Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Samenvatting

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Samenvatting

De maïsplanthopper, Peregrinus maidis, is een plaag van maïs en een vector van verschillende maïsvirussen. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven de triggering van RNA-interferentie (RNAi) in P. maidis door micro-injectie van dubbelstrengs RNA's (dsRNA's) in nimfen en volwassenen. Ondanks de kracht van RNAi zijn fenotypes die via deze techniek worden gegenereerd van voorbijgaande aard en missen ze langdurige Mendeliaanse overerving. Daarom moet de gereedschapskist van P. maidis worden uitgebreid met functionele genomische hulpmiddelen die de productie van stabiele mutante stammen mogelijk maken, waardoor de deur wordt geopend voor onderzoekers om nieuwe bestrijdingsmethoden in te zetten tegen deze economisch belangrijke plaag. In tegenstelling tot de dsRNA's die voor RNAi worden gebruikt, passeren de componenten die worden gebruikt in CRISPR / Cas9-gebaseerde genoombewerking en kiembaantransformatie echter niet gemakkelijk celmembranen. Als gevolg hiervan moeten plasmide-DNA's, RNA's en / of eiwitten in embryo's worden geïnjecteerd voordat het embryo cellulariseert, waardoor de timing van de injectie een kritieke factor voor succes is. Daartoe werd een op agarose gebaseerde legmethode ontwikkeld om embryo's van P. maidis-vrouwtjes met relatief korte tussenpozen te kunnen oogsten. Hierin worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire P. maidis-embryo's met CRISPR-componenten (Cas9-nuclease dat is gecomplexeerd met gids-RNA's), en resultaten van Cas9-gebaseerde gen knock-out van een P. maidis oogkleurgen, wit, worden gepresenteerd. Hoewel deze protocollen CRISPR/Cas9-genoombewerking in P. maidis beschrijven, kunnen ze ook worden gebruikt voor het produceren van transgene P. maidis via kiembaantransformatie door simpelweg de samenstelling van de injectie-oplossing te veranderen.

Inleiding

De maïsplanthopper, Peregrinus maidis, is een economisch belangrijke plaag van maïs ^1,2,3. Ze veroorzaken directe fysieke schade aan de plant, zowel tijdens het voeden met hun piercing-zuigende monddelen, als tijdens de voortplanting wanneer ze hun embryo's rechtstreeks in plantenweefsel leggen ^2,4. Ondanks de vele routes van directe schade aan gewassen, is de grootste impact die deze insecten hebben op de gezondheid van gewassen indirect, door op te treden als de vector van maïsmozaïekvirus (MMV) en maïsstreepvirus ^5,6. MMV is in staat om zich te vermenigvuldigen in het lichaam van zijn P. maidis-vector, waardoor het virus gedurende hun hele leven in individuele insecten kan blijven bestaan, zodat ze het virus kunnen blijven verspreiden naar nieuwe waardplanten ^7,8. De meest voorkomende methoden voor het bestrijden van P. maidis, en dus de virussen die het vectort, zijn insecticiden.

Helaas heeft wanbeheer van deze producten geleid tot de ontwikkeling van resistentie in het doelplaagorganisme en tot vervuiling van het milieu⁹. Daarom zijn nieuwe strategieën nodig om gewasverliezen door deze combinatie van insecten en virussen te verminderen. Eerder werk toonde aan dat RNA-interferentie (RNAi) een effectieve controlemethode zou kunnen zijn voor P. maidis omdat ze gevoelig zijn voor downregulatie in genexpressie, zelfs bij inname van dubbelstrengs RNA (dsRNA)¹⁰. De meest effectieve manier om dsRNA in het veld toe te dienen, is echter via de planten waarmee de insecten zich voeden; Vandaar dat gewassen nog steeds vatbaar kunnen zijn voor virussen die de insecten al bij zich dragen. Met de komst van CRISPR / Cas9-genoombewerking zijn nieuwe ongediertebestrijdingsstrategieën mogelijk, waaronder Cas9-gebaseerde gene drive^11,12, die kan worden gebruikt om de grootte van een plaagpopulatie te verkleinen^, of om die populatie te vervangen door individuen die resistent zijn tegen de virussen die ze vectoren.

De ontwikkeling en inzet van elk type gen-aandrijfsysteem vereist echter de ontwikkeling van transgene technieken. Dergelijke methoden waren niet nodig voor het uitvoeren van RNAi-experimenten bij P. maidis omdat dsRNA's en/of siRNA's verondersteld worden celmembranen te kunnen passeren vanwege de efficiëntie van RNAi in P. maidis^10,13. Dit geldt niet voor de DNA's en/of eiwitten die worden gebruikt in traditionele transgenese of in Cas9-gebaseerde genbewerking, die beide een voorloper zouden zijn van het creëren van insecten die een gene drive dragen. Om genbewerking of andere vormen van kiembaantransformatie te bereiken, worden deze DNA's en eiwitten idealiter micro-geïnjecteerd in embryo's tijdens het syncytiele blastodermstadium, voorafgaand aan wanneer het insectenembryo cellulariseert. Timing is van cruciaal belang, omdat de syncytiele fase het vroegste deel van de ontwikkeling is^14,15. Omdat P. maidis-vrouwtjes hun eieren bij voorkeur in plantenweefsel leggen, kan het extraheren van voldoende hoeveelheden precellulaire embryo's voor micro-injecties arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Daarom werden nieuwe technieken ontwikkeld om P. maidis-embryo's snel te verzamelen en te micro-injecteren voorafgaand aan cellularisatie.

