Methodenartikel

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62435

⸱

12 april 2021

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China, 510060

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Samenvatting

Retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van onomkeerbare blindheid zonder effectieve behandeling. Pluripotente stamcellen die het potentieel hebben om te differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels, houden enorme beloften in voor patiënten met deze ziekten en vele mogelijkheden in ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Het inductieproces van hPSC's naar retinale cellen is echter ingewikkeld en tijdrovend. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinaal inductieprotocol om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren, geschikt voor verschillende menselijke pluripotente stamcellen. Dit protocol wordt uitgevoerd zonder de toevoeging van retinoïnezuur, wat de verrijking van kegelfotoreceptoren ten goede komt. Het voordeel van dit protocol is de kwantificering van EB-grootte en platingdichtheid om de efficiëntie en herhaalbaarheid van retinale inductie aanzienlijk te verbeteren. Met deze methode verschijnen alle belangrijke retinale cellen sequentieel en vatten ze de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling samen. Het zal downstream-toepassingen vergemakkelijken, zoals ziektemodellering en celtherapie.

Inleiding

Retinale degeneratieve ziekten (ED's), zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en retinitis pigmentosa (RP), worden gekenmerkt door de disfunctie en dood van fotoreceptorcellen en leiden meestal tot onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen zonder effectieve manieren om te genezen1. Het mechanisme dat aan deze ziekten ten grondslag ligt, is grotendeels onbekend, deels als gevolg van een gebrek aan menselijke ziektemodellen2. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke vorderingen geboekt in de regeneratieve geneeskunde door middel van stamceltechnologie. Veel onderzoekers, waaronder wijzelf, hebben aangetoond dat menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), inclusief menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), kunnen differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels door verschillende differentiatiebenaderingen3,4,5,6,7,8,9,10, 11, biedt een enorm potentieel in ziektemodellering en celtherapie12,13,14.

Het inductieproces van hPSC's naar retinale cellen is echter zeer gecompliceerd en tijdrovend met een lage herhaalbaarheid, wat onderzoekers met rijke ervaring en hoge vaardigheden vereist. Tijdens het complexe en dynamische inductieproces zullen een aantal factoren de opbrengst van retinale weefselsbeïnvloeden 15,16,17. Ook variëren verschillende inductiemethoden vaak aanzienlijk in timing en robuuste expressie van retinale markers, wat de monsterverzameling en gegevensinterpretatie kan verstoren3. Daarom zou een eenvoudig protocol van retinale differentiatie van hPSC's met stapsgewijze begeleiding in trek zijn.

Hier, op basis van onze gepubliceerde studies18,19,20,21,wordt een geoptimaliseerd retinale inductieprotocol beschreven om retinale organoïden (RO's) te genereren met rijke kegelfotoreceptoren van hPSC's, waarvoor geen supplement van retinoïnezuur (RA) nodig is. Dit protocol richt zich op de beschrijving van de meerstappenmethode om neuraal netvlies en RPE te genereren. EB-vorming is het essentiële onderdeel van de vroege inductiefase. Zowel de grootte als de platingdichtheid van EB's zijn kwantitatief geoptimaliseerd, wat de opbrengst van retinale weefsels wetenschappelijk verbetert en de herhaalbaarheid bevordert. In het tweede deel van de inductie organiseren optische blaasjes (OVs) zichzelf in de therapietrouwcultuur en vormen zich ERRO's in de suspensiecultuur; de tijdscursussen en efficiëntie van dit deel variëren aanzienlijk in verschillende hPSC-lijnen. De rijping en specificatie van retinale cellen in RA's vindt voornamelijk plaats in het middelste en late stadium van inductie. Zonder de toevoeging van RA kunnen volwassen fotoreceptoren met zowel rijke kegels als staafjes worden geproduceerd.

