Methodenartikel

3D-visualisatie van immuuncelpopulaties in met HIV geïnfecteerde weefsels via clearing-, immunokleurings-, confocale en lichtbladfluorescentiemicroscopie

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62441

⸱

6 mei 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Medicine, University of California San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Weefselopruiming, gecombineerd met immunofluorescentiemicroscopie, maakt ruimtelijke visualisatie en kwantificering van immuuncelpopulaties en viruseiwitten in intacte weefsels mogelijk. Optische doorsnede van geklaarde weefsels met confocale en lichte fluorescentiemicroscopie kan 3D-modellen van complexe weefselomgevingen genereren en ruimtelijke heterogeniteit onthullen die wordt vertoond tijdens HIV-infectie.

Samenvatting

Het humaan immunodeficiëntievirus (HIV), de veroorzaker van het verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS), is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem met bijna 40 miljoen geïnfecteerde mensen wereldwijd en geen algemeen toegankelijke remedie. Ondanks intensieve inspanningen blijft een gedetailleerd begrip van virus- en gastheercelinteracties in weefsels tijdens infectie en als reactie op therapie onvolledig. Om deze beperkingen aan te pakken, worden de op water gebaseerde weefselopruimingstechnieken CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) en CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) toegepast om complexe virusgastheer-celinteracties te visualiseren in HIV-geïnfecteerde weefsels van diermodellen en mensen met behulp van confocale en lichte fluorescentiemicroscopie. Optische doorsnede van intacte weefsels en beeldanalyse maakt een snelle reconstructie mogelijk van ruimtelijke informatie in hele weefsels en kwantificering van immuuncelpopulaties tijdens infectie. Deze methoden zijn van toepassing op de meeste weefselbronnen en diverse biologische vragen, waaronder infectieziekten en kanker.

Inleiding

De groeiende behoefte aan kwantitatieve ruimtelijke weefselbeeldvorming in biologisch onderzoek heeft onlangs geleid tot de opkomst van weefselopruimingstechnieken voor het genereren van beelden met een groter volume (mm 3 cm3) van intacte weefsels met een resolutie van één cel. Weefsels omvatten complexe organisaties van biomoleculen met uniek gedefinieerde structuren, samenstellingen en functies. Helaas verstrooien, absorberen of zenden veel biomoleculen die in weefsels aanwezig zijn (bijv. lipiden en chromoforen) licht uit wanneer ze via lichtmicroscopie worden afgebeeld, waardoor beeldvorming van grote volumes moeilijk wordt. Bovendien vertonen weefsels vaak een brekingsindex die niet overeenkomt met standaard beeldvormingsoplossingen en optische lenzen, wat resulteert in optische vervormingen tijdens beeldvorming. Een optimale benadering voor het afbeelden van grote hoeveelheden weefsel met een lichtmicroscoop moet bestaan uit het afstemmen van de brekingsindex van weefsels, beeldvormingsoplossingen en objectieven, terwijl licht diep in het weefsel kan doordringen zonder de biologische kenmerken van intacte weefsels tijdens de verwerking te verstoren. De eerste pogingen om de verschillen in brekingsindex tussen weefsels en beeldvormingsoplossingen te verminderen door het opruimen van ondoorzichtige weefselmonsters werden eind 1800 uitgevoerd door de Duitse anatoom Werner Spalteholz1. Deze techniek voor het opruimen van weefsel omvatte agressieve chemische oplosmiddelen, die weefselmonsters kunnen beschadigen, maar vertegenwoordigde niettemin de eerste gerapporteerde beeldvorming van intacte weefsels met een groter volume. Moderne lichtmicroscopiemethoden, gecombineerd met rekenkracht voor het vastleggen en analyseren van beelden, hebben onlangs weefselopruiming weer in zwang gebracht als een methode voor het afbeelden van grote, intacte weefselmonsters met een resolutie van één cel. In de afgelopen twee decennia zijn er tientallen geavanceerde technieken voor het opruimen van weefsel ontstaan, zowel op organische als op waterbasis, elk met sterke en zwakke punten voor specifieke toepassingen.

3D-weefselbeeldvorming kan complexere biologische interacties onderzoeken die niet in celcultuur kunnen worden gereproduceerd. Celsignaleringspatronen2, ruimtelijke verdelingen van verschillende celtypen3 en hersenconnectiviteit4 werden bijvoorbeeld eerder op een kwantitatieve manier in kaart gebracht met behulp van beeldvormingsmethoden voor hele weefsels/organen. Hier wordt een toepassing beschreven van op water gebaseerde weefselopruimingsprotocollen om verschillende HIV-doelcelpopulaties in intacte HIV-geïnfecteerde lymfoïde weefsels tijdens actieve infectie te verwijderen, immunokleuring te maken en te visualiseren. In het lichaam infecteert HIV voornamelijk CD4+ T-cellen en integreert het een kopie van zijn genoom in het genoom van geïnfecteerde gastheercellen. Het virus kaapt vervolgens de geïnfecteerde gastheercelmachinerie om zichzelf te repliceren, wat resulteert in virusverspreiding, het doden van gastheercellen, immuundisfunctie en langdurige progressie naar aids. Het is belangrijk op te merken dat het gedrag van geïnfecteerde T-cellen in weefsel en celcultuur opmerkelijk discrepant is. Gekweekte CD4+ T-cellen die met HIV zijn geïncubeerd, kunnen enorme HIV-geïnduceerde syncytie produceren die tientallen kernen kan omvatten5, terwijl vergelijkbare experimenten met primaire CD4+ T-cellen gekweekt in 3D extracellulaire matrix (ECM) hydrogels of weefselmonsters van HIV-geïnfecteerde gehumaniseerde muizen (hu-muizen) over het algemeen syncytie opleveren met 2-5 kernen6. Het begrijpen van lokale cel-tot-cel overdracht en systemische verspreiding van het virus binnen HIV-geïnfecteerde personen is waarschijnlijk nog gecompliceerder, waarbij het virus door meerdere geïnfecteerde celtypen wordt getransporteerd, van weefsels naar bloedvaten naar nieuwe weefsels, waar vrije virionen en virusproducerende cellen toegang hebben tot een groot aantal vatbare lymfocyten7. Deze scenario's zijn momenteel niet mogelijk om samen te vatten in celkweeksystemen, en weefsels van diermodellen en mensen blijven een belangrijke bron voor het begrijpen van de pathogenese van virussen in de context van een complex organisme met een functionerend immuunsysteem.

De huidige antiretrovirale therapieën (ART's) verhogen de levensverwachting en kwaliteit van mensen met hiv (PWH) aanzienlijk door de hiv-replicatie te remmen en de ziekteprogressie naar aids te stoppen. Helaas elimineert ART niet latent geïnfecteerde immuuncellen die een insertie van het retrovirale genoom bevatten die in rust zijn en niet actief virus produceren. Hoewel het virus niet detecteerbaar is in het bloed van de meeste mensen die ART gebruiken, kaatst de virusbelasting snel terug nadat ART is onderbroken en gaat de ziekteprogressie door8. De aanhoudende aard van de HIV-infectie, veroorzaakt door het latente reservoir van geïnfecteerde cellen, vormt een enorme belemmering voor het tot stand brengen van een HIV-genezing. Weefselreservoirs van HIV blijven slecht begrepen, en het is van cruciaal belang om een beter begrip van deze reservoirs in lymfoïde weefsels te krijgen voor, tijdens en na ART, om de pathogenese van het virus volledig te karakteriseren en nieuwe behandelingen te beoordelen die latent geïnfecteerde cellen die niet actief virus produceren, effectief elimineren.

