Digitale annotatie met geautomatiseerde weefseldissectie biedt een innovatieve benadering voor het verrijken van tumoren in gevallen met een laag tumorgehalte en kan worden aangepast aan zowel paraffine- als bevroren weefseltypen. De beschreven workflow verbetert de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en doorvoer en kan worden toegepast op zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerd dissectieprotocol voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20% tumorgehalte, afhankelijk van de methode, is vereist om kwaliteitsgegevens reproduceerbaar te genereren met veel downstream-testen zoals de volgende generatie sequencing. Geautomatiseerde weefseldissectie is een nieuwe methodologie die tumorverrijking in deze gemeenschappelijke weefsels met een laag tumorgehalte automatiseert en verbetert door de gebruikersafhankelijke onnauwkeurigheid van traditionele macrodissectie en tijd-, kosten- en expertisebeperkingen van laser capture microdissectie te verminderen door gebruik te maken van digitale beeldannotatie-overlay op niet-gekleurde dia's. Hier worden digitale hematoxyline- en eosine (H &E) annotaties gebruikt om kleine tumorgebieden te targeten met behulp van een mes met een diameter van 250 μm2 in niet-gekleurd formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) of vers bevroren secties tot 20 μm in dikte voor geautomatiseerde tumorverrijking voorafgaand aan nucleïnezuurextractie en whole exome sequencing (WES). Geautomatiseerde dissectie kan geannoteerde regio's in weefsels met een laag tumorgehalte oogsten uit enkele of meerdere secties voor nucleïnezuurextractie. Het maakt het ook mogelijk om uitgebreide verzamelstatistieken voor en na de oogst vast te leggen, terwijl de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en het verhogen van de doorvoer worden verbeterd met minder dia's. Het beschreven protocol maakt digitale annotatie mogelijk met geautomatiseerde dissectie op dierlijke en/of menselijke FFPE of vers ingevroren weefsels met een laag tumorgehalte en kan ook worden gebruikt voor elke regio van belang verrijking om de geschiktheid voor downstream sequencing-toepassingen in klinische of onderzoeksworkflows te vergroten.
Inleiding
Next generation sequencing (NGS) wordt steeds vaker gebruikt voor zowel patiëntenzorg als in kankeronderzoek om behandelingen te begeleiden en wetenschappelijke ontdekkingen te vergemakkelijken. Weefsel is vaak beperkt en kleine monsters met een variabel tumorgehalte worden routinematig gebruikt. Tumortoereikendheid en integriteit blijven daarom een barrière voor het verkrijgen van zinvolle gegevens. Monsters met lagere tumorpercentages kunnen problemen veroorzaken bij het onderscheiden van echte varianten van sequencingartefacten en komen vaak niet in aanmerking voor NGS1. Tumorverrijking van gevallen met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20%, heeft aangetoond dat het helpt voldoende materiaal te produceren om reproduceerbare sequencinggegevens te genereren en ervoor te zorgen dat laagfrequente varianten niet worden gemist 2,3. Limieten variëren echter afhankelijk van de gebruikte platforms en het geplande gebruik van de gegenereerde gegevens.
Traditioneel wordt verrijking van tumorgebieden voor extractie uitgevoerd door handmatige macrodissectie of laser capture microdissection (LCM) van formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia's. Handmatige macrodissectie, of het schrapen van gespecificeerde weefselgebieden van dia's, maakt het mogelijk om tumorgebieden te verwijderen voor gebruik in downstream-testen met relatief lage kosten, maar met lage nauwkeurigheid en lage precisie 2,4. Minimale technische nauwkeurigheid kan zeer effectief zijn bij gevallen met een hoger tumorgehalte waarbij grote tumorstroken aanwezig zijn en / of minimaal weefselverlies geen significante invloed heeft op de resultaten, maar gevallen met een laag tumorgehalte of gevallen met een meer verspreide tumor vereisen een verhoogde precisie. LCM werd daarom uitgevonden in de jaren 1990 en werd een waardevolle manier om kleine, gedefinieerde, microscopische weefselgebieden nauwkeurig te verwijderen uit formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia's 5,6,7,8. LCM kan worden gebruikt om eencellige populaties te verzamelen wanneer er complexe heterogeniteit van de steekproef bestaat9 waardoor voorheen moeilijk te scheiden celpopulaties kunnen worden verzameld. LCM vereist echter dure machines die uitgebreide technische expertise en hands-on tijd 10,11,12,13,14 vereisen.