Het doel van dit protocol is om elke stap kwantitatief te beschrijven en te detailleren voor onervaren onderzoekers om te herhalen. Verschillende hPSC-lijnen zijn met succes geïnduceerd in RO's door dit protocol met een robuuste opbrengst van kegelrijke retinale weefsels en een hoge herhaalbaarheid. HPSC-afgeleide RO's met dit protocol kunnen de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling in vivosamenvatten en op lange termijn overleven, wat downstream-toepassingen vergemakkelijkt, zoals ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en celtherapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cultuur en uitbreiding van hPSC's

  1. HPSC cultuur
    1. Bedek twee putten van een 6-putsplaat met extracellulaire matrix (ECM, hESC-gekwalificeerde matrix). Bereid 50 ml van een ECM-oplossing met 8-12 μg/ml ECM in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Voeg in 49 ml DMEM 1 ml van de ontdooide ECM-stamoplossing (50x) toe. Voeg 1 ml van de ECM-oplossing toe aan elke put van een 6-well plaat. Incubeer het gedurende 1 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Bereid hPSC-onderhoudsmedium (MM) voor volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Verwarm MM voor bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min.
    4. Ontdooi een cryogene injectieflacon met hPSC's (hiPSC's of hESCs) (ongeveer 1 x10 6) uit een tank met vloeibare stikstof door incubatie in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 s.
    5. Haal de injectieflacon eruit en desinfecteer deze zorgvuldig met een 75% desinfectiealcoholspray. Zet het in een bioveiligheidskast.
    6. Breng de celsuspensie van de injectieflacon over naar een buis van 15 ml, voeg druppelsge voor druppel 5 ml voorverwarmde MM toe aan de buis met behulp van een pipet van 5 ml. Schud ondertussen voorzichtig aan de buis om de hPSC's te mengen.
    7. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 170 x g. Verwijder het grootste deel van het supernatant voorzichtig met een pipet van 1 ml en laat ongeveer 50 μL supernatant achter om te voorkomen dat de cellen verloren gaan.
    8. Voeg 1 ml MM toe aan de buis en suspenseer de pellet door een of twee keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml.
      OPMERKING: De overleving van enkele cellen van hPSC's is laag. Kleine celklonten met 3-5 cellen hebben de voorkeur om de hPSC's in kolonies te laten groeien.
    9. Verwijder ECM uit de voorgecoate putten (stap 1.1.1), voeg 1,5 ml MM toe aan elke put en verdeel vervolgens 0,5 ml celsuspensie per put.
    10. Schud de plaat voorzichtig om de hPSC's gelijkmatig te verdelen en plaats de plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Beweeg de plaat niet gedurende ten minste 24 uur om de celtrouw te bevorderen.
    11. Verander MM om de andere dag en doorloop de hPSC's wanneer de samenvloeiing ongeveer 80% heeft bereikt.
  2. Doorgeven van hPSC's
    OPMERKING: Het onderhoud van de ongedifferentieerde toestand in hPSC's is vrij kritisch voor verdere toepassingen. Onder de aanhankelijke omstandigheden groeien hPSC's in kolonies met een goed gedefinieerde grens. De cellen moeten worden gepasseerd wanneer de samenvloeiing van hPSC's ongeveer 80% bereikt.
    1. Observeer de cellen onder een microscoop. Markeer en verwijder mechanisch de duidelijk zichtbare gedifferentieerde cellen (<5%) voordat ze passeren.
    2. Bereid de met ECM beklede plaat voor zoals beschreven in stap 1.1.1.
    3. Voorverwarm mm en 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+ bij RT.
    4. Verwarm de 0,5 mM EDTA (in 1x PBS) oplossing voor in een waterbad bij 37 °C.
    5. Verwijder het medium van de kweekplaat met behulp van een vacuümaspiratiesysteem, voeg 1 ml 1x PBS toe in elke put om de cellen te wassen met een pipet van 1 ml en herhaal dit tweemaal.
    6. Voeg 1 ml EDTA-oplossing per put toe om de hPSC's te dissociëren in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 5 minuten. Overschrijd de aanbevolen incubatietijd niet om dissociatie naar afzonderlijke cellen te voorkomen.
    7. Haal de plaat eruit en controleer op het losmaken van cellen onder een microscoop. De samenvloeiende hPSC's worden losser en elke celrand is te zien, maar de cellen kunnen niet gemakkelijk loskomen door de celplaat zachtjes te schudden.
    8. Verwijder de EDTA-oplossing met een pipet van 1 ml en voeg 1 ml MM toe om de dissociatie te stoppen. Pipetteer de hPSC's voorzichtig een of twee keer met een pipet van 1 ml om de cellen opnieuw te suspenen. Het is niet nodig om te centrifugeren om de cellen te verzamelen.
      OPMERKING: Als de meeste cellen na incubatie met EDTA van de plaat komen, kunnen cellen worden verzameld door een centrifuge.
    9. Verwijder ECM uit de voorgecoate putten (stap 1.2.2) en voeg 1,5 ml MM per put toe.
    10. Breng 150-200 μL celklonten over naar elke put. Over het algemeen kunnen hPSC's worden gepasseerd in een verhouding van 1: 6. Cellen uit één put van een 6-putplaat kunnen bijvoorbeeld worden verdeeld over zes nieuwe putten.
    11. Schud de plaat voorzichtig om de hPSC's gelijkmatig te verdelen en kweek de hPSC's in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 24 uur zonder de plaat aan te raken.
    12. Vervang MM om de dag zoals beschreven in stap 1.1.