Hier werden CUBIC3 en CLARITY9, twee eerder aangepaste protocollen voor het opruimen van weefsel op waterbasis, toegepast op het in beeld brengen van immuuncelpopulaties in tal van intacte lymfoïde weefsels van HIV-geïnfecteerde muizen met gehumaniseerde immuunsystemen (hu-muizen), SIV/SHIV-geïnfecteerde niet-menselijke primaten (NHP) en HIV-geïnfecteerde mensen. Deze protocollen kunnen worden aangepast aan zowel confocale als lichte fluorescentiemicroscopie, afhankelijk van de doelen van de beeldvorming (hogere resolutie versus groter volume) en de beschikbare instrumenten. Hoewel lichtmicroscopie individuele virionen niet kan oplossen, kan het gebruik van immunofluorescentie weefselgebieden identificeren die virus en virusproducerende cellen bevatten die verder kunnen worden geanalyseerd met methoden met een hogere resolutie. De hier gepresenteerde methoden kunnen worden aangepast om bijna elk weefsel in het lichaam te visualiseren met een resolutie van één cel om de ruimtelijke relaties tussen specifieke celtypen in verschillende omstandigheden tijdens infectie te kwantificeren en zijn gemakkelijk te vertalen naar zeer relevante menselijke patiëntenmonsters voor de studie van infectieziekten of kanker.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen voor dierenverzorging van de instelling. Alle menselijke weefsels zijn verkregen volgens goedgekeurde institutionele ethische richtlijnen voor menselijk onderzoek.

1. Weefseloogst en fixatie (zelfde voor CUBIC en CLARITY)

  1. Identificeer en ontleed de lymfoïde weefsels zoals eerder beschreven10.
  2. Snijd de lymfoïde weefsels binnen enkele minuten na de dood weg met een ontleedschaar en een pincet, indien veilig mogelijk.
  3. Plaats weefselmonsters in een vers gemaakte, ijskoude fixatieve buffer met 8% paraformaldehyde (PFA), 5% sucrose in 0,1 M natriumcacodylaattrihydraat om de weefselmonsters adequaat te bewaren voor lichtmicroscopie (LM), elektronenmicroscopie (EM) of immuno-EM. U kunt de monsters ook fixeren op LM met 4% PFA in 0,1 M PBS. Repareer de monsters 's nachts voordat u met het opruimingsproces begint om ervoor te zorgen dat het virus volledig wordt gedeactiveerd.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig bij huidcontact en inademing en is ook een ontvlambare vaste stof; Voorzichtig behandelen en opbergen in een brandbare opbergkast. Natriumcacodylaattrihydraat is giftig bij inslikken of inademen.
  4. Maak een referentiefoto van het weefsel voordat u met het opruimingsproces begint.
    OPMERKING: LM-monsters kunnen onder deze omstandigheden minimaal 1 jaar worden bewaard. Om te werken met monsters die endogene fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, moet u de monsters in de volgende stappen altijd in het donker houden.

2. KUBISCH weefsel opruimen

  1. Spoel de lymfoïde weefselmonsters driemaal in steriel 0,1 M PBS en schud ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat PFA tijdens elke bufferwissel wordt verwijderd.
    OPMERKING: Gooi de vloeistoffen die PFA bevatten weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  2. Dompel het lymfoïde weefselmonster onder in CUBIC Reagens-1 (zie Materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 3 dagen onder voorzichtig schudden. Maak regelmatig referentiebeelden om het ontkleuringsproces in de loop van de tijd te volgen.
  3. Vervang de Reagens-1 voor nog eens 3-4 dagen onderdompeling, of totdat de weefselontkleuring is voltooid. De tijd die nodig is voor het opruimen is afhankelijk van zowel het volume als het type weefsel. Om het ontkleuringsproces van het weefsel te versnellen, ververst u de CUBIC Reagent-1 dagelijks en gebruikt u grotere hoeveelheden.
  4. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met 0,1 M PBS gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en schud voorzichtig.
  5. Dompel de lymfoïde weefselmonsters onder in CUBIC Reagens-2 (zie Materiaaltabel) bij 37 °C met zacht schudden gedurende 2-7 dagen of totdat volledige transparantie is bereikt. Als de monsters geen volledige transparantie bereiken, herhaalt u de stappen 2.2-2.5 totdat het klaren niet meer vordert. Maak regelmatig referentiebeelden om het opruimingsproces in de loop van de tijd te volgen.
  6. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met 0,1 M PBS gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en schud voorzichtig.
  7. Bewaar de monsters in CUBIC Reagens-2 met 0,01% volume/volume (V/V) natriumazide in het donker (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: De monsters kunnen met deze methode minimaal 6 maanden worden bewaard.
    LET OP: Natriumazide is zeer giftig en vormt een ernstig gevaar bij inademing. Het wordt aanbevolen om verdunde oplossingen van 5% natriumazide of minder te kopen.

3. Blokkering en immunokleuring van kubieke monsters

  1. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met 0,1 M PBS gedurende 30 minuten elk op kamertemperatuur en schud voorzichtig.
  2. Om een beeld te maken met een confocale microscoop, snijdt u het weefsel in plakjes van ~ 0,5-1 mm dik met behulp van een weefselsnijmatrix. Om fluorescentiemicroscopie (LSFM) uit te voeren, blokkeert u het hele weefselgebied.
  3. Blokkeer de monsters 's nachts bij 4 °C met 5 ml CUBIC-blokkeeroplossing door te schudden (zie materiaaltabel). Gebruik bij het werken met NHP of menselijke monsters anti-menselijke FcR. Gebruik bij het werken met muismonsters anti-muis FcR in de blokkeeroplossing.
  4. Kleur de monsters gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur met 5 ml primaire antilichamen (zie materiaaltabel) in een blokkerende oplossing (zonder soortspecifieke FcR) met schudden (optioneel: centrifugeer de geconcentreerde antilichaamvoorraad bij 2.300 x g gedurende 5 minuten voor gebruik, om de toevoeging van geaggregeerd antilichaam te verminderen).
  5. Was het bevlekte monster bij kamertemperatuur en schud het gedurende een periode van minimaal 5 uur in totaal met ten minste vijf keer de buffer van de wasoplossing vervangen (zie materiaaltabel).
  6. Kleur de monsters met secundaire antilichamen (zie Materiaaltabel) in blokkeeroplossing (zonder soortspecifieke FcR) gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur met schudden (Optioneel: centrifugeer de antilichamen bij 2.300 x g gedurende 5 minuten voor gebruik om de aggregatie van antilichamen te minimaliseren).
  7. Was het bevlekte monster vijfmaal met een wasoplossing op kamertemperatuur en schud het in totaal ten minste 5 uur.
  8. Kleur de monsters met 5 ml DAPI-kleuringsoplossing (zie Materiaaltabel) op elk weefselmonster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Laat de monsters in het donker bij 4 °C in de DAPI-kleurstofoplossing blijven voor latere beeldvorming.
  9. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met een wasoplossing op kamertemperatuur en schud ze elk 30 minuten.
  10. Dompel het bevlekte monster een nacht onder in CUBIC Reagens-2 bij kamertemperatuur in het donker voordat u het monster monteert.

