Methodenartikel

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

DOI:

10.3791/62398

⸱

14 februari 2022

 ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de verspreiding van antimicrobieel resistente infecties te vertragen en te voorkomen, is het dringend noodzakelijk om de antimicrobiële effecten op pathogenen kwantitatief te bepalen. Het duurt meestal dagen om de AST te voltooien met conventionele methoden op basis van de langdurige cultuur, en ze werken niet direct voor klinische monsters. Hier rapporteren we een snelle AST-methode die mogelijk wordt gemaakt door gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming van deuteriumoxide (D2O) metabole opname. Metabole opname van D2O in biomassa en de metabole activiteitsremming bij blootstelling aan antibiotica op het niveau van één bacterie worden gemonitord door SRS-beeldvorming. De single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) van bacteriën bij blootstelling aan antibiotica kan worden verkregen na een totaal van 2,5 uur monstervoorbereiding en -detectie. Bovendien is deze snelle AST-methode direct toepasbaar op bacteriële monsters in complexe biologische omgevingen, zoals urine of volbloed. SRS metabole beeldvorming van deuteriumincorporatie is transformerend voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een groeiende wereldwijde bedreiging voor de effectieve behandeling van infectieziekten1. Er wordt voorspeld dat AMR tegen 2050 nog eens 10 miljoen doden per jaar en $ 100 biljoen wereldwijd bbp-verlies zal veroorzaken als er geen actie wordt ondernomen voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën 1,2. Dit benadrukt de dringende behoefte aan snelle en innovatieve diagnostische methoden voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) van infectieuze bacteriën om de opkomst van antibioticaresistente bacteriën te vertragen en het gerelateerde sterftecijfer te verminderen3. Om het best mogelijke klinische resultaat te garanderen, is het cruciaal om binnen 24 uur effectieve therapie te introduceren. De huidige gouden standaardmethode, zoals schijfdiffusie of bouillonverdunningsmethode, vereist echter meestal ten minste 24 uur voor de pre-cubatieprocedure voor klinische monsters en een extra 16-24 uur om de resultaten van de minimale remmende concentratie (MIC) te verkrijgen. Over het algemeen zijn deze methoden te tijdrovend om een onmiddellijke beslissing voor infectieziektebehandeling in de kliniek te begeleiden, wat leidt tot het ontstaan en de verspreiding van antimicrobiële resistentie4.

Genotypische AST-methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde technieken5, zijn ontwikkeld voor snelle detectie. Dergelijke technieken meten de specifieke resistentie genetische sequenties om snelle AST-resultaten te verkrijgen. Ze zijn niet afhankelijk van tijdrovende celkweek; alleen specifieke bekende genetische sequenties met resistentie worden echter getest. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot verschillende bacteriesoorten of verschillende resistentiemechanismen. Ook kunnen ze geen MIC-resultaten leveren voor therapiebeslissingen 6,7. Bovendien zijn er nieuwe fenotypische methoden voor snelle ASAT in ontwikkeling om deze beperkingen te overwinnen8, waaronder microfluïdische apparaten 9,10,11,12,13, optische apparaten 14,15,16, fenotypische AST die de nucleïnezuren kwantificeert kopie nummer 17,18, en Raman spectroscopische methoden19, 20,21,22,23,24. Deze methoden verkorten de tijd om AST-resultaten te begeleiden, maar de meeste zijn alleen van toepassing op bacteriële isolaten, niet rechtstreeks op klinische monsters, en vereisen nog steeds langdurige pre-incubatie.