2. Retinale differentiatie van hPSC's

OPMERKING: Wanneer de kolonies ~80% samenvloeiing bereiken(figuur 1B),kunnen ze worden geleid om te differentiëren in retinale organoïden volgens het protocol dat is geschematiseerd in figuur 1A. Om ervoor te zorgen dat de hPSC's een hoge kwaliteit en een goede opbrengst hebben, evalueert u regelmatig de pluripotentie met moleculaire markers zoals OCT4 of NANOG met behulp van IFC of QPCR. HPSC's moeten worden weggegooid als gedifferentieerde cellen meer dan 5% van de totale cellen uitmaken. Controleer op mycoplasmabesmetting met een mycoplasma-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik alleen mycoplasma-vrije hPSC's omdat mycoplasma het differentiatievermogen van hPSC's kan veranderen.

  1. Media en reagentia voorbereiden
    1. Bereid neuraal inductiemedium (NIM) voor door het volgende te mengen: 500 ml Dulbecco's gemodificeerd eaglemedium / voedingsmengsel F-12 (DMEM / F-12, 1: 1), 5 ml 1% N2-supplement, 0,5 ml 0,1% heparine (2 mg / ml in 1x PBS) en 5 ml 1% MEM niet-essentiële aminozuren (NEAA).
    2. Bereid retinale differentiatiemedium (RDM) voor met 300 ml DMEM / F-12, 200 ml DMEM basisch, 10 ml 2% B27-supplement, 5 ml 1% antibioticumantie antimycotisch en 5 ml 1% MEM NEAA.
      OPMERKING: Zowel NIM als RDM worden niet gefilterd, maar er wordt een steriliteitstest uitgevoerd. Haal 1 ml medium eruit en voeg het toe in een schaal van 35 mm en kweek gedurende 3-7 dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. De media kunnen worden bewaard bij 4 °C en moeten binnen 2 weken worden gebruikt om de activiteit van de componenten te garanderen.
    3. Bereid 10 mM Blebbistatine (1.000x) in DMSO. Voeg 1.710 μL DMSO toe om 5 mg blebbistatine op te lossen om 10 mM stamoplossing (1.000x) te verkrijgen, aliquot bij 10 μL/buis en bewaren bij -20 °C.
      OPMERKING: Alle media en reagentia moeten vóór gebruik gedurende 30 minuten bij RT worden opgewarmd, tenzij anders vermeld.
  2. Embryoïde lichaamsvorming (EB)
    1. Start op dag 0 (D0) de differentiatie. Haal een put hPSCs uit een 6-well plaat, die is gegroeid tot ~ 80% confluentie. Verzamel de cellen met EDTA-dissociatieoplossing zoals beschreven in stappen 1.2.1 tot en met 1.2.6.
    2. Verwijder de EDTA-oplossing, voeg 1 ml MM met 10 μM blebbistatine toe om de celdissociatie te stoppen en verzamel de cellen met een pipet van 1 ml. De grootte van celklonten is een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de opbrengst van EB's. Ongeveer vijf cellen per klomp hebben de voorkeur om de juiste grootte van EB's op D5 tot D7 te produceren.
      OPMERKING: Dit is een belangrijke stap. Pipetteer de cellen niet te vaak, omdat EB-achtige aggregaten moeilijk te vormen zijn uit afzonderlijke cellen van hPSC's.
    3. Breng de celsuspensie (ongeveer 2 x10 6 cellen) over in een 100 mm ultralage petrischaal en voeg 9 ml MM met 10 μM blebbistatine toe aan de schaal.