Het instrument dat wordt gebruikt voor geautomatiseerde weefseldissectie heeft een precisie tussen die van LCM (~ 10 μm) en macrodissecties (~ 1 mm)15. Bovendien vertoont het zowel kosten- als technische expertisevereisten tussen die van macrodissectie en LCM en is het ontworpen om snelle weefselverrijking uit te voeren van sequentiële FFPE-dia's om de nadelen van eerdere methoden te verlichten15. Geautomatiseerde dissectie op deze manier maakt gebruik van digitale annotaties of referentieafbeeldingen op het podium dia-referentieafbeeldingen op serieel gesneden niet-gekleurde weefseldia's voor het ontleden en verrijken van interessante gebieden. Het instrument maakt gebruik van kunststof spinmes freespunten, 1,5 ml verzamelbuizen en kan worden gebruikt met een aantal verschillende vloeistoffen voor dissectie om gebieden te verzamelen die van belang zijn voor downstream-assays, inclusief nucleïsche extractie en sequencing. De draaiende plastic freespunt maakt gebruik van binnen- en buitenspuitvatreservoirs en een zuiger om buffer te verzamelen, vervolgens molens en verzamelt weefsel16. De variabele diameter van de freespunt (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan dissectie van afzonderlijke weefselgebieden voor vergelijking mogelijk maken, multifocale gebieden die kunnen worden samengevoegd of individuele kleine gebieden van enkele of meerdere FFPE-dia's. Sectiediktes die voor de oogst worden gebruikt, kunnen worden aangepast op basis van individuele experimentbehoeften en gebruikers kunnen ervoor zorgen dat interessante regio's niet zijn uitgeput door een extra H &E uit te voeren op één seriële sectie onmiddellijk na de laatste sectie die voor de oogst is gebruikt.
Geautomatiseerde dissectie werd geïdentificeerd als een manier om het tumorgehalte te verrijken in gevallen met een laag tumorgehalte en we hebben de beoogde functionaliteit van een geautomatiseerd weefseldissectie-instrument getest en uitgebreid, dat momenteel op de markt wordt gebracht voor gebruik op klinische FFPE-monsters met een dikte tot 10 μm. Het werk toont aan dat geautomatiseerde dissectie kan worden toegepast op zowel FFPE als vers ingevroren menselijke of dierlijke weefselsecties tot 20 μm in dikte voor onderzoeksdoeleinden. Het protocol demonstreert ook een benadering voor het digitaal annoteren en automatiseren van dissectie voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte en / of gevallen met geneste, gedispergeerde tumor waar zinvolle macrodissectie een uitdaging of niet haalbaar is en toont zowel de kwaliteit als de opbrengst van nucleïnezuur voldoende voor NGS. Geautomatiseerde dissectie kan daarom middelmatige precisie en verhoogde doorvoer voor tumorverrijking bieden en kan ook worden toegepast om andere interessante regio's te verrijken of te combineren met andere platforms om onderzoek of klinische vragen te beantwoorden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Verkrijg voorafgaand aan de start geschikte weefselmonsters volgens de protocollen van de Institutional Review Board (IRB). Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Genentech, Inc.
1. Weefsel- en diavoorbereiding
- Selecteer FFPE of vers ingevroren weefselblokken en gebruik de bijbehorende verwerkingsmethode hieronder.
- Snijd weefselbloksecties op positief geladen glasglaasjes met de gewenste dikte. Sectie het FFPE-weefsel serieel in linten met de eerste referentiesectie gesneden op een dikte die geschikt is voor H&E-kleuring (d.w.z. 4 μm), gevolgd door 1-4 secties met een dikte variërend van 4-20 μm op basis van de behoefte en beschikbaarheid van weefsel. Verzamel de weefselsecties op positief geladen glazen microscoopglaasjes.
OPMERKING: Vers ingevroren referentieweefselsecties moeten onmiddellijk worden gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H &E) met behulp van routineprotocollen voor bevroren secties en de niet-gekleurde bevroren secties die bij -20 ° C worden gehouden totdat ze nodig zijn voor de oogst. - Laat alle FFPE-secties 's nachts bij kamertemperatuur drogen.
- Bak de FFPE-referentieglaasjes gedurende 30 minuten op 60 °C en bevlek vervolgens met H&E met behulp van routineprotocollen.
- Scan de H&E-gekleurde dia's op een hele diabeeldcamera met een vergroting van 20x of meer.
- Annoteer de gescande diaafbeeldingen voor tumorgebieden van belang met behulp van een door de leverancier geleverd weergaveplatform of een open-source viewer. Exporteer deze annotaties als een schermafbeelding met een lage vergroting of sla ze op als een metagegevensbestand met X-Y-pixelcoördinaten die overeenkomen met polygoonpunten.
OPMERKING: De eerste is technisch minder uitdagend om mee te werken, maar de laatste biedt voordelen in procesautomatisering. - Maak digitale maskers van de geannoteerde interessegebieden in overeenstemming met de gebruikte aanpak en exporteer de handmatige annotaties.
