We ontwikkelden geautomatiseerde computer vision software om exocytische gebeurtenissen te detecteren die worden gekenmerkt door pH-gevoelige fluorescentiesondes. Hier demonstreren we het gebruik van een grafische gebruikersinterface en RStudio om fusiegebeurtenissen te detecteren, spatiotemporale parameters van fusie te analyseren en weer te geven en gebeurtenissen in verschillende fusiemodi te classificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Timelapse TIRF-microscopie van pH-gevoelige GFP (pHluorine) verbonden aan blaasjes SNARE-eiwitten is een effectieve methode om exocytische gebeurtenissen in het celkweek van één blaasje te visualiseren. Om een onbevooroordeete, efficiënte identificatie en analyse van dergelijke gebeurtenissen uit te voeren, werd een computervisiegebaseerde aanpak ontwikkeld en geïmplementeerd in MATLAB. De analyse pijplijn bestaat uit een algoritme voor cel segmentatie en exocytische gebeurtenis identificatie. De computervisiebenadering omvat hulpmiddelen voor het onderzoeken van meerdere parameters van afzonderlijke gebeurtenissen, waaronder de halfwaardetijd van fluorescentiebederf en piek ΔF/F, evenals analyse van de frequentie van exocytose in hele cellen. Deze en andere parameters van fusie worden gebruikt in een classificatiebenadering om verschillende fusiemodi te onderscheiden. Hier voert een nieuw gebouwde GUI de analysepijplijn van begin tot eind uit. Verdere aanpassing van Ripley's K-functie in R Studio wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen geclusterde, verspreide of willekeurige voorkomen van fusiegebeurtenissen in zowel ruimte als tijd.
Inleiding
VAMP-pHluorine constructen of transferrine receptor (TfR)-pHuji constructies zijn uitstekende markers van exocytische gebeurtenissen, omdat deze pH-gevoelige fluoroforen worden gedoofd in het zure blaasje lumen en fluoresce onmiddellijk na fusie porie opening tussen het blaasje en plasmamembraan1. Na het openen van de fusieporiën vergaat fluorescentie exponentieel, met enige heterogeniteit die informatie over de fusiegebeurtenis onthult. Hier wordt een GUI-toepassing (Graphical User Interface) beschreven die automatisch exocytische gebeurtenissen detecteert en analyseert. Met deze applicatie kan de gebruiker automatisch exocytische gebeurteniss....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Kies datasets en directory
- Als u gegevenssets wilt selecteren voor analyse, klikt u op de knop Gegevenssets zoeken (afbeelding 2A, rood vak 1)om naar de map te navigeren waar gegevens worden gedeponeerd (bijvoorbeeld de map RawData). Gegevensbestanden vullen de gegevensbestanden automatisch in als een lijst. Er kan meer dan één gegevensset in de map staan.
- Klik op de knop Directory kiezen en selecteer de map (bijv. Test) waar geanalyseerde bestanden worden gedeponeerd (figuur 2A, rood vak 2) . Een set mappen en voltooid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier werd de GUI (Figuur 2A) gebruikt om exocytische gebeurtenissen te analyseren van drie VAMP2-pHluorine die neuronen uitdrukken bij 3 DIV met behulp van TIRF (totale interne reflectie fluorescentie) microscopie. E15.5 corticale neuronen werden geïsoleerd, gevolgd door transfectie met VAMP2-pHluorine en plating met behulp van de protocollen zoals beschreven in Winkle et al., 2016 en Viesselmann et al., 201111,12. De methodologie va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Houd er bij het gebruik van de exocytische detectie- en analysesoftware rekening mee dat het programma alleen compressie zonder verlies accepteert .tif bestanden als invoer. De .tif afbeeldingsbestanden kunnen 8-bits, 16-bits of 32-bits grijswaardenafbeeldingen (één kanaal) zijn. Andere afbeeldingsindelingen moeten vóór invoer worden geconverteerd naar een van deze typen. Ter referentie, voorbeelden die hier worden gebruikt, zijn 16-bits grijswaardenafbeeldingen.
Inherent aan het geautomatisee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren niets openbaar te maken.
Dankbetuigingen
We danken Dustin Revell en Reginald Edwards voor het testen van code en de GUI. De nationale instituten voor gezondheid ondersteunden dit onderzoek: waaronder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) en F31NS103586 (FLU).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referenties
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal orga....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