4. CLARITY weefsel opruimen

  1. Spoel de lymfoïde weefselmonsters driemaal in steriel 0,1 M PBS en schud ze elk 15 minuten bij kamertemperatuur om PFA te verwijderen.
  2. Plaats de weefselmonsters in 15 ml vers gemaakte acrylamideoplossing en incubeer een nacht bij 4 °C onder zacht roeren (zie tabel met materialen).
    LET OP: Niet-gepolymeriseerd acrylamide is een krachtig neurotoxine en wordt gemakkelijk door de huid opgenomen. Vermijd elk contact met de huid en spoel onmiddellijk af als er contact optreedt.
  3. Laat de weefselmonsters opwarmen tot kamertemperatuur.
  4. OPTIONEEL: Ontgas de weefselmonsters door stikstof gedurende 1 minuut in de acrylamideoplossing te laten borrelen. Zorg ervoor dat u een laag debiet gebruikt dat spatten van giftig niet-gepolymeriseerd acrylamide vermijdt (~1-2 bubbels/s).
  5. Plaats de weefselmonsters gedurende 1-3 uur in een waterbad van 37 °C om te polymeriseren en keer elke 15 minuten om. Verwijder de monsters zodra merkbare polymerisatie wordt gedetecteerd, zoals aangegeven door een stroperige vloeistof, het verschijnen van Schleren-lijnen tijdens het mengen of de vorming van een heldere capsule rond het weefsel.
    OPMERKING: Als volledige polymerisatie van de acrylamideoplossing optreedt, snijdt u de overtollige hydrogel van het monster en gaat u verder met het protocol.
  6. Was de weefselmonsters met steriel 0,1 M PBS driemaal gedurende 30 minuten elk bij kamertemperatuur en schud voorzichtig om de acrylamideoplossing te verwijderen.
  7. Plaats de weefselmonsters in 15 ml 8% SDS in 0,1 M PBS bij 37 °C met zacht schommelen gedurende 2-5+ dagen om klaring mogelijk te maken. Ververs de 8% SDS-oplossing regelmatig en gebruik indien nodig tot 50 ml van de oplossing om het klaren te versnellen. Stop het klaringsproces wanneer de monsters visueel transparant zijn of niet meer vorderen. Maak regelmatig referentiebeelden om het opruimingsproces in de loop van de tijd te volgen.
  8. Was de weefselmonsters vijf keer per 1 dag bij kamertemperatuur met steriel 0,1 M PBS en schud voorzichtig.
  9. Bewaar de monsters tijdelijk in 0,1 M PBS (plus 0,01% volume/volume (v/v) NaN3 voor opslag op langere termijn) in het donker totdat ze klaar zijn om endogene fluorescentie in beeld te brengen.
  10. Plaats het weefsel in 5 ml beeldmateriaal RI-2 (zie materiaaltabel). Incubeer een nacht bij kamertemperatuur in het donker om de volledigheid van het klaringsproces te controleren voordat u immunokleuring aanbrengt. Maak referentiebeelden om de transparantie van het weefsel te controleren.

5. Blokkering en immunokleuring van CLARITY-monsters

OPMERKING: Deze stappen zijn vergelijkbaar met het blokkeren en immunokleuring van CUBIC gewiste weefsels, maar gebruiken verschillende formuleringen voor het blokkeren, wassen en kleuren van oplossingen.

  1. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met 0,1 M PBS gedurende 30 minuten telkens op kamertemperatuur en schud voorzichtig.
  2. Om een beeld te maken met een confocale microscoop, snijdt u het weefsel in plakjes van ~ 0,5-1 mm dik met behulp van een weefselsnijder en matrix van 0,5 mm. Om LSFM uit te voeren, blokkeert u het volledige weefselmonster.
  3. Blokkeer de monsters een nacht bij 4 °C met 5 ml CLARITY-blokkeringsoplossing (zie materiaaltabel) door te schudden.
  4. Kleur de monsters gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur met 5 ml primaire antilichamen (zie materiaaltabel) in een blokkerende oplossing (zonder soortspecifieke FcR) bij kamertemperatuur met schudden (optioneel: centrifugeer de antilichamen bij 2.300 x g gedurende 5 minuten voor gebruik om aggregatie van antilichamen te minimaliseren).
  5. Was het bevlekte monster vijf keer met de wasoplossing op kamertemperatuur en schud in totaal ten minste 5 uur (zie materiaaltabel).
  6. Kleur de monsters met 5 ml secundaire antilichamen (zie materiaaltabel) in blokkeeroplossing (zonder soortspecifieke FcR) gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur met schudden (optioneel: centrifugeer de antilichamen op 2.300 x g gedurende 5 minuten voor gebruik om aggregatie van antilichamen te minimaliseren). Om de totale protocolduur te verkorten, gebruikt u primaire antilichamen geconjugeerd met fluoroforen om incubatie met secundaire antilichamen te elimineren.
  7. Was het bevlekte monster vijf keer met de wasoplossing op kamertemperatuur en schud in totaal ten minste 5 uur.
  8. Kleur de monsters met 5 ml DAPI-kleuringsoplossing (zie Materiaaltabel) op elk weefselmonster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Laat de monsters in het donker bij 4°C in DAPI-kleurstofoplossing staan voor latere beeldvorming.
  9. Was de lymfoïde weefselmonsters driemaal met de wasoplossing op kamertemperatuur en schud telkens gedurende 30 minuten.
  10. Plaats het weefsel in 5 ml beeldvormende media RI-2 (R.I. = 1.46) en incubeer een nacht bij kamertemperatuur in het donker voordat het monster wordt gemonteerd (zie protocolstap 6 en 7).

6. Montage en beeldvorming van gewiste weefselmonsters voor confocale microscopie

  1. Verwijder een kant van de beschermlaag van een zelfklevende siliconenisolator.
  2. Plak een microscoopafdekglas (22 mm x 40 mm, 0,25 mm dik) op de gepelde kant van de siliconenisolator om een vloeistofdichte ruimte voor het monster te vormen.
  3. Verwijder de andere kant van de beschermlaag van de zelfklevende siliconenisolator.
  4. Plaats het monster voor beeldvorming in het midden van de siliconenisolator en voeg vervolgens CUBIC Reagens-2 of Imaging Media RI-2 toe, indien van toepassing, totdat het vloeistofoppervlak zo hoog is als de rand van de isolator.
  5. Om het opsluiten van luchtbellen in de siliconenisolator tot een minimum te beperken, lijnt u het tweede afdekglas uit en legt u het voorzichtig aan één kant naar beneden met behulp van een EM-tang. Veeg overtollige vloeistof weg. Druk het afdekglas voorzichtig rond de monsterput(ten) met behulp van de achterkant van de tang om de lijm af te dichten. Bewaar de gemonteerde monsters horizontaal in het donker.
    OPMERKING: Monsters kunnen weken tot maanden nadat ze zijn gemonteerd worden afgebeeld; De beeldkwaliteit neemt echter over het algemeen in de loop van de tijd af.
  6. Plaats het gemonteerde objectglaasje op de microscooptafel en lokaliseer het monster met wit licht en een objectief met een lagere vergroting (2-10x).
  7. Stel het fluorescentie-acquisitieprofiel in op basis van de gekozen individuele fluoroforen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om afzonderlijk afzonderlijke fluorofoorkanalen aan te schaffen. Dit resulteert in een langere acquisitietijd, maar vermindert spectrale overlap en acquisitie van niet-specifiek fluorescentiesignaal. Een gemeenschappelijk fluorofoorprofiel kan DAPI (450 nm), Alexa488, Alexa594 en Alexa647 (of verwante combinaties) omvatten om spectrale overlap tijdens beeldacquisitie te minimaliseren.
  8. Kies een geschikt vergrotingsobjectief om interessante gebieden weer te geven. Gebruik objectieven met een lagere vergroting (2-10x) voor beeldvorming van grotere volumes of volledig weefsel met een resolutie van één cel en gebruik objectieven met een hogere vergroting (20-63x) voor visualisatie met een hogere resolutie van subcellulaire details in gewist weefsel. Zorg ervoor dat de brekingsindex van objectieven, beeldvormingsmedia en weefsel zo goed mogelijk op elkaar afstemmen om de introductie van optische vervormingen tijdens beeldacquisitie te minimaliseren.
  9. Kies een stapgrootte voor Z-stack-acquisitie. Voor objectieven met een lagere vergroting (2-10x) selecteert u een stapgrootte van ~3-5 μm om fluorescentie van een individuele cel te detecteren in meerdere continue Z-plakjes voor 3D-modellering, terwijl de totale acquisitietijd en de totale bestandsgrootte worden verkort. Selecteer voor objectieven met een hogere vergroting (20-63x) een stapgrootte van ~1 μm of minder om het verlies van subcellulaire informatie tussen individuele Z-segmenten te minimaliseren.
  10. Zoom in op het gezichtsveld om het hele af te beelden weefselgebied in de X- en Y-dimensies te visualiseren met zo min mogelijk onbezet gebied. Stel de bovenste en onderste Z-fase-acquisitiecoördinaten in die het hele interessegebied omvatten dat moet worden afgebeeld.
  11. Verkrijg de Z-stack-afbeeldingen. Sla het bestand op en exporteer het voor nabewerking met behulp van software voor beeldanalyse. Converteer voor bepaalde softwaresuites de bestanden naar specifieke bestandstypen (bijv. .tiff, .ome-tiff, .jpeg, enz.). Voer de conversie uit met behulp van software voor het verkrijgen van microscoopbeelden of freeware voor beeldanalyse (bijv. ImageJ/Fiji).