Protocol

1. Opfok op kolonieniveau van P . maidis volwassenen

1. Plant minimaal vier potten maïs per week per opfokkooi, met 3-4 zaden per pot. Groei in een insectenvrije omgeving.
2. Wanneer planten ~ 5 weken oud zijn, plaats ze dan in een kooi van 30 cm x 30 cm x 60 cm.
3. Verkrijg een voldoende hoeveelheid P. maidis-volwassenen (~ 500) uit een onderzoekslaboratorium of in het wild en plaats in een insectenbestendige kooi met 9-12 maïsplanten (3-4 potten).
4. Houd de kolonie in een ininsectenkweekincubator op 25 °C (± 1 °C), met een luchtvochtigheid van ten minste 70% en een lichtcyclus van 14:10.
5. Om een leeftijdsgekalibreerde kolonie te genereren, verwijdert u alle initiële volwassenen na vier dagen eieren leggen en laat u de embryo's die in de kooi zijn gelegd op natuurlijke wijze uitkomen en verouderen.
6. Verplaats 5 weken oude P. maidis-insecten (volwassenen) naar verse maïsplanten voor wekelijkse subcultuur door te verzamelen met een aspirator (figuur 1). Laat de volwassenen vervolgens los in een schone kooi met verse maïsplanten. Om een constante aanvoer van jonge volwassenen voor experimentele doeleinden te behouden, bereidt u elke week verse leeftijdsgekalibreerde kooien voor.
7. Geef de potten in de kooien twee keer per dag water. Knip regelmatig stengels, verwijder rottend plantmateriaal en vervang het indien nodig door verse maïspotten.
   OPMERKING: Met goed onderhoud kan een kolonie ~ 5 weken duren (d.w.z. lang genoeg voor embryo's die in de kooi worden gelegd om volwassen te worden).

2. Eierlegkamer op basis van agarose

1. Maak eierverzamelschalen (ovipositiemedium) door 1% w/v agarose in water in schone petrischaaltjes van 100 mm x 15 mm te gieten. Bewaar het ovipositiemedium bij 4 °C nadat het is gestold.
2. Bereid 10% w / v sucrose-oplossing voor het voeden van de volwassenen. Bewaar de sucrose-oplossing bij -20 °C gedurende maximaal een maand.
3. Maak een kamer om de volwassenen vast te houden door een gat in de bodem van een beker van 1 oz te snijden (zie de materiaaltabel) en een scherm over het gat te lijmen voor luchtuitwisseling (figuur 2).
4. Snijd plastic paraffine wax film in 5 cm x 5 cm vierkanten; Zet 2 vierkanten opzij voor elk kopje.
5. Verzamel ~ 15 1 week oude volwassen vrouwtjes uit een leeftijdsgekalibreerde P. maidis-kolonie. Om vrouwtjes te selecteren, onderzoekt u de ventrale kant van de buik en zoekt u naar de legboor, die meestal donkerder is dan de rest van de buik (figuur 3). Houd volwassenen maximaal een uur in een conische injectieflacon van 15 ml als u meerdere eierlegkamers opzet. Koel de insecten kort op ijs voorafgaand aan het seksen en breng ze over naar de volwassen container.
   OPMERKING: Dit onderzoek kan zonder microscoop worden uitgevoerd. Volwassen vrouwtjes die tijd hebben gehad om te voeden en te paren, hebben meestal ook grotere buiken dan volwassen mannetjes en zijn volgzamer; daarom kunnen ze gemakkelijker worden geselecteerd uit een kooipopulatie.
6. Breng de vrouwtjes over in een volwassen container en sluit de beker af met 1 laag plastic paraffinewasfilm door deze gelijkmatig 3-4 keer de oorspronkelijke grootte uit te rekken (figuur 4A, B).
7. Breng 400 μL 10% m/v sucrose-oplossing aan op de bovenkant van de plastic paraffinewasfilmafdichting en voeg een tweede laag plastic paraffinewasfilm toe, waarbij de plastic paraffinewasfilm precies zoals hierboven wordt uitgerekt (figuur 4C, D).
   OPMERKING: De sandwich van uitgerekte plastic paraffinewasfilm zet de sucrose-oplossing onder druk, wat erg belangrijk is voor volwassen voeding, maar zal niet voorkomen dat vrouwtjes hun legboor helemaal doorboren in het ovipositiemedium.
8. Plaats de volwassen kamer op een eieropvangschaal met de plastic paraffinefilmzijde direct op het ovipositiemedium en wikkel de hele eierlegkamer met plasticfolie zonder de luchtgaten te bedekken, omdat deze nodig zijn voor luchtuitwisseling (figuur 5).
9. Incubeer elke eierlegkamer bij 25 °C met 70% vochtigheid en een lichtcyclus van 14:10.
10. Vervang dagelijks de sandwich van plastic paraffinewasfilm en 10% w / v sucrose-oplossing en verwijder al het water dat zich in de beker ophoopt.

