Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitconforme dynamica speelt een fundamentele rol bij de regulatie van enzymatische katalyse, ligandbinding, allosterie en signalering, die belangrijke biologische processen zijn. Begrijpen hoe de balans tussen structuur en dynamiek de biologische functie regelt, is een nieuwe grens in de moderne structurele biologie en heeft verschillende technische en methodologische ontwikkelingen aangewakkerd. Onder deze, CPMG ontspanning dispersie oplossing NMR methoden bieden unieke, atomaire-resolutie informatie over de structuur, kinetiek, en thermodynamica van eiwit conformationele evenwicht optreden op de μs-ms tijdschaal. Hier presenteert de studie gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen en analyseren van een 15N ontspanningsdispersie-experiment. Als voorbeeld wordt de pijplijn voor de analyse van de μs-ms dynamiek in het C-terminal domein van bacteriën Enzym I getoond.
Inleiding
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) ontspanningsdispersie (RD) experimenten worden routinematig gebruikt om conformatieevenwicht te karakteriseren dat optreedt op de μs-ms tijdschaal door oplossing NMR spectroscopie1,2,3,4,5. In vergelijking met andere methoden voor onderzoek van conformatiedynamiek zijn CPMG-technieken relatief eenvoudig te implementeren op moderne NMR-spectrometers, vereisen ze geen gespecialiseerde monstervoorbereidingsstappen (d.w.z. kristallisatie, m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van het NMR-monster
- Druk een 2H,15N-labled monster van het eiwit van belang uit en zuiver het.
OPMERKING: Hoewel een 15N-gelabeld eiwitmonster kan worden gebruikt voor de verwerving van het CPMG RD-experiment, verhoogt perdeuteratie (waar mogelijk) de kwaliteit van de verkregen gegevens aanzienlijk. Protocollen voor de productie van perdeuterated eiwitten zijn beschikbaar in de literatuur13. - Buffer het gezuiverde eiwitmonster omwisselen tot een ontgaste NMR-buffer.
- Breng het NMR-monster over in de NMR-buis.
OPMERKING: De concentratie van het NMR-monster moet zorgv....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier beschreven protocol resulteert in de verwerving van RD-profielen voor elke piek in het 1H-15N TROSY-spectrum (figuur 3A). Op basis van de verworven RD-profielen is het mogelijk om de uitwisselingsbijdrage aan de 15N transversale ontspanning van elke backboneamidegroep te schatten (figuur 3A, 3B). Door de Rex op de 3D-structuur van het onderzochte eiwit te plotten, is het mogelijk om de structu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit manuscript beschrijft het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N RD-gegevens over eiwitten. Met name de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de meting van de NMR-gegevens en de analyse van de RD-profielen komen aan bod. Hieronder worden enkele belangrijke aspecten met betrekking tot de verwerving en analyse van RD-experimenten besproken. Voor een meer diepgaande beschrijving van het experiment en de gegevensanalyse wordt echter een z.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Wij verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door fondsen van NIGMS R35GM133488 en van de Roy J. Carver Charitable Trust aan V.V.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Gevoeligheid verbeteren |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8% puur, gebruikt bij het bereiden van NMR-monsters en gedeutereerd culturen |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Wordt gebruikt om eventuele luchtbellen of resterende vloeistof die op de wanden van de NMR-buis vastzit te verwijderen. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Verwerving van de NMR-gegevens |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modellering van de NMR-gegevens |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glas pasteur pipette om vloeibare monsters in NMR-buis over te brengen |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm dunne wand 7'' cilindrische glazen buis |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR-gegevensverwerking |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analyse van de NMR-gegevens |
| Topspin 3.2 (of nieuwer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisitie Software |
Referenties
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