7. Monteren en beeldvormen van de monsters in de LSFM-kamer of cuvet

  1. Vul de beeldvormingskamer met CUBIC Reagens-2 of RI-2, afhankelijk van het specifieke protocol dat wordt gebruikt. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het overbrengen van de vloeistof. Verwijder de overtollige bubbels met een pipet.
  2. Dompel het monster onder in de beeldkamer en beperk de beweging van het monster.
    OPMERKING: Afhankelijk van de specifieke microscoop die wordt gebruikt, kan dit het inbedden van het monster in agarose zijn, het ophangen van het monster aan een haak of stekelvarkenadapter, het 3D-printen van een monsterhouder of het bevestigen van het monster met lijm aan een plastic schaal.
  3. Plaats het doel in de beeldvormingsoplossing, gericht op het monster. Laat het gemonteerde monster enkele uren of een nacht in de beeldkamer staan om de oplossingen en weefsels in de cuvet volledig in evenwicht te houden.
  4. Verkrijg de Z-stack van het interessegebied (zie stappen 6.7-6.11 voor het verkrijgen van afbeeldingen).
    OPMERKING: Met deze benadering kunnen weefselvolumes groter dan 1 cm3 worden afgebeeld met een resolutie van één cel.

8. Oppervlaktereconstructie en celkwantificering met Imaris beeldanalysesoftware

OPMERKING: Deze stappen zijn specifiek voor Imaris-beeldanalysesoftware, maar vergelijkbare beeldverwerkingsstappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van andere softwaresuites (bijv. ImageJ/Fiji, Aivia, Arivis, Amira, enz.).

  1. Gebruik de Imaris File Converter om het Z-stack-afbeeldingsbestand te converteren naar het oorspronkelijke Imaris-formaat .ims. Dit zorgt voor een snellere bestandsconversie en minimaliseert conversiefouten en mogelijke softwareproblemen zodra deze zijn geopend.
    OPMERKING: Bij sommige nieuwere LSFM's kan de gebruiker bestanden rechtstreeks in de .ims-indeling opslaan.
  2. Sleep het .ims-bestand dat moet worden geanalyseerd naar het Arena-gebied van de Imaris-software. Pas het contrast of de intensiteit van elk kleurkanaal aan met het paneel Beeldschermaanpassing . Klik op het pictogram Nieuwe oppervlakken toevoegen in de linkerbovenhoek.
  3. Klik op Volgende: Bronkanaal (het blauwe icoontje met een pijl die naar rechts wijst). Kies het bronkanaal van het oppervlak dat u wilt construeren. Wijzig de andere parameters niet.
  4. Klik op Volgende: Drempel (het blauwe pictogram met een pijl die naar rechts wijst).
  5. Als u de drempel (absolute intensiteit) wilt aanpassen, sleept u de drempellijn naar links of rechts. Schakel Split Touching Objects in en voer de gemiddelde celdiameter in microns in als de splitsingsstandaard voor het systeem om veel stippen als oorsprong voor elk afzonderlijk oppervlak te verkrijgen.
    1. Gebruik geen fluorescerende signalen die te klein of te helder zijn, omdat deze mogelijke vlekken of microscoopartefacten kunnen vertegenwoordigen. Neem alleen de stippen op die acceptabele afmetingen en fluorescentie-intensiteiten hebben door de gemiddelde celdiameter dienovereenkomstig aan te passen.
      OPMERKING: De gemiddelde celdiameter varieert voor specifieke weefsels of celtypen, maar ligt over het algemeen tussen 5-15 μm.
  6. Klik op Volgende: Oppervlakken classificeren (het blauwe pictogram met een pijl die naar rechts wijst). Pas de op te nemen oppervlakken aan door de drempellijn naar links of rechts te slepen. Zorg ervoor dat de oppervlakken het ruwe fluorescentiesignaal precies benaderen, terwijl het fluorescentiesignaal van individuele cellen wordt gescheiden.
  7. Klik op Voltooien: Voer alle aanmaakstappen uit en beëindig de wizard (het groene pictogram met twee pijlen die naar rechts wijzen). Het oppervlak is officieel geconstrueerd.
  8. Klik op het zesde pictogram met het label Statistieken in het linkerdeelvenster om het aantal cellen te zien, in dit geval het aantal oppervlakken voor het specifieke geanalyseerde kleurkanaal.
  9. Zorg ervoor dat de vier variabelen Aantal niet-verbonden componenten per tijdstip, Aantal oppervlakken per tijdstip, Totaal aantal niet-verbonden componenten en Totaal aantal oppervlakken hetzelfde getal hebben, namelijk het aantal cellen van dat kleurkanaal.

Resultaten

Weefselopruiming omvat het behandelen van geconserveerde weefsels met chemische cocktails om ondoorzichtige biomoleculen uit het weefsel te extraheren met behoud van de weefselarchitectuur. Deze oplossingen voor het opruimen van weefsel passen de brekingsindex van het weefsel aan bij het omringende beeldmedium om optische vervormingen te minimaliseren, de signaal-ruisverhouding diep in de weefsels te verbeteren en autofluorescentie op de achtergrond te minimaliseren. Twee op water gebaseerde protocollen voor optische weefselopruiming, CUBIC3 en CLARITY9, werden gebruikt om geconserveerde HIV/SIV-geïnfecteerde hu-mouse-, niet-menselijke primaat- en menselijke weefselmonsters te wissen voorafgaand aan immunofluorescentiekleuring en beeldvorming met confocale en lichte fluorescentiemicroscopie.