3. Embryoverzameling en uitlijning in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid

1. Installeer een micromicroscoopgebaseerd microinjectiesysteem in een bevochtigde ruimte of kap (bevochtigde kap; Figuur 6) om ervoor te zorgen dat de werkomgeving ten minste 70% vochtigheid bereikt tijdens het micro-injectieproces.
2. Controleer het ovipositiemedium op eieren na de gewenste legperiode. Doe dit in een bevochtigde kap of een andere vochtige omgeving.
   OPMERKING: De legperiode die meestal wordt gebruikt, was 's nachts, van 18.00 tot 10.00 uur, en duurde ~ 16 uur.
3. Als er eieren in de agarose worden gelegd, gebruik dan een fijne tang om ze voorzichtig uit te graven en plaats ze op het oppervlak van de agarose om ze vochtig te houden (figuur 7A).
4. Breng een strook van 1 mm x 15 mm dubbelzijdige tape aan op een coverslip van 22 mm x 30 mm (figuur 7B). Plaats de afdekslip met de tapezijde naar boven op het ovipositiemedium (figuur 7C).
5. Pak elk afzonderlijk ei van het agaroppervlak en ga met een fijne borstel naar de dubbelzijdige tape. Verwijder alle eieren die volledig wit zijn of een zwarte kleur hebben. Gezonde eieren zullen de semi-transparante zijn.
6. Leg de banaanvormige eieren op hun kant, waarbij het grotere uiteinde op de dubbelzijdige tape is geplakt (figuur 7D).
   OPMERKING: Bewaar de eieren altijd in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid, zoals een petrischaal gegoten met een laag van 1% agar op de bodem.

4. Bereiding van CRISPR-reagentia en injectienaalden

1. Trek kwartsnaalden met behulp van een Flaming/Brown type micropipette puller.
2. Schuine de kwartsnaalden af met een micropipetafschuinder.
3. Gebruik dubbelzijdig plakband om getrokken naalden vast te zetten in een doorzichtige container, zoals een petrischaaltje, totdat ze klaar zijn voor gebruik.
4. Bereid de injectieoplossing door 0,5 μl Cas9-eiwit (5 μg/μl stockoplossing) en 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl stockoplossing; zie de materiaaltabel) te combineren met 1 μl fenolrode buffer in een eindvolume van 5 μl. Om deeltjes neer te slaan die de naald kunnen verstoppen, vortex de oplossing kort en centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid.
5. Vul de injectienaald op en zorg ervoor dat het injectiemengsel in de buurt van het taps toelopende uiteinde van de naald blijft. Verwijder eventuele bubbels uit de punt van de naald.
6. Plaats de teruggevulde naald voorzichtig in de naaldhouder en draai de roestvrijstalen kraag vast om de naald stevig op zijn plaats te houden tijdens micro-injectie.
7. Genereer een betrouwbare stroom injectieoplossing uit de naald door de afgeschuinde punt voorzichtig te strelen met een fijne, bevochtigde verfkwast, terwijl u met het injectiesysteem uitbarstingen van luchtdruk aan de naald geeft.
   OPMERKING: De naald is klaar voor injectie wanneer het injectiemengsel de punt in kleine hoeveelheden kan verlaten.

5. Microinjectie en zorg na injectie

1. Bereid een microinjectieplatform door een schone petrischaal van 100 mm x 15 mm te vullen met 1% agar om een vlakke laag agar te vormen die gelijk is met de bovenkant van de schaal.
2. Plaats een eerder geprepareerde coverslip met ~25 embryo's op het agarplatform (figuur 8A).
   OPMERKING: Alle injectiestappen moeten worden uitgevoerd in een bevochtigde kap (~ 70% vochtigheid).
3. Controleer de injectiedruk door de naaldpunt in een druppel water te plaatsen en de injectiecyclus te starten.
   OPMERKING: Een kleine hoeveelheid injectieoplossing moet in het water worden verspreid als de drukinstelling correct is (figuur 8B).
4. Steek de naald in het grotere uiteinde van het embryo en nader vanaf de linkerkant van de dekplaat (figuur 8C). Breng de injectie-oplossing in het ei en trek de naald er snel uit.
5. Nadat alle eieren zijn geïnjecteerd, plaatst u de dekplaat op het oppervlak van een nieuwe 1% agarschaal en brengt u de schaal over naar een vochtigheidskamer (figuur 9).

