetterschema voor voor alle ontladingsreacties en gebruik CHIP (H260Q) als controle naast CHIP (WT).
      6. Stel ontladingsreacties op ijs in door de vereiste componenten in de volgende volgorde toe te voegen: ddH2O, ubiquitylatiebuffer, BSA, lysine, E3-ligase en de geladen E2 om de reactie te starten.
      7. Incubateer de ontladingsreactie bij RT.
      8. Neem monsters na 5, 30 en 60 minuten door 20 μL van de ontladingsreactie over te brengen in de respectieve monsterbuizen.
        OPMERKING: Geschikte tijdspunten die een goede bewaking van de ontlading mogelijk maken, kunnen variëren tussen E2-E3-paren.
      9. Vortex het monster onmiddellijk en incubeer het bij 70 °C gedurende 10 minuten.
      10. Ga direct verder met PAGE.
        OPMERKING: E2 ~ Ub thioesters kunnen labiel zijn, zelfs na denaturering in monsterbuffer. Gel-elektroforese moet dus direct na de uitvoering van de test worden uitgevoerd.
  2. Gel elektroforese en western blot
    1. Voer de gel-elektroforese en de western blotting uit zoals beschreven in rubriek 2.2. Gebruik een Ub-specifiek antilichaam en gebruik, indien beschikbaar, ook een E3-specifiek antilichaam dat in een andere soort is verhoogd, waardoor gelijktijdig het Ub- en E3-ligasesignaal kan worden gedetecteerd.
  3. Data-analyse
    1. Voer gegevensanalyse uit zoals beschreven in punt 2.3(figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om E2-enzymen te identificeren die samenwerken met de ubiquitineligase CHIP, werd een set E2-kandidaten getest in individuele in vitro alomtegenwoordigheidsreacties. Samenwerkende E2-E3-paren werden gevolgd door de vorming van E3-afhankelijke ubiquitylatieproducten, d.w.z.auto-ubiquitylatie van het E3-ligase en de vorming van vrije Ub-polymeren. De alomtegenwoordigheidsproducten werden geanalyseerd door western blotting. De interpretatie van de gegevens is gebaseerd op de groottevergelijking van de resu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft basale in vitro ubiquitylatiemethoden voor de analyse van de E3-ligasefunctie. Bij het uitvoeren van in vitro ubiquitylatietests moet er rekening mee worden gehouden dat sommige E2-enzymen auto-ubiquitylatie kunnen uitvoeren als gevolg van de aanval van hun actieve cysteïne op hun eigen lysineresiduen die zich in de nabijheid van de actieve site bevinden30. Om dit probleem te omzeilen, wordt het gebruik van een E2-mutant aanbevolen waarbij het respectieve l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de leden van ons laboratorium voor de kritische discussie en het nuttige advies over het manuscript. We verontschuldigen ons voor het feit dat we geen waardevolle bijdragen hebben genoemd vanwege de beperking van de grootte. Dit werk wordt ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 en Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD naar TH. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC 2030 - 390661388 en - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amershan Protran 0.1 µm NCGE Healthcare10600000nitrocellulose membraan
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoklonaal konijn anti-CHIP-antilichaam, clone C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoklonaal muis anti-MYC-antilichaam, clone 9E10
Anti-ubiquitinUpstate05-944Monoklonaal muis anti-Ub-antilichaam, clone P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS sample buffer (4x)novexB0007
L-LysineSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidantinvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x)novexNP0006-1
Page ruler plusThermo Fisher26619Eiwitladder
RotiBlockRothA151.1Blockingreagens
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 Thermal CyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfersysteem
Tris baseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH Enzyme SetBostonBiochemK-980BE2 enzymen
UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman blotting paperBio Rad1703969Extra dik filterpapier

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6(2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740(2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385(2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vitro ubiquityleringubiquitine overdrachtE2 enzymspecificiteitsubstraatubiquityleringauto ubiquityleringsassaylysine release assayWestern blottingpolyubiquitineketensubiquitine ligaseactiviteit

Gerelateerde artikelen