    4. Schud de schaal twee keer voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en zet de schaal in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Op D1, nadat de cellen gedurende ten minste 24 uur zijn gekweekt, haalt u de schaal eruit en observeert u deze onder de microscoop. Een groot aantal van de kleine celaggregaten zal tegen die tijd spontaan worden gevormd (Figuur 1C).
    6. Bereid 12 ml mengsel met MM en NIM in een verhouding van 3:1 (9 ml MM en 3 ml NIM) in een buis van 15 ml.
    7. Breng de celculturen over in een centrifugebuis van 15 ml met een pipet van 10 ml loodrecht en voeg 10 ml van het voorverwarmde mengsel toe aan de schaal.
    8. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij 60 x g om de aggregaten te verzamelen, verwijder het supernatant met een pipet van 5 ml en laat ongeveer 500 μL achter om te voorkomen dat cellen verloren gaan.
    9. Voeg 2 ml van het mengsel toe aan de buis en breng de suspensie over in dezelfde schaal (stap 2.2.7).
    10. Schud de schaal voorzichtig om de celaggregaten gelijkmatig te verdelen en plaats de schaal terug in de couveuse.
    11. Bereid op D2 12 ml van een nieuw mengsel met MM en NIM in een verhouding van 1:1 (6 ml MM en 6 ml NIM) in een buis van 15 ml. Ververs het celmedium met het vers bereide mengsel door de stappen van 2.2.5 tot en met 2.2.10 te herhalen.
    12. Verander op D3 het celmedium met 15 ml NIM zoals hierboven beschreven. Kweek de cellen gedurende ten minste 5 dagen onder de suspensieomstandigheden.
      OPMERKING: Tijdens D1 tot D3 moet het medium elke dag worden vervangen, waardoor er voldoende voeding is. Sinds D3 kan NIM om de dag worden gewijzigd. Ook kunnen EB's worden onderverdeeld in verschillende gerechten om overvloedige voeding te bieden.
  3. Zaai de EB's
    OPMERKING: Kies op D5 tot en met D7 een geschikt tijdstip om de EB's op de ECM-gecoate schotels te borden op basis van de grootte van de EG's. EB's met een geschatte diameter van 200 μm zijn geschikt voor de retinale differentiatie. Over het algemeen kan één put hPSC's in een 6-putplaat ongeveer 300 tot 1.000 EB's produceren. De variatie van eb-opbrengst wordt gevarieerd door de hPSC-lijnen.
    1. Bereid op D4 ECM-gecoate gerechten voor de EC-aanhangercultuur. Voeg 5 ml ECM toe aan elke 100 mm weefselkweekschaal (behandeld oppervlak) en leg ze een nacht in de couveuse.
    2. Verwijder op D5 ECM uit de voorgecoate gerechten en voeg 10 ml voorverwarmde NIM toe aan elk gerecht.
    3. Haal het gerecht met EB's eruit. Controleer de kwaliteit van EB's onder de microscoop en zorg ervoor dat ze vrij helder en rond van vorm zijn. De grootte van de EB's is ongeveer 200 μm in diameter. Verzamel alle EB's in een buis van 15 ml. Breng de EB's van de schotels over naar een buis van 15 ml met een pipet van 5 ml. Laat de EB's 5 minuten tot rust komen. Verwijder het grootste deel van het supernatant en laat ongeveer 2 ml medium achter.
    4. Verdeel de EB's druppelsge voor druppel in de gecoate schalen met 10 ml NIM met een pipet van 1 ml. Zaai de EB's met een dichtheid van ongeveer 2-3 EBs per cm2. Voeg bijvoorbeeld ongeveer 120-180 EB's toe aan een schotel van 100 mm. Om het EB-getal ruwweg te beoordelen, plaatst u één druppel EB-suspensie op een coverslip en telt u het aantal EB's onder de microscoop.