6. Broeden en uitkomen van embryo's

1. Zet de broedkamer gedurende 6 dagen in een broedmachine van 25 °C.
2. Breng eventuele overlevende embryo's met schoon water en een fijne borstel over in een petrischaal van 35 mm x 10 mm met met water bevochtigd filterpapier dat de bodem van de schaal bedekt. Sluit de petrischaal af met plastic paraffinewasfilm en houd deze op 25 °C om de embryo's uit te laten komen. Begin met het controleren van de embryo's 6 dagen na de injectie op overleving.
   OPMERKING: De eerste instar nimfen beginnen rond dag 8 uit te komen.
3. Breng nimfen met een fijne kwast over op een petrischaaltje met bladknipsels. Bedek de schaal en sluit af met plastic paraffinewasfilm.
4. Incubeer de verzegelde schaal met jongen op bladstekken gedurende 48 uur bij 25 °C.
5. Breng alle 2 dagen oude nimfen over van een injectieronde naar een opfokkooi met maïsplanten met behulp van een fijne borstel. Als injectees met zichtbaar fenotype in voldoende aantallen worden teruggevonden, kweek ze dan afzonderlijk om het herstel van de doeleigenschap in de volgende generatie te maximaliseren. Voer anders massaal paring uit van alle injectees.
   OPMERKING: Plaats de jongen voorzichtig in de krans van de maïsplant om beschutting te bieden en te zorgen voor een goede luchtvochtigheid van hun directe omgeving.
6. Kweek de insecten in de hierboven beschreven omstandigheden en zorg voor de juiste temperatuur, vochtigheid en regelmatige overdrachten naar verse maïsplanten.
7. Screen nakomelingen op verwachte fenotypen. Plaats individuen die het gewenste fenotype vertonen in hun eigen kooi om homozygote lijnen vast te stellen.

Resultaten

De legkamer voor eieren is speciaal ontworpen om P. maidis-vrouwtjes in staat te stellen zich te voeden terwijl ze in een beschermend medium zitten waaruit hun eieren gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen. Met behulp van deze methode werden voldoende hoeveelheden precellulaire embryo's teruggevonden voor micro-injectie met DNA, RNA en/of eiwitten. Volwassen P. maidis-vrouwtjes leggen meestal eieren in het bladweefsel van de maïsplanten, waardoor het een uitdaging is om in korte tijd voldoende eieren te krijgen, omdat het veel bladdissectie vereist. De kunstmatige eierlegomgeving biedt een oplossing om deze problemen te overwinnen. Zoals te zien is in tabel 1, werden in 4 weken tijd 6.483 eieren verzameld van in totaal 645 vrouwtjes. Vrouwtjes beginnen meestal met het leggen van eieren na dag 2 en leveren de meeste eieren van dag 4 tot dag 6. De ovipositieactiviteit vertraagde op dag 9. Elke ovipositiekamer werd op vrijdag opgezet en van zondag tot de volgende zondag gecontroleerd op eieren. Volgens dit schema konden de meeste eieren worden verzameld voor micro-injecties tijdens de werkweek.

De eerste praktische toepassing van dit eilegsysteem was het testen van de werkzaamheid van Cas9-gemedieerde gen knock-out, met behulp van de P. maidis ortholoog van het oogkleurgen, wit (Pmw), als doelwit. Van mutaties in wit is bekend dat ze leiden tot aanzienlijk verlies van oogpigmentatie bij andere insectensoorten, en wit is celautonoom, waardoor mutaties kunnen worden gedetecteerd bij geïnjecteerde individuen^16,17. Om de kans te vergroten dat zelfs een kleine mutatie kan leiden tot functieverlies, werden gids-RNA's ontworpen om binnen het gebied van de ATP-bindende cassette te snijden, wat nodig is voor witte functie¹⁶. P. maidis-embryo's werden geïnjecteerd met ofwel 20% fenolrood (injectiebuffer), injectiebuffer met Cas9 in een eindconcentratie van 800 ng / μL (Cas9-controle), of Cas9 in injectiebuffer samen met drie gids-RNA's toegevoegd in een concentratie van elk 400 ng / μL. De combinatie van drie geleiders binnen één injectiemix was bedoeld om de kansen op het genereren van mutanten verder te maximaliseren, zowel door een grote deletie te creëren als door te compenseren voor de mogelijkheid dat een enkele gids niet effectief zou kunnen zijn voor het snijden. De ontwikkelingssnelheden voor elke behandeling waren vergelijkbaar (tabel 2), waarbij 50-60% van de geïnjecteerde personen tekenen van ontwikkeling vertoonde. De uitkomstpercentages voor de buffer- en Cas9-controles waren ook vergelijkbaar; de broedpercentages van individuen die de driegeleidersmix kregen, waren echter relatief lager. Op dit moment is het onduidelijk of de verminderde overleving het gevolg is van het verlies van de witte functie of het gevolg van onbedoelde gevolgen van de driegeleidersmix, zoals off-target effecten (zie de discussiesectie). Geen van de personen met volledig verlies van oogpigmentatie (d.w.z. volledige knock-out) kwam echter uit en geen van de nakomelingen van geïnjecteerde personen had witte ogen. De on-target werkzaamheid van Cas9-gebaseerde mutagenese werd op twee manieren geverifieerd. Eerst werden injectees gescreend op verlies van oogpigmentatie.