In dit werk presenteren we een methode voor snelle bepaling van de gevoeligheid van bacteriën in de urine en volbloed via monitoring van de cellulaire metabole activiteit door SRS-beeldvorming. Water (H2O) neemt deel aan de overgrote meerderheid van essentiële biomoleculaire syntheseprocessen in levende cellen. Als een isotopoloog van water, door middel van een enzymgekatalyseerde H/D-uitwisselingsreactie tussen het redox-actieve waterstofatoom in NADPH en het D-atoom in D2O, kan deuterium worden opgenomen in biomassa in een cel25,26. Een gedeutereerde vetzuursynthesereactie wordt gemedieerd door het deuterium gelabelde NADPH. De D2O-opname in reacties van aminozuren (AA's) resulteert in de gedeutereerde eiwitproductie26 (figuur 1). Op deze manier kunnen de nieuw gesynthetiseerde C-D-bindingsbevattende biomoleculen in enkele microbiële cellen worden gebruikt als een algemene metabole activiteitsmarker die moet worden gedetecteerd. Om de novo gesynthetiseerde C-D-bindingen uit te lezen, wordt Raman-spectroscopie, een veelzijdig analytisch hulpmiddel dat specifieke en kwantitatieve chemische informatie over biomoleculen biedt, veel gebruikt om antimicrobiële gevoeligheid te bepalen en de testtijd aanzienlijk te verkorten tot een paar uur 27,28,29,30 . Vanwege de inherente lage efficiëntie van het Raman-verstrooiingsproces is de spontane Raman-spectroscopie echter van lage detectiegevoeligheid. Daarom is het een uitdaging om real-time beeldresultaten te verkrijgen met behulp van spontane Raman-spectroscopie. Coherente Raman-verstrooiing (CRS), inclusief coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), heeft een hoge detectiegevoeligheid bereikt vanwege het coherente lichtveld om ordes van grootte te genereren die groter zijn dan die van spontane Raman-spectroscopie, waardoor snelle, specifieke en kwantitatieve chemische beeldvorming op het niveau van één cel 31,32,33,34,35 wordt weergegeven ,36,37,38,39.

Hier, op basis van ons meest recente werk40, presenteren we een protocol voor snelle bepaling van de metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid door femtoseconde SRS C-D beeldvorming van D2O opname van bacteriën in het normale medium, urine en volbloedomgeving op het niveau van één cel. Femtoseconde SRS-beeldvorming vergemakkelijkt het monitoren van de single cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) tegen antibiotica op het niveau van de enkele bacterie binnen 2,5 uur. De SC-MIC-resultaten worden gevalideerd door standaard MIC-test via bouillonmicroverdunning. Onze methode is toepasbaar voor het bepalen van antimicrobiële gevoeligheid van bacteriën urineweginfectie (UTI) en bloedbaaninfectie (BSI) pathogenen met een veel kortere testtijd in vergelijking met de conventionele methode, die de mogelijkheid opent voor snelle fenotypische AST in de kliniek op het niveau van één cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van menselijke bloedmonsters is in overeenstemming met de richtlijnen van de IRB van Boston University en de National Institutes of Health (NIH). Concreet zijn de exemplaren afkomstig van een bank en zijn ze volledig gedeïdentificeerd. Deze exemplaren worden niet beschouwd als menselijke proefpersonen door het bureau van de Institutional Review Board (IRB) aan de Universiteit van Boston.

1. Bereiding van de voorraadoplossing voor bacteriën en antibiotica

  1. Bereid de antibiotica (gentamicinesulfaat of amoxicilline) stamoplossing in een concentratie van 1 mg / ml opgelost in steriel1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of dimethylsulfoxide (DMSO) oplosmiddel in microbuizen van 1,5 ml. Los gentamicinesulfaat op in steriele PBS-oplossing en amoxicilline in steriel DMSO-oplosmiddel. Bewaar daarna de antibiotica-oplossing bij 2-8 °C zoals voorgesteld.
  2. Om D2O met kation-aangepaste Mueller-Hinton Broth (MHB) media te maken, voegt u 220 mg MHB-bouillonbasis toe aan 10 ml D2O om 100% D2O-bevattend medium te maken. Steriliseer de oplossing door te filteren met filters van 200 nm poriegrootte.
    OPMERKING: Gebruik dit protocol altijd voor het maken en steriliseren van mediumoplossingen in verdere stappen.
  3. Om bacteriële monsters voor te bereiden op SRS-beeldvorming, voegt u 2 ml normale MHB-media, die geen deuterium bevatten, toe aan een steriele kweekbuis met ronde bodem en vervolgens prewarmen bij 37 °C.
  4. Gebruik een steriele lus om één bacteriële (Escherichia coli BW 25113 of Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) kolonie uit de verse cultuur te selecteren op een tryptische soja-agarplaat. Hang het vervolgens op in de voorgewarmde kweekmedia en vortex voorzichtig om de bacteriesuspensie voor te bereiden.
  5. Incubeer bacteriën bij 37 °C in een shaker met 200 omwentelingen per minuut (rpm) totdat deze de logaritmische fase bereikt.