Voor het CUBIC-protocol werden de gefixeerde weefsels gewassen met PBS om fixatieven te verwijderen en ondergedompeld in CUBIC Reagens-1, een basische gebufferde oplossing van aminoalcoholen die chromoforen zoals heem elueert, wat resulteert in ontkleuring en delipidatie van weefsel (Figuur 1, boven). Kleinere weefselvolumes (~ mm3) kunnen worden ontkleurd na 3 dagen behandeling met CUBIC Reagens-1, maar grotere weefselvolumes (~ cm3) of weefsels met een grote hoeveelheid heem (zoals lever, milt of hart) vereisen langere incubatietijden en oplossingsvolumes (>1 maand en ~ 50 ml), evenals frequente vervanging van de oplossing om de 2-3 dagen. Na ontkleuring werden de weefsels gewassen en in CUBIC Reagent-2 geplaatst, een sucrosehoudende oplossing met een brekingsindex van ongeveer 1,48-1,49, die overeenkomt met de brekingsindex van het weefsel en de doorlaatbaarheid van licht verhoogt. De geklaarde weefsels werden immunogekleurd en gemonteerd in een oplossing van CUBIC Reagens-2 voorafgaand aan beeldvorming met een confocale of lichtbladmicroscoop. De effecten van de CUBIC-opruimingsprocedure werden in beeld gebracht voor verschillende hu-muis- en NHP-weefsels van verschillende groottes en concentraties chromoforen (Figuur 2). Optische klaring maakte de weefsels zichtbaar zichtbaar voor het blote oog, waardoor rasterlijnen en tekst op vellen papier "door" het weefsel konden worden gezien. Chromofoorrijke weefsels zoals de milt, lever, beenmerg en hart ontkleuren mogelijk niet volledig, maar blijven geschikt voor immunokleuring en beeldvorming (Figuur 2 en Figuur 5).

Voor het CLARITY-protocol werden gefixeerde weefsels gewassen met PBS om fixatieven te verwijderen en vervolgens een nacht bij 4 °C geïncubeerd in een 40% acrylamide-oplossing met een thermische initiator om covalente bindingen te vormen tussen eiwitten in het monster en monomeren van acrylamide (Figuur 1, onder). De volgende dag, nadat het weefsel in evenwicht was gebracht tot kamertemperatuur en vervolgens was opgewarmd in een waterbad van 37 °C, werd acrylamidepolymerisatie gestart en werd het monster snel in een hydrogel ingekapseld. Het monster werd in een kuur van 2-5 dagen behandeld met een oplossing van 8% SDS om ondoorzichtige lipiden te verwijderen. Onmiddellijk voorafgaand aan de fluorescerende kleuring werd het monster ondergedompeld in een brekingsindex matching-oplossing (RIMS) voor CLARITY (Imaging Media RI-2) die 90% niet-ionisch dichtheidsgradiëntmedium bevat. Voor weefsels die grote hoeveelheden heem bevatten, kan een ontkleuringsstap worden toegevoegd aan het einde van de delipidatiestap 9,11,12. De progressie van CUBIC en CLARITY clearing werd vergeleken op verschillende secties van hetzelfde menselijke miltmonster (Figuur 3). CLARITY-clearing produceert een zichtbare polyacrylamidegel die de oplossing omhult en doorgaans een verminderde ontkleuring vertoont in vergelijking met CUBIC-clearing, tenzij een extra ontkleuringsstap wordt toegevoegd 9,12.

Vervolgens werden in beide protocollen gewiste, intacte weefsels met immunokleuring om specifieke immuuncelpopulaties te detecteren. De monsters werden gewassen, geblokkeerd met een α-FcR-bevattend reagens om niet-specifieke antilichaambinding te verminderen, en gedurende 3 dagen gekleurd bij gebruik van een primair antilichaam dat rechtstreeks aan een fluorofoor was geconjugeerd. Als alternatief werden monsters gedurende 3 dagen gekleurd met een niet-geconjugeerd primair antilichaam, gevolgd door nog eens 3 dagen met een secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor. De weefsels werden opnieuw gewassen en vervolgens 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met DAPI-kleuring voor nucleaire visualisatie. De monsters werden 's nachts in het donker gewassen en geïncubeerd in CUBIC Reagens-2 of Imaging Media RI-2 (CLARITY). Voor confocale microscopie werden weefsels voorafgaand aan de beeldvorming op een microscoopglaasje in de juiste RIMS gemonteerd (Figuur 4). Voor fluorescentiemicroscopie van lichte platen (LSFM) werden monsters 's nachts voorafgaand aan de beeldvorming volledig ondergedompeld met RIMS in een beeldvormende cuvet.

Confocale microscopie van intacte, geklaarde en immunogekleurde lymfoïde weefsels maakte gelijktijdige visualisatie mogelijk van meerdere fluorescerende signalen, waaronder kernen, immuuncelmarkers en HIV/SIV CA (capside) eiwitten (Figuur 5). Virusproducerende cellen werden bepaald door fluorescentiecolokalisatie van immuuncelmarkers en HIV-eiwitten. Geklaarde en gekleurde HIV-geïnfecteerde menselijke milt onthulde meerdere CD3+ T-cellen die co-gelokaliseerd waren met HIV p24, wat wijst op de aanwezigheid van virusproducerende cellen in een gebied van intact weefsel (Figuur 5A-D). Geklaarde en immuungekleurde SHIV-geïnfecteerde NHP-lymfeklieren onthulden de verdelingen van CD3+ T-cellen en CD68+ macrofagen in weefselgebieden waar geen virus werd gedetecteerd (Figuur 5E) naast regio's met talrijke virusproducerende cellen (Figuur 5F). Deze resultaten toonden aan dat virusproducerende cellen uit verschillende weefselbronnen te onderscheiden waren van andere cellen binnen een bepaald gezichtsveld en de detectie van zeldzame biologische gebeurtenissen binnen een complexe weefselomgeving mogelijk maakten.

Optische doorsnede van geklaarde weefsels met een confocale microscoop werd toegepast om Z-stacks en 3D-oppervlaktemodellen te genereren, die de cellulaire heterogeniteit onthulden die werd vertoond tijdens HIV-infectie (Figuur 6). Z-stacks werden gerecombineerd tot een Z-projectiebeeld met behulp van de Imaris-softwaresuite (Figuur 6A) en het DAPI-nucleaire kanaal werd verwijderd voor een duidelijke visualisatie van CD3+ T-cellen en HIV-capside-eiwit (p24) fluorescentie door volledige weefselvolumes (Figuur 6B). Z-projectiefluorescentie werd geautomatiseerd gesegmenteerd met Imaris-software om een gereconstrueerd 3D-oppervlaktemodel te genereren voor ruimtelijke visualisatie en kwantificering van het fluorescentiesignaal in de gehele Z-stack (Figuur 6C). Analyse van het 3D-oppervlaktemodel onthulde 546 CD3+ T-cellen en 218 cellen die HIV p24 produceren. Cumulatief maakte Z-stack-acquisitie van immunofluorescentie uit geklaarde, HIV-geïnfecteerde lymfoïde weefsels het mogelijk om 3D-modellen van cellulaire samenstelling in het weefsel te genereren en geautomatiseerde kwantificering van immuuncelpopulaties binnen weefselvolumes.