Van de 71 geleide-geïnjecteerde individuen die zich ontwikkelden, vertoonden 23 een zekere mate van pigmentverlies (figuur 10) en 9 van die individuen kwamen uit, wat resulteerde in een knock-outpercentage van ≥32%. Bij beide controlebehandelingen werd geen oogpigmentverlies waargenomen. Ten tweede werden chromosomale mutaties bevestigd via polymerasekettingreactie (PCR)¹⁸ en sequencing¹⁹. Omdat een mutantenlijn niet kon worden teruggevonden, werd genomisch DNA geanalyseerd uit pools van embryo's die waren geïnjecteerd met de driegeleidersmix of buffer. De driegeleidermix zal naar verwachting ~ 180 basenparen uit de witte locus verwijderen. Dit is te zien in de PCR-producten die zijn versterkt uit genomisch DNA dat is geïsoleerd uit geïnjecteerde individuen, evenals de bijbehorende sequentiegegevens die uit die producten zijn gegenereerd (figuur 11). Dit gecombineerde bewijs geeft aan dat embryo's werden geïnjecteerd voordat cellularisatie plaatsvond.

Figuur 1: Aspirator. Een effectieve aspirator kan worden geassembleerd door een vacuümpomp bij de inlaat, via plastic buizen, aan een 15 ml plastic conische buis te bevestigen. Ongeveer 0,5 cm moet voorzichtig van de bodem van de conische buis worden verwijderd. Een watje moet in de conische buis worden geplaatst, over de opening van de plastic buis, om P. maidis-volwassenen te vangen terwijl ze worden verzameld en ze uit de vacuümpomp te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Bouw van containers voor volwassenen. (A) De benodigde benodigdheden (met de klok mee van linksboven): scherm, heet lijmpistool, scheermesje, 1 oz container. (B) Een groot gat moet worden gesneden in de bodem van de 1 oz container, en een vierkant van het scherm wordt net groot genoeg gesneden om dit gat te bedekken. (C) Het scherm wordt vervolgens met hete lijm over het gat gelijmd. (D) Zodra de lijm is aangebracht, moet overtollig gaas worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Sexing P. maidis volwassenen. De ventrale zijden van mannelijke (links) en vrouwelijke (rechts) P. maidis volwassenen worden getoond. De legboor, zichtbaar over de vrouwelijke buik, is de duidelijkste indicator van het geslacht van een persoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Verzegeling van volwassenen in containers . (A) Een vierkant van 5 cm x 5 cm plastic paraffinefilm. (B) De film moet gelijkmatig worden uitgerekt tot 3-4 keer de oorspronkelijke grootte. (C) Zodra volwassenen in de container voor volwassenen zijn geplaatst, moet de uitgerekte film over de opening worden geplaatst om de volwassenen vast te zetten. Een druppel van 400 μL van 10% m/v sucrose-oplossing moet vervolgens op de film worden geplaatst. (D) Om voldoende voedingsdruk voor de volwassenen te bieden, moet een tweede vierkant van 5 cm x 5 cm plastic paraffinefilm op dezelfde manier worden uitgerekt en over de druppel sucrose worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Opzetten van een ovipositiekamer. (A) De benodigde benodigdheden (met de klok mee van linksboven): plasticfolie, een voltooide container voor volwassenen (met volwassenen) en een petrischaal met 1% agarose (ovipositiemedium). (B) De recipiënt voor volwassenen moet op de agarose worden geplaatst met de plastic paraffinefolie/10% sucrose "sandwich" direct op het ovipositiemedium. (C) Plasticfolie wordt gebruikt om de houder voor volwassenen aan het ovipositiemedium te bevestigen. Dit voorkomt dat het medium te snel uitdroogt. (D) Er moet voor worden gezorgd dat het scherm van de container voor volwassenen niet wordt bedekt, zodat de luchtverversing nog steeds kan doorgaan. (E) Schema van de ovipositiekamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Bevochtigde kap. Een kap uitgerust met een luchtbevochtiger is rond de injectiekijker geplaatst om de luchtstroming te minimaliseren en de luchtvochtigheid te handhaven terwijl de embryo's worden behandeld. Flappen kunnen over de ingang worden gevouwen nadat de werknemer op zijn plaats is, om te helpen bij het handhaven van de juiste luchtvochtigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Verzamelen van embryo's ter voorbereiding op injecties . (A) Embryo's die in het ovipositiemedium zijn afgezet. Een paar fijne tangen worden gebruikt om embryo's uit het medium te halen en op het oppervlak te plaatsen. (B) Een smalle strook van 1 mm x 15 mm dubbelzijdige tape op een coverslip van 22 mm x 30 mm. (C) De dekplaat kan op het ovipositiemedium worden geplaatst om embryo's