      OPMERKING: De platingdichtheid van EB's is een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de efficiëntie van retinale inductie. De dichtheid kan ook worden aangepast door elke hPSC-lijn.
    5. Schud de gerechten voorzichtig om de EB's gelijkmatig te verdelen. Doe ze in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Verplaats de gerechten niet gedurende ten minste 24 uur om de hechting van EB's te verbeteren.
  4. Inductie van optische blaasjes (OVs) en retinaal pigmentepitheel (RPE) in aanhankelijke omstandigheden
    OPMERKING: Nadat EB's op het ecm-gecoate oppervlak zijn gezaaid, kunnen hPSC's OV-achtige structuren ontwikkelen, die al na differentiatie kunnen worden waargenomen. In dit protocol zijn geen specifieke groeifactoren of signaalmoleculen vereist om de hPSC's in het retinale lot te leiden, behalve de toevoeging van N2- en B27-supplementen in de media.
    1. Verwijder op D8-D9 de schotels en observeer de EB's onder de microscoop. Alle EB's worden bevestigd en verspreid over de schotels(figuur 1D). Voeg 10 ml verse NIM toe aan elke schaal van 100 mm met 10 ml oud medium. Leg ze terug in de couveuse.
      OPMERKING: Verwijder het oude medium niet.
    2. Vervang op D12 de helft van het medium met NIM met behulp van een pipet van 10 ml. Houd de cultuur in de incubator.
    3. Verwijder op D16 alle NIM uit de schotels met behulp van een vacuümaspiratiesysteem. Voeg 20 ml RDM toe aan elk gerecht. Blijf kweken in RDM en verander om de dag de helft van het medium.
    4. Observeer tijdens D10-D30 de morfologische veranderingen van de cellen twee keer per week onder een microscoop en evalueer de efficiëntie van retinale differentiatie.
      OPMERKING: Sinds D10 zijn oogveld (EF) domeinen zelfgeorganiseerd in de perifere zones van adherente EB's. De OV-achtige structuren verschijnen tussen D20 en D25, steken geleidelijk uit de schaal en vormen zelf een optische beker, die wordt omringd door de gepigmenteerde RPE (figuur 1E). De EV's zijn gemakkelijk te herkennen aan de heldere, brekings- en dikke NR-ring.
  5. Losmaken en kers en RPE in suspensie om retinale organoïden (RA's) te verkrijgen
    1. Op D28-D35 verschijnen de meeste OVs in de schotels. Gebruik een wolfraamnaald of een naald met een spuit van 1 ml om de morfologisch identificeerbare OK's mechanisch los te maken, samen met de aangrenzende RPE. Kweek ze in schorsing.
      OPMERKING: Het uiterlijk en de opbrengst van OK's en RPE variëren sterk in verschillende hPSC-lijnen. Het tijdspunt van het loskoppelen van OV en RPE is dus flexibel. Voor de hand liggende OVs met de aangrenzende RPE kunnen worden losgemaakt en vervolgens worden verplaatst naar een cultuurschaal met lage aanhechting met RDM. Blijf de rest van de cellen kweken totdat alle OVs en RPE's zijn opgetild.
    2. Plaats 50-60 OK's in elke 100 mm lage aanbouwcultuurschaal met 15 ml RDM voor de OK-formatie(figuur 1F).
    3. Vervang RDM elke 2-3 dagen tot D42, wanneer de ROs goed rond zijn.