LSFM van intacte, geklaarde en immunogekleurde lymfoïde weefsels maakte immunofluorescentie (IF) beeldvorming met een groter volume mogelijk van de distributie van immuuncellen en virusproducerende cellen in de lymfoïde weefsels (Figuur 7). Immunokleuring van colonweefsel van een HIV-geïnfecteerde hu-mouse voor hCD3+ T-cellen en HIV p24 onthulde foci van virusproducerende cellen verspreid over grote weefselgebieden zonder bewijs van infectie (Figuur 7A). Een ingezoomd beeld van een brandpunt van virusproducerende cellen onthulde meerdere virusproducerende cellen in de nabijheid van potentiële doelwitcellen (Figuur 7B). Weefselautofluorescentie (rode waas) werd gebruikt om de hele weefselarchitectuur te visualiseren en tegelijkertijd specifieke immuuncelpopulaties in het weefsel te onderscheiden die helderder kleurden dan de autofluorescentie (rode ovalen). Een 3D-model van het gehele LSFM Z-stack-volume toonde de ruimtelijke verdeling van foci van virusproducerende cellen in een gebied van intact weefsel en maakte het mogelijk om locaties van virusproductie in kaart te brengen ten opzichte van de algehele weefselarchitectuur (Figuur 7C). Verrassend genoeg werden brandpunten van virusproducerende cellen vaak afgewisseld tussen grote weefselgebieden zonder bewijs van virusproductie. Deze resultaten kunnen het mogelijk maken om parameters van virusdistributie en geïnfecteerde celdichtheid binnen verschillende weefsels en op verschillende tijdstippen van infectie of respons op verschillende behandelingen te kwantificeren.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van typische CUBIC en CLARITY weefselopruiming, immunokleuring en beeldvorming. De opruimtijden van CUBIC (boven) en CLARITY (onder) kunnen sterk variëren, afhankelijk van de grootte en het type weefsel. Voor CLARITY-klaring is een extra incubatiestap met brekingsindex-gematchte media vereist voorafgaand aan immunokleuring om te controleren of het weefsel helder is. Immunokleuring duurt doorgaans 3 dagen wanneer primaire antilichamen worden geconjugeerd met fluoroforen en 6 dagen als fluorescerende secundaire antilichamen nodig zijn. Monsters kunnen worden afgebeeld met een confocale of LSFM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: KUBIEKE Opruiming van hu-mouse en NHP weefselmonsters. Afhankelijk van de verschillende dichtheden van heem en lipiden van de weefselmonsters, varieert de tijd die nodig is voor het opruimen van elk weefseltype. De dikke darm en de twaalfvingerige darm hebben bijvoorbeeld doorgaans relatief korte perioden nodig (~7 dagen), terwijl het langer kan duren voordat de milt en lever transparant worden (~30 dagen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Longitudinale vergelijking van weefselopruimingsmethoden op menselijke monsters. CUBIC (bovenste panelen) en CLARITY (onderste panelen) ontruimde milt van een met HIV geïnfecteerde persoon die antiretrovirale therapie kreeg. Beide methoden ruimden het weefsel op dag 32 voldoende op voor immunokleuring en beeldvorming. De ontkleuringsstap voor de CUBIC-methode vermindert zichtbaar de autofluorescentie die wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van heem in miltmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Monstermontage voor confocale microscopie. Monsters werden gemonteerd tussen dekglaasjes gescheiden met zelfklevende siliconenisolatoren van 0,5-1 mm. Siliconenisolatoren werden op het eerste dekglaasje geplakt en er werd weefsel in het midden van de put (boven) geplaatst. De put werd gevuld met RIMS totdat de meniscus ter hoogte van of iets boven de bovenkant van de put was (links). Het tweede dekglaasje werd voorzichtig van de ene naar de andere kant op zijn plaats neergelaten, om luchtbellen (onderkant) te voorkomen. Dekglaasjes werden volledig aan de siliconenisolator gehecht door voorzichtig met een stomp instrument rond de omtrek van de put te gaan (rechts). Monsters werden afgebeeld in een standaard confocale microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Confocale microscopie van geklaarde, intacte menselijke milt en NHP-lymfeklieren. (A-D) Geruimd HIV-geïnfecteerd menselijk weefsel werd gekleurd voor HIV-1 p24 (groen), hCD3+ T-cellen (rood) en kernen (cyaan). (E) Confocale Z-plak van CUBIC geklaarde lymfeklier van een SHIV-geïnfecteerde NHP 8 weken na infectie immuungekleurd voor CD3+ T-cellen (magenta), CD68+ macrofagen (mac/rood), SHIV p27 (groen) en kernen (blauw). Gezichtsveld bevat T-cellen, macrofagen en andere celtypen, maar geen bewijs van SHIV-producerende cellen (groen). F) Confocale Z-plak van een aangrenzend gebied van dezelfde lymfeklier met verschillen in celdichtheid en aantal, samen met de aanwezigheid van virus dat CD3+ T-cellen (groene pijlen) en CD68+ macrofagen (gele pijlen) produceert. (G-I) Ingezoomde weergave van geselecteerde gebieden van p27-kleuring vanaf (F). Schaalbalken zijn 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Z-stack volume en 3D gereconstrueerd oppervlak van HIV-geïnfecteerde menselijke milt. (A) Z-projectiebeeld van 600 μm x 600 μm x 100 μm Z-stapel van HIV-geïnfecteerd menselijk miltweefsel gekleurd voor HIV-1 p24 (groen), hCD3+ T-cellen (rood) en kernen (cyaan). (B) Hetzelfde Z-projectiebeeld zonder nucleaire DAPI-kleuring. (C) Gereconstrueerd 3D-oppervlaktemodel van CD3 (rood) en p24 (groen) fluorescentie van het gehele Z-stack-volume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: LSFM en 3D-reconstructie van oppervlaktevolumes van HIV-geïnfecteerde weefsels (A) Z-plak (1.000 μm x 1.000 μm) dikke darm van een HIV-geïnfecteerde hu-muis die immuungekleurd is voor CD3+ T-cellen (rood) en HIV p24 (groen). De doffe rode waas staat voor autofluorescentie van weefsel, terwijl de duidelijke rode stipta T-cellen aangeeft. Villi zijn zichtbaar rond de periferie, wijzend naar het centrale lumen, met verschillende brandpunten van actieve virusproductie (witte pijlen) verspreid over grote gebieden die geen virus bevatten. Vak geeft bij benadering het interessegebied aan voor paneel B. (B) Gezoomd weefselgebied met individueel virus dat hCD3+ T-cellen produceert (geel) in de nabijheid van niet-geïnfecteerde T-cellen (rood). Het beeld werd geroteerd en veranderd in een nabijgelegen Z-segment om een focus van p24-positieve cellen in één enkel Z-vlak te laten zien. Achtergrond rode autofluorescentie toont algemene weefselarchitectuur naast specifieke hCD3+ T-celkleuring (rode puncta; witte pijlen). (C) 3D-oppervlaktemodel van het volledige volume (1.000 μm x 1.000 μm x 200 μm) gegenereerd met Imaris-software, geroteerd om brandpunten van HIV-infectie (geel) op verschillende locaties van de darm te tonen. Witte pijlen geven individuele brandpunten binnen het volume aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Lymfoïde weefsels die van belang zijn, moeten snel postmortaal worden verzameld en onmiddellijk in voorgekoelde fixatieve buffers worden geplaatst om weefselnecrose (donker of zwart weefsel) te voorkomen die een negatieve invloed kan hebben op kleuring en beeldvorming. Na het oogsten van de gewenste weefsels, dompelt u de weefsels onmiddellijk 's nachts onder in ijskoud 4%-8% paraformaldehyde (PFA) voor fixatie, waardoor ook potentiële ziekteverwekkers die met de monsters zijn geassocieerd, worden geïnactiveerd. 4% PFA is optimaal voor het fixeren van LM-monsters, terwijl 8% PFA weefsels adequaat kan conserveren voor zowel LM als EM. Door deze procedures te volgen en monsters in fixatief bij 4 °C in het donker te bewaren, kunnen weefsels effectief worden bewaard voor LM-beeldvorming gedurende meerdere jaren. Een voorbehoud is dat langdurige opslag in fixatief kan leiden tot de introductie van kleuringsartefacten, met name antigeenmaskering die wordt veroorzaakt door verknoping van aangrenzende eiwitten met het eiwit van belang, wat de toegankelijkheid van kleuringsantilichamen tegen het epitoop kan belemmeren13,14. Als de weefsels endogeen tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten bevatten, neem dan maatregelen om te voorkomen dat de weefsels gedurende het hele protocol zoveel mogelijk aan licht worden blootgesteld. Doorgaans behouden endogene fluorescerende eiwitten fluorescentie gedurende 6-12 maanden na fixatie, maar individuele weefselmonsters kunnen gedurende langere of kortere perioden variëren. Als endogene fluorescentie verloren gaat als gevolg van eiwitafbraak, kunnen fluorescerende eiwitten vaak worden gedetecteerd met behulp van een primair antilichaam dat specifiek is voor het eiwit van belang. Perfusie is een andere optie voor het snel fixeren van weefsels voorafgaand aan het opruimen12; vanwege zorgen bij het werken met ziekteverwekkers zoals HIV, werd echter gekozen voor de route van weefselobductie gevolgd door onderdompeling in ijskoud fixatief om monsters zo veilig mogelijk voor te bereiden.