gemakkelijk van het oppervlak van het medium naar de tape op de coverslip over te brengen. (D) P. maidis-embryo's zijn banaanvormig, waarbij het ene uiteinde smaller is dan het andere (smal uiteinde aangegeven met rode pijlkop; breder uiteinde aangegeven met gele pijlkop in voorbeeldembryo). Het brede uiteinde van het embryo moet op de tape worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Injectie . (A) Het injectieplatform is een petrischaaltje dat tot de rand gevuld is met 1% agar. De coverslip met een strook tape die embryo's bevat, moet direct op het oppervlak van het injectieplatform worden geplaatst. (B) De injectiedruk moet worden getest voordat embryo's worden geïnjecteerd door een kleine hoeveelheid injectieoplossing in een druppel water te "injecteren". Deze methode kan ook op elk moment tijdens het injectieproces worden gebruikt om de naald op verstoppingen te controleren. (C) Embryo's moeten worden geïnjecteerd door de naald in het grotere uiteinde van het embryo te steken. De injectieoplossing moet zichtbaar zijn als de injectie succesvol was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Zorg na injectie . (A) Nadat alle embryo's op een dekplaat zijn geïnjecteerd, moet de deklaag in een verse petrischaal met 1% agarose worden geplaatst. (B) De petrischaal met de dekplaat kan vervolgens in een vochtigheidskamer (zoals de afgebeelde) worden bewaard totdat de embryo's uitkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Pmw knock-out fenotype. (A) Age-matched control en (B) Pmw knock-out embryo's, met zich ontwikkelende ogen aangegeven door zwarte pijlpunten. Het embryo in B is mozaïek, omdat een kleine streep pigmentatie te zien is. (C) Leeftijdsgematchte controle en (D) Pmw knock-out hatchlings, met inzetstukken die een andere hoek op de ogen laten zien. Het jong in D is ook mozaïek. Een witte pijl wijst naar een gebied in de hoofdafbeelding dat verlies van pigmentatie laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Pmw knock-out volgorde. (A) Model op schaal van Pmw-mRNA , gemarkeerd in stappen van 500 bp, met locaties van gRNA-bindingsplaatsen aangegeven: G1, blauw; G2, geel; G3, roze. Eventuele frameverschuivingsmutaties die op dit punt worden gegenereerd, zullen het grootste deel van het vertaalproduct verstoren. (B) Genomische context van gRNA-sites, allemaal in één exon (vetgedrukte tekst met hoofdletters). Hulplijnbindingsplaatsen worden gemarkeerd in dezelfde kleuren als A en PAMs worden onderstreept. Spanwijdte is ~300 bp. De in-frame vertaling van het exon is hierboven weergegeven, als eenletterige afkortingen in hoofdletters. Twee motieven die specifiek zijn voor oogpigmenttransporters zijn gemarkeerd. Het CDEPT-motief van het Walker B-functionele domein is in paars verpakt en het IHQP-motief van het H-loop-domein is in het groen gekaderd. Beide domeinen zijn van cruciaal belang voor de ATP-transporterfunctie. (C) Het pmw-doelgebied werd versterkt met behulp van twee PCR-rondes. Het tweede-ronde product werd onderzocht op een gel voor bewijs van grootteverschuiving als gevolg van succesvolle verwijdering van het gebied tussen de gidsen. Rijstroken: L = 100 bp ladder; 1 = PCR-waterbeheersing; 2 = Buffergeïnjecteerde eieren; 3-4 = twee afzonderlijke sets eieren geïnjecteerd met driegeleidermix. Alleen embryo's die de driegeleidersmix ontvingen, produceerden zowel de WT-band (rode pijl) als de band die het resultaat was van een volledige excisie (witte pijl). (D) Om de identiteit van de onderste (witte pijl) band te bevestigen, werd dit DNA gezuiverd, gekloond en gesequenced. De bovenste regel is de wild-type reeks. De andere twee regels zijn sequenties van twee klonen. Drie extra klonen kwamen overeen met de onderste volgorde. Blauwe markering geeft de bindingsplaats van Gids 1 aan, terwijl roze markering de bindingsplaats van Gids 3 aangeeft. In beide allelen is het hele gebied tussen deze twee gidssites verwijderd. Afkortingen: Pmw = Peregrinus maidis wit gen; gRNA = gids-RNA; PAM = protospacer aangrenzend motief; ATP = adenosinetrifosfaat; PCR = polymerasekettingreactie; WT = wild-type; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Set	# kopjes	# van vrouwtjes in elke kop	# van eieren								Totaal # eieren
			Dag 2	Dag 3	Dag 4	Dag 5	Dag 6	Dag 7	Dag 8	Dag 9
1	10	15	0	26	166	355	530	193	91	37	1398
2	15	15	22	238	489	699	520	379	203	58	2608
3	8	15	0	57	230	190	116	80	34	1	708
4	10	15	0	226	446	519	301	179	24	15	1710
Totaal	43	15	23	547	1331	1763	1467	831	352	111	6483