3. Retinale ontwikkeling en rijping

OPMERKING: In dit protocol is serum vereist om de RA's te laten groeien en rijpen voor langdurige kweek.

  1. Retinale laminatie en specificatie in ROs
    1. Bereid 10 ml taurine van 100 mM (1.000x) in 1x PBS. Weeg 125 mg taurine af en los op in 10 ml 1x PBS. Filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm. Aliquot bij 500 μL/buis en bewaren bij -20 °C.
    2. Bereid retinaal kweekmedium 1 (RC1) voor. Meng de volgende componenten: 250 ml DMEM /F-12, 175 ml dmem basisch, 50 ml foetaal runderserum, 10 ml 2% B27-supplement, 5 ml 1% antibioticum antimycotisch, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM taurine en 5 ml L-alanyl-L-glutamine.
    3. Bereid retinaal kweekmedium 2 (RC2) voor met 450 ml DMEM / F-12, 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 1% N2-supplement, 5 ml 1% antibioticum antimycotisch, 0,5 ml 100 μM taurine, 5 ml 1% MEM NEAA en 5 ml 2 ml L-alnyl-L-glutamine.
      OPMERKING: De RC1 en RC2 worden niet gefilterd, maar ondergaan een steriliteitstest. Haal 1 ml medium eruit, voeg het toe aan een schaal van 35 mm en kweek gedurende 3-7 dagen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2, om steriliteit voor gebruik te garanderen. Het medium kan worden bewaard bij 4 °C en moet binnen 2 weken worden gebruikt om de activiteit van de componenten te garanderen. Alle media en reagentia moeten voor gebruik gedurende 30 minuten bij RT worden voorverwarmd.
    4. Schakel op D42 het kweekmedium over van RDM naar RC1.
    5. Kantel de schotels op ongeveer 30° en laat de ROs 30 s bezinken. Verwijder de oude RDM met een pipet van 10 ml en laat ongeveer 1 ml medium achter om te voorkomen dat er RO's verloren gaan. Voeg 15 ml verse RC1 toe aan elk gerecht.
    6. Schud de gerechten voorzichtig om de RA's gelijkmatig te verdelen. Zet de vaat terug in de couveuse. Vervang daarna twee keer per week het hele medium.
    7. Selecteer tijdens D50-D90 hoge kwaliteit VAN ROs voor langdurige cultuur, die rond gevormd zijn met een dikke en heldere NR. Plaats 30-40 RA's in een 100 mm lage opzetschaal met 20 ml RC1 en vervang het hele medium twee keer per week.
    8. Voor de langdurige suspensiecultuur van RO's pipetteert u de RO's om te voorkomen dat RO-RO opnieuw wordt vastgeklopt met behulp van een pipet. Breng ROs één keer per maand over naar nieuwe cultuurgerechten om te voorkomen dat ROs aan het oppervlak van de gerechten blijven plakken.
      OPMERKING: Onder de omstandigheden van de ophangingscultuur zijn DE's rond van vorm, met een heldere en dikke NR-ring bevestigd met min of meer RPE aan één kant. Gelamineerd neuraal netvlies ontwikkelt zich en retinale celsubtypen verschijnen sequentieel met retinale ganglioncellen die eerst worden gegenereerd, gevolgd door fotoreceptorcellen, amacrinecellen en bipolaire cellen.
  2. Menselijke fotoreceptorrijping met verrijking van kegels in RA's
    1. Schakel na D90 het medium van RC1 naar RC2, wat geschikt is voor fotoreceptorrijping.
    2. Wijzig het medium zoals beschreven in stappen 3.1.7-3.1.8.
      OPMERKING: Onder deze kweekconditie kunnen RU's op lange termijn groeien(figuur 1G),tot D300 getest. Retinale cellen in RO's worden volwassen en alle celsubtypen van het neurale netvlies, inclusief muller gliacellen, staafjes en kegeltjes worden ook verworven. Zonder enige toevoeging van RA zijn kegelfotoreceptoren ook rijk aan ROs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het retinale inductieproces in dit protocol bootst de ontwikkeling van het menselijk foetaal netvlies na. Om de retinale differentiatie te initiëren, werden hPSC's gedissocieerd in kleine klonten en gekweekt in suspensie om de vorming van EB's te induceren. Op D1 vormden de geüniformeerde celaggregaten of EG's (figuur 1C). Het cultuurmedium werd geleidelijk overgezet naar NIM. Op D5 werden EB's op de ECM-gecoate kweekschalen geplakt. Cellen migreerden geleidelijk uit de EB's (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit multi-step retinale inductieprotocol werden hPSC's stap voor stap begeleid om het retinale lot te verkrijgen en zelf georganiseerd in retinale organoïden met gelamineerde NR en RPE. Tijdens de differentiatie hebben hPSC's alle belangrijke stappen van de menselijke retinale ontwikkeling in vivosamengevat , van EF, OV en RPE tot retinale laminatie, waarbij alle subtypen retinale cellen worden gegenereerd, inclusief retinale ganglioncellen, amacrinecellen, bipolaire cellen, staaf- en kegelfotoreceptoren en m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Xiufeng Zhong is de patent uitvinder met betrekking tot de generatie van retinale cellen uit menselijke pluripotente stamcellen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het National Key R & D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), het Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), het Science & Technology Project van de provincie Guangdong (2017B020230003), de Natural Science Foundation (NSF) van China (81570874, 81970842), honderd talentprogramma van Sun Yat-sen University (PT1001010) en de Fundamental Research Funds van het State Key Laboratory of Ophthalmology.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(−)-BlebbistatinSigmaB0560-5mgROCK-remmer
1 ml tipsKirgenKG13131 ml
10 ml pipetteSorfa3141001Pipet
100 mm Tissue cultureBIOFILTCD000100100 mm Petrischaal
100 mm Tissue cultureFalcon353003100 mm Petrischaal
15 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011150Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishesFalcon35300135 mm Petrischaal
5 ml pipetteSorfa313000Pipet
50 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011500Centrifuge tubes
6 wells tissue culture platesCostar3516Cultuurplaten
Anti-AP2α AntibodyDSHB3b5Primair antilichaam
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100XGibco15240062Antibioticum-Antimycoticum
Anti-ISL1 AntibodyBosterBM4446Primair antilichaam
Anti-Ki67 AntibodyAbcamab15580Primair antilichaam
Anti-L/M opsin Antibodygift from Dr. jeremy/Primair antilichaam
Anti-PAX6 AntibodyDSHBpax6Primair antilichaam
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin AntibodyMilliporeab5585Primair antilichaam
Anti-Rhodopsin AntibodyAbcamab5417Primair antilichaam
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 AntibodyAbclonalA19710Primair antilichaam
Anti-VSX2 AntibodyMilliporeab9016Primair antilichaam
B-27 supplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Supplement
Cryotube vialThermo scientific-NUNC3754181,8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-fenylindole
dihydrochloride; meerdere leveranciers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLMeerdere leveranciers
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200,5 M PH 8,0
FBSNATOCORSFBESerum
FilterMilliporeSLGP033RB0,22μm, steriele Millex filter
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparineSigmaH31492 mg/ml in PBS te gebruiken
Matrigel, 100xCorning354277Extracellulaire matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1STEM CELL85850hPSCs onderhoudsmedium (MM)
N2 supplementGibco17502048Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) bufferGNMGNM10010Zonder Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
TaurineSigmaT0625Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachmentCorningCLS3262-20EAPetrischaal

Referenties

  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047(2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179(2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658(2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212(2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766(2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale organo denretinale inductie3D retinale weefselsembryonale lichaampjesvormingretinale differentiatieisolatie van de opticussuikkelkegelfotoreceptorenziekte modelleringceltherapie

Gerelateerde artikelen