Een voordeel van de beschreven reinigingsprotocollen op waterbasis is dat ze over het algemeen milder zijn dan biologische protocollen, die soms weefsels kunnen beschadigen die kwetsbaarder zijn, zoals de lever. Op water gebaseerde opruimingsprotocollen hebben over het algemeen meer tijd nodig om volledige monsteropruiming te bereiken (weken versus dagen) in vergelijking met op organische gegevens gebaseerde opruimingsprotocollen. De CLARITY- en CUBIC-protocollen kunnen sneller worden uitgevoerd met behulp van perfusie om tegelijkertijd alle organen in een knaagdier te verwijderen11,12; dit was echter geen haalbare optie voor NHP en menselijke autopsies. Monsters die met CLARITY zijn verwerkt, vertonen meestal enige volume-uitbreiding, terwijl CUBIC een verminderde invloed op monstervolume9 liet zien. Hoewel over het algemeen sneller, zorgen veel protocollen voor het opruimen van organisch weefsel ervoor dat weefsels krimpen15, waardoor de detectie van eencellige of subcellulaire details moeilijker waar te nemen kan zijn in celdichte weefsels zoals lymfeklieren en milt. Expansie geïnduceerd door opruiming kan de resolutie van de beeldvorming effectief verhogen, waardoor het gemakkelijker wordt om aspecten waar te nemen die moeilijk waar te nemen zouden zijn in de oorspronkelijke grootte van het weefsel. Als alternatief kan weefselkrimp de totale grootte van het monster effectief verkleinen, waardoor beeldvorming van het hele orgaan zonder dissectie mogelijk kan worden. Een voordeel van zowel het CLARITY- als het CUBIC-protocol is dat ze de fluorescentie van endogeen tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten in weefsel behouden, terwijl ze vatbaar blijven voor immunofluorescentiekleuring11,12. Immunokleuring kan worden uitgevoerd met behulp van waterige of organische weefselopruimingsmethoden; persoonlijke ervaring toonde echter een groter aandeel antilichaamcompatibiliteit aan met behulp van protocollen op waterbasis in vergelijking met biologische protocollen. Onderzoekers moeten overwegen welke methode voor het opruimen van weefsel ze moeten gebruiken op basis van het afgebeelde weefsel of de weefsels en de behandelde biologische vragen (bijv. beeldvorming van het hele orgaan versus beeldvorming van een specifiek interessegebied). Er is geen universele techniek voor het opruimen van weefsels die een robuuste kant-en-klare analyse mogelijk maakt voor alle beeldvormingsvragen met grote volumes, en de beschikbare methoden vertonen duidelijke voor- en nadelen, afhankelijk van de biologische toepassing.

Bij het uitvoeren van antilichaamkleuring moet met tal van aspecten rekening worden gehouden. Omdat CLARITY-monsters zijn ingebed in acrylamidehydrogel, hebben ze meestal meer tijd nodig voor incubatie12. De tijd die nodig is voor de incubatie van antilichamen hangt ook af van het volume en de dikte van elk monster. De meeste hier beschreven monsters waren ~ 2-3 millimeter dik en 3 dagen was voldoende voor volledige kleuring door het hele weefsel. Als het doel is om een heel muizenbrein in beeld te brengen, kan de incubatietijd van antilichamen 1 week of langer duren12. Het kiezen van een methode voor het opruimen van waterig versus organisch weefsel voor immunofluorescentiebeeldvorming kan afhangen van de compatibiliteit met antilichamen. Over het algemeen is voor CUBIC of CLARITY het slagingspercentage voor antilichamen die werken in gekweekte cellen en weefsels ~70%. Of het nu gaat om het gebruik van een waterige of organische weefselopruimingsmethode, het is noodzakelijk om de compatibiliteit en effectiviteit van alle antilichamen met de specifieke gebruikte methode te beoordelen. Zoals weergegeven in dit protocolgedeelte, vindt immunokleuring voor CUBIC en CLARITY verwerkte monsters plaats nadat de clearing is voltooid. Integendeel, deze stap vindt plaats vóór de goedkeuringsprocedure voor sommige op biologische producten gebaseerde protocollen, gevolgd door de nafixatie.

Het is van cruciaal belang dat weefsels volledig worden ondergedompeld in een beeldvormingsmedium dat overeenkomt met hun brekingsindex. Als u dit niet doet, ontstaan er sferische aberraties tijdens de beeldvorming en vervormt het licht dat tijdens de beeldacquisitie wordt opgevangen. Er moet voor worden gezorgd dat alle luchtbellen van de beeldmedia worden verwijderd bij het monteren van monsters voor zowel confocale als LSFM, aangezien bellen het pad van het licht naar of weg van het monster kunnen verstoren. Luchtbellen kunnen handmatig worden verwijderd met een pipet voordat het monster definitief wordt gemonteerd. Voor het afbeelden van dikkere monsters met een confocale microscoop kunnen meerdere siliconen afstandhouders op elkaar worden gelaagd om weefsels van meer dan 0,5 mm dik op te vangen. Een aanbeveling is om alle weefsels in RIMS gedurende enkele uren tot 's nachts in evenwicht te brengen terwijl ze op de microscoop zijn gemonteerd zonder extra monsterbeweging. Volledige equilibratie van het weefsel en de beeldvormingsmedia voorkomt vermenging van oplossingen met niet-overeenkomende brekingsindices die tijdens beeldvorming aberraties kunnen veroorzaken. Het is belangrijk om te onthouden dat er bij het monteren van geklaarde weefselmonsters geen enkele kant-en-klare montagemethode is om alle monsters in alle microscopen af te beelden. Dit protocol bespreekt opties voor monstermontage die in één context optimaal werkten, maar er zijn tal van benaderingen voor monstermontage, afhankelijk van de individuele microscoop die wordt gebruikt en de biologische vraag die wordt behandeld. Deze benaderingen kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het inbedden van het monster in agarose, het ophangen van het monster aan een haak of met brekingsindex overeenkomende plastic lijn, het gebruik van een stekelvarkenadapter, het 3D-printen van een monsterhouder of het bevestigen van het monster met lijm aan een plastic schaal.

Confocale microscopen kunnen goed werken voor het afbeelden van weefselvolumes ~1 mm3-1 cm3. Gebruik voor confocale microscopen een 2-10x objectief om in eerste instantie interessegebieden te lokaliseren en Z-stacks met een groter volume of heel weefsel te verkrijgen met een resolutie van één cel. Schakel over naar 20-63x objectieven voor het verkrijgen van afbeeldingen met een hogere resolutie van specifieke interessegebieden met subcellulaire informatie. Het ideale doel voor het afbeelden van CUBIC en CLARITY geclearde weefsels is een CLARITY/Scale-specifiek doel dat nauwkeurig is afgestemd op de brekingsindex van het weefsel en de beeldvormingsoplossing. Als dit type objectief niet beschikbaar is, is het optimaal om monsters af te beelden met een glycerol- of olie-immersieobjectief (bijv. LD LCI Plan-Apochromat 25 x 0,8 NA Imm Corr DIC M27 multi-immersieobjectief: werkafstand = 0,57 mm) in plaats van een luchtobjectief. Dit minimaliseert het introduceren van optische vervormingen als gevolg van niet-overeenkomende brekingsindices tijdens het vastleggen van afbeeldingen. De 20-25x-objectieven kunnen een evenwicht vinden tussen beeldacquisitie met een groter volume en het verkrijgen van kleuringsdetails van individuele cellen in een complexe weefselomgeving. Belangrijk is dat de meeste confocale microscopen modules bevatten die 3D-tegels van beeldvolumes mogelijk maken. Dit type beeldacquisitie kan idealiter grotere Z-stacks genereren die subcellulaire informatie bevatten.