OPMERKING: Als een screenshot /afbeelding van de annotaties wordt gebruikt, kan eenvoudige beeldverwerkingssoftware worden gebruikt om een regio te selecteren en de volledige selectie in te vullen. Het gebruik van X-Y-coördinaten voor elke ROI vereist het gebruik van een programmeertaal om zowel de afbeeldingsgegevens als polygooncoördinaten te lezen om een afbeelding met een laag magère te maken met ingevulde interessegebieden. De gebruiker moet samenwerken met de leverancier van geautomatiseerde dissectie-instrumenten om een proces op te zetten op basis van hun individuele softwarebeschikbaarheid en -behoeften. Als scannen, digitale dia-annotatie en/of het maken van digitale maskers niet beschikbaar is, kan een zorgvuldige annotatie op de dia worden uitgevoerd met behulp van een markering en worden gebruikt in plaats van een digitaal masker als referentieafbeelding. Pseudocode voor het maken van digitale maskers is opgenomen in aanvullend bestand 1.
2. Geautomatiseerde weefseldissectie
- Plaats de niet-gekleurde weefselglijders op het podium in de eerste tot en met de vierde diapositie wanneer u een digitale diareferentie gebruikt. Wanneer u annotatie op de dia gebruikt in plaats van een digitale optie, plaatst u de niet-gekleurde monsterweefselglijbanen op het werkgebied in de tweede tot en met de vierde diapositie met een referentiedia op de eerste positie.
- Maak een freestaak met behulp van de geautomatiseerde weefseldissectiesoftware: Taakselectie > Nieuwe taak maken > Case-ID > Geef de freestaak een naam ; ga naar Dikte > Sectiedikte met behulp van het pijltje omhoog of omlaag; ga vervolgens naar Tissue Preparation > Paraffinized or Deparaffinized, Reference Image > From File > Import Image > File om te importeren vanuit de vervolgkeuzelijst als de digitale referentie, indien van toepassing. Selecteer Uit werkgebied voor verwijzing naar dia's in het werkgebied. Wanneer velden zijn voltooid, scant u het werkgebied door de knop Werkgebied scannen in de rechterbenedenhoek te selecteren om elke voorbeeldweefseldia op de eerste tot en met de vierde positie vast te leggen.
- Selecteer het weefselgebied voor het vastleggen van afbeeldingen.
- Als u een verwijzing in het werkgebied gebruikt, sleept u het vak van de ene hoek naar de andere om een rechthoekig gebied over weefsel te maken. Selecteer de cirkelvormige bel onder het rechthoekige gebied om de werkgebiedreferentieafbeelding vast te leggen. Als u een digitale referentieafbeelding gebruikt, legt u de afbeelding over het geselecteerde rechthoekige gebied. Wijzig het formaat en lijn de digitale referentie grof uit in de cursuszoom om de grootte en positie ten opzichte van het monsterweefsel het beste aan te passen.
- Kopieer dit rechthoekige veld naar de resterende voorbeeldweefseldia's in de tweede tot en met vierde diapositie door de kopieeroptie in de rechterbovenhoek van de referentieafbeelding te selecteren. Lijn uit en wijzig het formaat zo nodig grofweg.
OPMERKING: Wanneer u een referentieafbeelding op de dia gebruikt in plaats van een digitaal masker, selecteert u welke dia in het werkgebied als referentie moet worden gebruikt.
- De referentie- en voorbeelddia's uitlijnen
- Wanneer de referentieafbeelding in alle diaposities sterk is uitgelijnd op weefselmonsterdia's, selecteert u de knop Werkgebied scannen in de rechterbenedenhoek van het scherm om naar de stap voor fijnaanpassing te gaan. Selecteer de positie van het eerste werkgebied en het pictogram van het gereedschap Transformeren (het derde pictogram in de rechterwerkbalk) om de verwijzing nauwkeurig uit te lijnen en in te zoomen om het beste overeen te komen met de voorbeelddia-overlay. Gebruik de schuifbalk Verwijzing naar voorbeeld onder aan het scherm en schakel tussen referentieafbeelding en voorbeeldafbeelding samen met de functie In- en uitzoomen om elke diapositie aan te passen en uit te lijnen. Repliceer dit proces in de tweede tot en met vierde voorbeelddiaposities.
- Selecteer het maalgebied van de regio van belang
- Zodra een optimale voorbeeldoverlay van elk van de vier diaposities is bereikt, tekent u freespadaanduidingen met behulp van het pictogram van het gereedschap Kleurkiezer (het tiende pictogram in de rechterwerkbalk) op het gekleurde gedeelte van de gemaskeerde referentieafbeelding. Selecteer het vak Uitbreiden naar vergelijkbaar als meerdere dia's of gebieden zijn geannoteerd voor dissectie en selecteer vervolgens de knop Annotatie(s) ophalen in de rechterbenedenhoek om freespaden op voorbeelddia's te tekenen.