2. D2O-opnamebehandeling in aanwezigheid van antibiotica (figuur 2a)

  1. Controleer de bacteriële concentratie door de optische dichtheid (OD) te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.
  2. Verdun de bacteriële oplossing met behulp van het normale MHB-medium, dat geen deuterium bevat, om een uiteindelijke celconcentratie van 8 x 105 CFU / ml te bereiken. Vortex voorzichtig om de bacteriële cellen te mengen.
  3. Bereid 300 μL aliquots van de bacteriële oplossing in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.
  4. Voeg 4,8 μL antibioticum (gentamicine of amoxicilline) stamoplossing (1 mg/ml) toe aan de microbuis met 600 μL van de bacteriële oplossing, om de uiteindelijke antibioticaconcentratie op 8 μg/ml te brengen.
  5. Neem 300 μL oplossing uit de 8 μg/ml antibioticabevattende bacterieoplossing en voeg toe aan nog eens 300 μL bacteriële oplossing om een tweevoudige verdunde antibioticum- (4 μg/ml) bevattende bacterieoplossing te maken.
  6. Herhaal de tweevoudige seriële verdunning van de testantibiotica, gentamicine of amoxicilline, totdat de microbuis met de laagste concentratie (0,25 μg/ml) is bereikt en gooi 300 μL uit de buis. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.
    1. Laat één buis zonder antibiotica voor blanco controle. Dit zal de positieve controle zijn om de bacteriële metabole activiteit te inspecteren zonder antibioticabehandeling maar met D2O-behandeling.
    2. Laat één buis zonder antibiotica en geen D2O voor de negatieve controle.
  7. Incubeer het bacteriële aliquot met het bepaalde antibioticum (gentamicine of amoxicilline) dat MHB-medium bevat gedurende 1 uur.
  8. Bereid tijdens de incubatie een seriële verdunning van antibiotica met 100% D2O bevattend medium met dezelfde concentratiegradiënt van antibiotica bereid in stap 2.6. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.
  9. Voeg na 1 uur antibioticabehandeling respectievelijk 700 μL serieel verdund antibioticum en 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan de 300 μL antibiotica-voorbehandelde bacteriën in dezelfde antibioticaconcentratie (bereid in stap 2.6).
    1. Voeg bijvoorbeeld 700 μL 100% D2O-bevattend MHB-medium (met 8 μg/ml antibioticum) toe aan de 300 μL van 8 μg/ml antibiotica-voorbehandelde bacteriën. Breng op dezelfde manier over naar de overeenkomstige buizen van de volgende concentratie en homogeniseer door meerdere keren op en neer te pipetteren.
    2. Voeg 700 μL antibioticavrij 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan 300 μL antibioticavrije bacteriën (bereid in stap 2.6.1) als blanco controle.
    3. Incubeer bij 37 °C in een incubatieschudder bij 200 tpm gedurende nog eens 30 minuten.
      OPMERKING: In deze stap is de uiteindelijke concentratie van D2O in het medium voor de test 70%.
  10. Centrifugeer eerst het 1 ml antibioticum en het met D2O behandelde bacteriële monster bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en was vervolgens tweemaal met gezuiverd water. Ten slotte, bevestig monsters in 10% formaline-oplossing en bewaar ze bij 4 °C.

3. Bereiding van bacteriën in urineomgeving (figuur 2b)

  1. Om E. coli BW 25113 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.
  2. Controleer de bacteriële concentratie door de OD te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.
  3. Om de klinische UTI-monsters 14,18,41 na te bootsen, piekt u de E. coli-oplossing in 10 ml gedeïdentificeerde urine om een uiteindelijke celconcentratie van 10 6 CFU / ml te bereiken.
  4. Filter de E. coli-geprikte urine met behulp van een filter van 5 μm en verdeel vervolgens de bacteriële oplossing in 300 μL-aliquots in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL-aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.
  5. Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.