Tabel 1: Representatieve eierverzamelingen uit kunstmatige ovipositieomgeving. Gegevens van vier sets eierverzamelbekers worden getoond, met eierlengtes die beginnen op de tweede dag na het instellen en doorlopen tot en met de negende dag.

Injectie behandeling	Totaal geïnjecteerd	Totaal ontwikkeld	Totaal gearceerd	Ontwikkelingspercentage (%)	Broedpercentage (%)
Buffer	39	20	12	51	31
Cas9	39	24	14	61	36
Cas9 + Pmw gRNA's	121	71	28	59	28

Tabel2: Overlevings- en knock-outpercentages van injecties van 3 verschillende injectiemixen.

Discussie

Eierlegkwaliteit en voeding
Onlangs verkregen onderzoekers die werkten met een verwante soort, Nilaparvata lugens, de eieren die ze gebruikten voor micro-injecties rechtstreeks van het blad, waarbij de geïnjecteerde eieren in het bladweefsel bleven totdat ze uitkwamen¹⁷. Hoewel deze op bladeren gebaseerde methode een meer natuurlijke omgeving bood voor embryonale ontwikkeling, verhoogde het ook de kans op infecties en op eischade tijdens het verwijderingsproces. Het kunstmatige ovipositiesysteem dat hier wordt gepresenteerd, zorgt voor een meer uniforme omgeving en vermindert de kans op schade aan de eieren door hantering. Door de ovipositiebekers op vrijdag op te zetten, werd het grootste deel van de oviposited eieren verzameld tijdens een typische werkweek, ten voordele van degenen die het micro-injectiewerk deden. Een voorbehoud bij deze methode is echter dat het gebrek aan voedingsstoffen in het 10% sucrose-oplossingsdieet uiteindelijk de gezondheid van de insecten zal beïnvloeden, en vrouwtjes in de kopjes beginnen meestal al na 10 dagen af te sterven. De eikwaliteit begint ook na 6 dagen af te nemen, zoals blijkt uit een toename van dode of ongezond uitziende eieren. Als gevolg hiervan is het belangrijk om selectief te zijn van de eieren die worden gebruikt voor micro-injecties en om de vrouwtjes niet na dag 6 te houden.

Overlevingskans en luchtvochtigheid
Twee factoren lijken van cruciaal belang te zijn voor de embryonale overleving door het micro-injectieproces. Het meest uitdagende aspect van het hanteren van P. maidis-embryo's is voorkomen dat ze uitdrogen na verwijdering uit het ovipositiemedium en tijdens micro-injectie . Omdat de eieren meestal in plantenweefsel worden gelegd, missen ze een adequate schaal om uitdroging te voorkomen. Zelfs in de bevochtigde kap gingen hele sets eieren verloren door uitdroging. Een te hoge luchtvochtigheid kan echter ook van invloed zijn op de micro-injecties als water zich ophoopt op de dubbelzijdige tape of op de scope. Helaas was uitdroging van eieren meestal niet gemakkelijk op te merken tijdens het micro-injectieproces en ze leken vaak normaal tot 2 of 3 dagen later, toen ze volledig transparant werden en geen tekenen van ontwikkeling vertoonden.

Ook de kwaliteit van de naald blijkt een belangrijke rol te spelen bij de overleving. De naald moet worden afgeschuind om onnodige schade aan het ei te minimaliseren. Wanneer de naald is geblokkeerd, met behulp van de opruimfunctie op de injector terwijl u de punt van de naald voorzichtig streelt met een bevochtigde verfkwast (zie stap 4.7), wordt de naald meestal teruggebracht naar een functionele toestand. Hoe dan ook, het wordt aanbevolen om slechts kleine hoeveelheden injectie-oplossing (~ 0,25 μL) in elke naald te doen en om de paar dia's (~ 50-60 eieren) over te schakelen naar een nieuwe naald om ervoor te zorgen dat de naaldkwaliteit gedurende het injectieproces wordt gehandhaafd.

Succesvolle generatie van een knock-out fenotype
Om de geslachtscellen met succes te transformeren, moeten embryo-micro-injecties meestal zo vroeg mogelijk vóór de cellularisatie worden uitgevoerd. Afhankelijk van de insectensoort varieert het tijdvenster voor het voltooien van de micro-injecties van slechts een paar uur tot zo lang als een volledige dag^14,15,20. Het is nog onduidelijk wanneer P. maidis embryo's cellularisatie ondergaan. Cas9-gemedieerde knock-out werd getest op embryo's zo jong als 4 uur na het leggen van eieren (pel) tot maar liefst 16 uur pel, en de verwachte fenotypes werden waargenomen in alle experimenten, wat suggereert dat alle micro-injecties werden uitgevoerd binnen het precellurisatievenster.

De P. maidis ortholoog van het oogkleurgen, wit, werd geselecteerd omdat het knock-out fenotype naar verwachting gemakkelijk te screenen zou zijn bij injectees vanwege zijn cel-autonome aard. Inderdaad, zoals verwacht, waren zowel mozaïek als totale knock-outs duidelijk identificeerbaar bij embryo's die het injectiemengsel met Cas9 en gids-RNA's ontvingen. Helaas kwamen er geen injectees met volledige knock-out uit en een massale paring van overlevende injectees slaagde er niet in om witogige nakomelingen te genereren. Een mutantenlijn werd later echter met succes gegenereerd door zich te richten op een ander gen (Klobasa et al., in uitvoering). Dit zou suggereren dat het falen om een witte mutantlijn vast te stellen hoogstwaarschijnlijk te wijten is aan off-target effecten (d.w.z. Cas9 die belangrijke regio's elders in het genoom snijdt) die een nauw verbonden dodelijke mutatie genereren, of aan een onvoorspelbare kritische rol voor wit in P. maidis.