- Selecteer het freespad in de eerste diapositie.
OPMERKING: Wanneer het freespad in de eerste diapositie is geselecteerd, wordt het gekopieerd naar de resterende diaposities en wordt het gebruik van de freespunt berekend. Het gebruik van de freespunt in de linkerbovenhoek wordt berekend op basis van het bestreken gebied en de geselecteerde tipgrootte. Als er meer dan vier tips worden berekend, kan een grotere tipgrootte worden geselecteerd om de geannoteerde ROI vast te leggen. Tipgrootte kan worden geselecteerd of gewijzigd aan de linkerkant van het scherm onder de pijl Freespunt en het tipgebruik wordt opnieuw berekend. - Wanneer het freespad is berekend, verzamelt u de geannoteerde ROI met vier of minder freespunten. Selecteer de knop Setup Stage in de rechterbenedenhoek van het scherm om het laden van freespunten van geplaatste verzamelbuizen in hun juiste aanduiding op het podium te vragen.
- Vul het reservoir met 3,0 ml van de dissectiebuffer die het meest geschikt is voor het weefseltype (FFPE of vers bevroren) en downstream nucleïnezuurextractiekits en selecteer de knop Dissect in de rechterbenedenhoek van het scherm. Gebruik minerale olie van moleculaire kwaliteit of een geschikte buffer uit in de handel verkrijgbare nucleïnezuurextractiekits.
OPMERKING: Geautomatiseerde dissectie van dia's en geselecteerde interessegebieden begint dan en monsters worden verzameld door het instrument. De unitkop pikt freespunten op van de achterkant van het podium en vult zich met dissectievloeistof uit het reservoir. Tips spinnen vervolgens langs het freespad en zuigen monsterweefsel van dia's totdat het volledig of vol is. Het verzamelde monster met dissectievloeistof wordt vervolgens in verzamelbuizen aan de achterkant van het podium gedoseerd. - Wanneer de geautomatiseerde dissectie is voltooid, verwijdert u de verzamelbuizen en de ontleedde monsterglaasjes van het podium en plaatst u ze respectievelijk in een buizenrek en een schuifrek.
OPMERKING: Vers ingevroren oogsten moeten direct in nucleïnezuurextractie worden genomen volgens de instructies van de fabrikant en vers ingevroren secties na dissectie moeten onmiddellijk H &E-gekleurd zijn met behulp van routineprotocollen voor bevroren secties. - Bak de nagesneden weefselglaasjes gedurende 30 minuten op 60 °C en bevlek vervolgens met H&E met behulp van routineprotocollen.
- Scan de post ontleed H &E gekleurde dia's op een hele dia imager met 20x vergroting en / of archief voor een referentie van welk weefsel niet is verzameld en blijft op de dia.
OPMERKING: Zie stap 1.5 hierboven voor alternatieve scanopties.
3. Nucleïnezuurextractie
- Pool en pelleteer het weefsel. Voer de nucleïnezuurextractie uit met behulp van een in de handel verkrijgbare kit en volg de instructies van de fabrikant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
FFPE en FF muis lever secties met gemetastaseerde colorectale kanker in xenografts werden geselecteerd. Secties werden H &E gekleurd (figuur 1A, E, I) en gescand op een hele dia imager met 20x vergroting. Een patholoog heeft tumorgebieden van belang digitaal geannoteerd en een masker werd gegenereerd met behulp van commerciële software en opgemaakt als een digitale png-referentieafbeelding (figuur 1B, F, J). Seriële 10 μm en 20 ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de toepassing van digitale annotatie en geautomatiseerde dissectie om tumorgebieden te ontleden van FFPE met een laag tumorgehalte of vers ingevroren weefsels voor tumorverrijking en gebruik in WES. Het combineren van digitale annotatie en maskercreatie met geautomatiseerde dissectie vermindert aanzienlijk de vereiste hands-on tijd en expertise die gebruikelijk zijn voor klassieke methoden van tumorverrijking, inclusief handmatige macrodissectie en LCM. Het protocol demonstreert...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio en Amy A Lo zijn werknemers en aandeelhouders van Genentech en Roche en Mana Javey en Emmanuel Naouri zijn werknemers en aandeelhouders van Roche.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Carmina Espiritu en Robin E. Taylor bedanken voor hun steun bij de ontwikkeling van geautomatiseerde dissecties, evenals het personeel van het Genentech Pathology Core Laboratory dat dit werk heeft ondersteund.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Geautomatiseerde kleuringsapparaat |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestiebuffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positief geladen microscoopglaasjes | Thermo Scientific | 6776214 |
Referenties
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48(2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13(2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482(2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