4. Bereiding van bacteriën in het bloedmilieu (figuur 2c)

  1. Om Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.
  2. Om de klinische bloedbaaninfecties monsters42,43 na te bootsen, spike P. aeruginosa in 1 ml gedeïdentificeerd menselijk bloed om een concentratie van 107 CFU / ml te bereiken.
  3. Voeg 9 ml steriel gezuiverd water toe om het bloed te lyseren.
  4. Filtreer het P. aeruginosa spiked bloed met behulp van een 5 μm filter. Oogst vervolgens bacteriën tot 1 ml volume door centrifugeren bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.  Voeg 9 ml voorverwarmde normale MHB toe aan de bacterie-oplossing en vortex voorzichtig. De uiteindelijke concentratie van bacteriën is 106 CFU / ml
  5. Verdeel de P. aeruginosa spiked bloedoplossing in 300 μL aliquots in zeven 1,5 ml microbuizen en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één 1,5 ml microbuisjes.
  6. Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.

5. SRS-beeldvorming van D2O metabole opname in een enkele bacterie

  1. Was 1 ml vaste bacterieoplossing met gezuiverd water en centrifugeer vervolgens op 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Verrijk de bacteriële oplossing tot ongeveer 20 μL.
  2. Deponeer de bacteriële oplossing op een poly-L-lysine gecoat coverglass. Sandwich en verzegel het monster voor SRS-beeldvorming.
  3. Beeld bacteriën op de C-D trillingsfrequentie bij 2168 cm-1 met behulp van een SRS microscoop.
    1. Voer de golflengte van de pomp in en stem deze af op 852 nm met behulp van de besturingssoftware op een computer.
    2. Meet het laservermogen met behulp van een vermogensmeter. Stel het vermogen van de pomplaser op het monster in op ~ 8 mW en het vermogen van de Stokes-laser op het monster op ~ 40 mW door de halfgolfplaat voor de laseruitgang aan te passen.
      OPMERKING: In de SRS-microscoop levert een instelbare femtosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 MHz de pomp (680 tot 1300 nm) en Stokes (1045 nm) excitatielasers.
  4. Door de schroeven van de reflectiespiegels af te stellen, de pomp- en Stokes-stralen ruimtelijk uit te lijnen en de twee stralen in een rechtopstaande microscoop te leiden die is uitgerust met een 2D galvo-spiegelsysteem voor laserscanning.
    1. Gebruik een 60x water onderdompeling objectief om de pomp en Stokes lasers op het monster te richten.
    2. Gebruik een oliecondensor om de signalen van het monster in voorwaartse richting te verzamelen.
    3. Gebruik een bandpass-filter om de Stokes-laser eruit te filteren voordat u deze in een fotodiode richt.
    4. Extraheer het gestimuleerde Raman-signaal door een lock-in versterker en detecteer de signalen door de fotodiode.
  5. Stel elke SRS-afbeelding in op 200 x 200 pixels en de pixel dwell-tijd op 30 μs in het bedieningspaneel van de software. De totale acquisitietijd voor één afbeelding is ~1,2 s. Stel de stapgrootte in op 150 nm, zodat de afbeeldingsgrootte ongeveer 30 x 30 μm2 is. Afbeelding van ten minste drie weergaven voor elk voorbeeld.

6. Beeldverwerking en data-analyse ( Figuur 3)

  1. Om de gemiddelde C-D signaalintensiteit te verkrijgen, opent en verwerkt u SRS-beelden met ImageJ-software.
  2. Converteer eerst SRS-afbeeldingen naar 8-bits typeafbeeldingen met omgekeerde kleuren door op Afbeelding | Type | 8-bits en vervolgens | bewerken Knoppen omkeren in de ImageJ-software.
  3. Filter vervolgens de afbeeldingen met Gaussiaanse vervaging door te klikken op Proces | Filters | Gaussische vervaging knoppen en stel de Sigma (Radius) in op 1.
  4. Gebruik de aanpassing van de afbeeldingsdrempel om het bacteriële gebied te selecteren. Klik op Afbeelding | | aanpassen Drempelwaarde om ervoor te zorgen dat de geselecteerde bacteriegrootten overeenkomen met die in de oorspronkelijke SRS-afbeeldingen. Elimineer kleine deeltjes door de groottedrempel aan te passen om de deeltjes te bepalen. Klik op Toepassen.
  5. Analyseer | toepassen Deeltjesanalyseknoppen om het gebied van bacteriën te labelen en te bepalen.
  6. Door op de knop Alles weergeven in de ROI-manager naar de oorspronkelijke onbewerkte SRS-afbeelding te klikken, labelt u hetzelfde bacteriegebied en bepaalt u de gemiddelde intensiteit van elk gegevenspunt door op de knop Meten in de ROI-manager te klikken.
  7. Omcirkel het achtergrondgebied in de oorspronkelijke SRS-afbeelding en meet de gemiddelde intensiteit van de achtergrond. De gemiddelde C-D-intensiteiten van elke bacterie worden verkregen door de intensiteit van het achtergrondsignaal af te trekken.