Fenotypische en moleculaire gegevens (figuur 8 en figuur 9) bevestigen dat een significante knock-out in de witte locus werd gecreëerd in een monster van geïnjecteerde embryo's, wat zou resulteren in totaal verlies van genfunctie. Bovendien, hoewel mutaties in wit levensvatbaar zijn bij sommige soorten, is er een precedent voor verminderde witte activiteit die schadelijk is^21,22. Dat gezegd hebbende, off-target effecten kunnen niet volledig worden uitgesloten. Het voorspellen van waarschijnlijke off-targets vereist nauwkeurige genoomsequentiegegevens²³, wat de huidige toestand van genomische bronnen in P. maidis op dit moment onmogelijk maakt. Hoe dan ook, met deze nieuwe methoden kan het testen van andere doelgenen vol vertrouwen worden gedaan, zelfs in de richting van meer traditionele transgenese in een poging om nieuwe genetische hulpmiddelen naar deze verderfelijke plaag te brengen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 oz Containers	Dart	P100N	Volwassen container voor het leggen van eieren setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-103	Dient als opvangbuis op vacuüm aspirator setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-106	Voor het maken van 10% sucorose oplossing en voor het vasthouden van volwassenen bij het koelen voorafgaand aan screening
Aspirator	Bioquip	1135A	Voor het hanteren van planthoppers
Vacuum Aspirator	Fischer Technical	LAV-3	Vacuum voor het afzuiging van grotere aantallen insecten
Blue Spectrum LED Lights	Home Depot	GLP24FS/19W/LED	Kweeklampen voor in potten geplaatste maïsplanten waar planthoppers zich op voeden
Cas9	TrueCut Cas9 Protein v2	A36498	Endonuclease voor het snijden van planthopper genen
Clear Vinyl Tubing	Home Depot	3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.	Verbindt opvangbuis met pomp op vacuüm aspirator setup
Corn planthoppers	North Carolina State University	N/A	Aanvraag van Dr. Anna Whitfield's lab
Cotton balls	Genessee	51-101	Dient als filter/insecten vanger in opvangbuis op vacuüm aspirator setup
Double sided tape	Scotch Double Sided Tape	NA	Houd eieren voor micro-injectie
Early Sunglow corn	Park Seed Company	05093-PK-N	Maïs voor het grootbrengen van planthoppers
epTIPS Microloader Tips	Eppendorf	C2554691	Terugvullen naald laadtips
Femtojet Microinjection System	Eppendorf	5247	Regelt injectiedruk (12-20 psi, afhankelijk van naald bore grootte)
Nutri-Fly Drosophila Agar	Genessee	66-103	Substraat voor alles behalve eierleggende schaal
Fine forceps	Bioquip	4731	Ei handelen
General Purpose LE Agarose	Apex	20-102	Substraat in eierleggende schaal (ovipositiemedium)
Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA-gidsen voor het targeten van planthopper white gen
Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA-gidsen voor het targeten van planthopper white gen
Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA-gidsen voor het targeten van planthopper white gen
Humidifyer	Homedics	UHE-CM45	Voor het bieden van vochtigheid in bevochtigde kap
Humidity chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101	Voor het vasthouden van geïnjecteerde embryo's tot het uitkomen
Insect rearing cages	Bioquip (speciale bestelling)	Dicht bij 1450 L (heeft kunststof voorkant en gaasweefsel zijden)	Kooi voor planthoppers op maïs
Laser-based Micropipiette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Voor het maken van injectienaalden / Warmte = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M165 FC	Planthopper screening
Microinjection Scope	Leica	MZ12-5	Micro-injectiescoop uitgerust met een XY-podium
Micromanipulator	Narishige	MN-151	Voor het positioneren van micro-injectienaald
Micropipette beveler	Sutter Instruments	FG-BV10-D	Voor het bevelen van injectienaalden / Gebruikte 'fijne' gegradeerde plaat op 20° hoek
Microscope Stage	AmScope	GT100 X-Y Gliding Table	Voor het positioneren en verplaatsen van embryo's onder de microscoop
Miniature Paint Brush	Testor #2 8733	Verkocht in 3-pack 281206	Fijne verfpenselen voor embryo behandeling
Needle Holder	Narishige	HI-7	Voor het vasthouden van de micro-injectienaald
Percival Incubator	Percival	I41VLH3C8	Grootbrengen van injecties tot uitkomen
Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	89038-968	Agarschaal maken voor ei-leg
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit	Promega	A1360	Cloning Pm white doelwit
Phenol Red	Sigma	143-78-8	Micro-injectie buffer
Plain Microscope Slides or coverslip	Fisher Scientific	12-549-3	Houd eieren voor micro-injectie
Plasmid DNA Midi Kit	Zymo	D4200	Zuivering van injectie-klare plasmide DNA's
Plastic paraffin film	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	Rol grootte 4 in. x 125 ft
Plastic wrap	Glad ClingWrap Plastic Wrap	NA	Wickel de gehele ei-leg kamer
Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmol DNA Oligo	Eerste-ronde Primer voor versterking over doelwit binnen het Pm white gen
Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT	IDT	25 nmol DNA Oligo	Eerste-ronde Primer voor versterking over doelwit binnen het Pm white gen
Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmol DNA Oligo	Tweede-ronde Primer voor versterking over doelwit binnen het Pm white gen
Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmol DNA Oligo	Tweede-ronde Primer voor versterking over doelwit binnen het Pm white gen
Quartz capillaries	Sutter Instruments	QF100-50-10	Voor het maken van micro-injectienaalden / O.D.