7. Kwantificering van antimicrobiële gevoeligheid via SC-MIC

OPMERKING: De afkapwaarde op 0,60 om de SC-MIC te bepalen, wordt vastgesteld volgens de statistische analyse van de SRS C-D-intensiteiten van de metabolisme-actieve en metabolisme-geremde omstandigheden voor bacteriën bij verschillende concentraties van blootstelling aan geneesmiddelen40. De C-D-intensiteiten voor de antibioticagevoelige en antibioticaresistente groepen werden voorzien van een normale verdeling.

  1. Zet de ROC-curve (Receiver Operating Characteristic) uit en evalueer de afkapdrempel op 0,60. Op basis van deze afkapwaarde kan de SC-MIC als indicator van de werkzaamheid van antibiotica worden gedefinieerd om de metabolisch inactieve en metabolisch actieve groep te bepalen.
  2. Om de SRS-beeldvormingsgegevens kwantitatief te analyseren, plott u de histogrammen van C-D-signaalintensiteiten voor elke bacteriegroep die wordt behandeld met de serieel verdunde antibioticaconcentratie. De gekleurde datapunten staan voor verschillende individuele bacteriën.
  3. Normaliseer de C-D-intensiteiten van de met antibiotica behandelde groep tot de gemiddelde intensiteit van de controlegroep zonder antibioticabehandeling. Bepaal de SC-MIC-resultaten van verschillende bacterie- en antibioticacombinaties door de SRS-signaalintensiteiten in het C-D-gebied versus verschillende concentraties antibiotica te kwantificeren met behulp van de afkapwaarde op 0,60.
  4. Valideer en vergelijk de SC-MIC-uitlezing met de MIC die is bepaald met behulp van conventionele bouillonmicroverdunningstest.
  5. Volgens het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wordt de gevoeligheidscategorie op basis van de SRS metabole beeldvormingsresultaten voor elke geteste bacteriestam geïnterpreteerd als "vatbaar", "resistent" of "intermediair".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het effect van incubatietijd op de opname van deuterium wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in het C-D (2070 tot 2250 cm-1) en C-H (2.800 tot 3.100 cm-1) gebied (figuur 4a). De time-lapse eencellige Raman-spectra van P. aeruginosa gekweekt in 70% D2O met medium vertonen een toenemende CD / CH-intensiteit gedurende de incubatietijd van 0 tot 180 min. (Figuur 4b) De toenemende C-D-abundantie in enkele micr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Snelle ASAT kan worden verkregen door de respons van bacteriële metabole activiteit op antibioticabehandeling te beoordelen met behulp van eencellige SRS metabole beeldvorming binnen 2,5 uur van het monster tot SC-MIC-resultaten. De respons van bacteriële metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid kan worden gedetecteerd door de metabole opname van D2O voor biomolecuulsynthese te monitoren met behulp van SRS-beeldvorming van C-D-bindingen. Omdat water alomtegenwoordig wordt gebruikt in levende cellen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH R01AI141439 naar J.-X.C en M.S, en R35GM136223 naar J.-X.C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187(2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681(2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217(2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335(2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648(2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452(2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148(2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870(2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278(2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Imaging van enkele bacteri nsnelle ASTbacteri le metabole activiteitSRS microscopieanalyse van klinische monstersPseudomonas aeruginosaEscherichia coli

Gerelateerde artikelen