LSFM-beeldvorming kan 3D-visualisatie van specifieke celpopulaties mogelijk maken in de context van grote hoeveelheden weefsel (>1cm3) en zelfs hele organen. In de afgelopen 10 jaar was weefselopruiming in combinatie met LSFM grotendeels gericht op het begrijpen van hersenconnectiviteit bij knaagdieren; Meer recente toepassingen zijn echter onder meer het visualiseren van tumormetastatische landschappen16, celdistributie binnen anatomische compartimenten 9,17 en verspreiding van pathogenen18. In vergelijking met gekweekte cellen zijn de meeste biologische gebeurtenissen in weefsels niet-uniform en LSFM kan bijzonder bedreven zijn in het visualiseren en kwantificeren van de ruimtelijke weefselheterogeniteit van deze gebeurtenissen (bijv. virusreplicatie, immuunsignalering, celdistributie, enz.).

3D-datasets die via confocale of LSFM zijn verkregen, kunnen worden nabewerkt met tal van beeldanalyseplatforms. De Imaris-softwaresuite kan worden gebruikt voor de constructie van oppervlakken, het genereren van 3D-animatie en celkwantificering; Er zijn echter tal van beeldanalysesystemen beschikbaar die een efficiënte nabewerking en analyse van beelden mogelijk maken. ImageJ/Fiji freeware19 is een aantrekkelijk alternatief beeldverwerkingsplatform dat toegankelijk is voor de meeste laboratoria, maar er is geen one-size-fits-all analysesoftware die uitblinkt in alle vormen van beeldanalyse en visualisatie. Veel softwaresuites voor beeldanalyse kunnen onbetaalbaar zijn als ze niet beschikbaar zijn via faciliteiten voor gedeeld gebruik. Ten slotte is gegevensbeheer een cruciaal aspect van LSFM of grote betegelde confocale 3D-datasets. Deze beeldvormingsplatforms kunnen enorme bestanden (>1 Tb) genereren waarvoor geavanceerde computerwerkstations nodig zijn voor gegevensvisualisatie en -kwantificering. Uiteindelijk kan deze beeldvormingsworkflow de verwerving en kwantificering van ruimtelijk verschillende celpopulaties in hele weefsels stroomlijnen en is deze breed toepasbaar op de meeste weefselbronnen en biologische systemen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dank aan de Universiteit van Illinois van het Urbana-Champaign Institute for Genomic Biology Core Facilities voor het gebruik van confocale en light sheet fluorescentiemicroscopen. Dank aan de geweldige individuen van het cohort "The Last Gift" voor monsters van menselijk weefsel, dat werd gefinancierd door de volgende subsidies: I147821, DA051915, AI131385 en P30 AI036214. Dank aan Nancy Haigwood en Ann Hessell voor SHIV-geïnfecteerde NHP-weefselmonsters.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylamide Solution (in 0.1 M PBS, 40 mL in totaal)
40% Acrylamide: 4 mLBio-Rad1610144
VA-044 Thermische Initiator: 0,1 gFujifilm011-19365
CLARITY Blocking oplossing (in 0.1 M PBS, 5 mL in totaal)
Fetaal bovien serum (FBS): 200 µLAtlas BiologicalsF-0500-D
Rat anti-human of anti-muis FcR: 50 µLMiltenyi130-092-575(muis)/130-059-901(mens)
Sodium azide (uit stockoplossing): 5 µLSigma71289-50G
Tween-20: 5 µLFisher ScientificBP337-500
CLARITY wasoplossing (in 0.1M PBS, 50 mL in totaal)
Sodium azide (uit stockoplossing): 50 µLSigma71289-50G
Tween-20: 50 µLFisher ScientificBP337-500
CUBIC Blocking oplossing (in 0.1M PBS, 5 mL in totaal)
Fetaal bovien serum (FBS): 200 µLAtlas BiologicalsF-0500-D
Rat anti-human of anti-muis FcR: 50 µLMiltenyi130-092-575(muis)/130-059-901(mens)
Sodium azide (uit stockoplossing): 5 µLSigma71289-50G
Triton X-100: 5 µLVWRM143-1L
CUBIC Reagens-1 (in 0.1M PBS, 50 mL in totaal)
N, N, N’, N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine: 12,5 gAldrich122262
Triton X-100: 7,5 gVWRM143-1L
Urea: 12,5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC Reagens-2 (in 0.1M PBS, 50 mL in totaal)
Sucrose: 25 gSigmaS1888-500G
Sodium azide (in poedervorm): 10 gSigma71289-50G
Sodium azide stockoplossing (in DI H2O, 50 mL in totaal)Sigma71289-50G
Triethanolamine: 5 gSigma90270-500mL
Triton X-100: 50 µLVWRM143-1L
Urea: 12,5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC wasoplossing (in 0.1M PBS, 50 mL in totaal)
Sodium azide (uit stockoplossing): 50 µLSigma71289-50G
Triton X-100: 50 µLVWRM143-1L
DAPI kleuring oplossing (0,5 µg/mL)
DAPI stockoplossing: 1 µL
Wasoplossing: 10 mL
DAPI stockoplossing (5 mg/mL)
DAPI poeder: 5 mgSigma-AldrichD9542-1MG
DMSO (100%): 1 mLThermoFisherD12345
Imaging Media RI-2 (in dH2O)
90% HistodenzSigmaD2158-100G
0,01% Sodium azideSigma71289-50G
0,02 Natriumfosfaatbuffer, pH 7,5 Sigma-AldrichS9638-250G
0,1% Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Primaire antilichamen (in blokkeringsoplossing zonder rat anti-muis FcR, 2 mL in totaal)
Geit anti-HIV p24: 10 µL (1:200)Creative DiagnosticsDPATB-H81692
Muis anti-menselijk CD68: 10 µL(1:200)DakoM0876
Konijn anti-menselijk CD3: 10 µL (1:200)DakoA0452
8% SDS oplossing (in 0.1 M PBS, 50 mL in totaal)
SDS poeder: 4 gSigma-AldrichL3771-500G
Secundaire antilichamen (in blokkeringsoplossing zonder rat anti-muis FcR, 2 mL in totaal)
Ezel anti-geit geconjugeerd met AlexaFluor647: 2 µLInvitrogenA21447
Ezel anti-muis geconjugeerd met AlexaFluor594: 2 µLInvitrogenA21203
Ezel anti-konijn geconjugeerd met AlexaFluor488: 2 µLInvitrogenA21206

Referenties

  1. Spalteholz, W., Barker, L. F., Mall, F. P. Hand-Atlas of Human Anatomy. , J.B. Lippincott Co. Philadelphia. Second edition in English (1907).
  2. Jacob, T., Gray, J. W., Troxell, M., Vu, T. Q. Multiplexed imaging reveals heterogeneity of PI3K/MAPK network signaling in breast lesions of known PIK3CA genotype. Breast Cancer Research and Treatment. 159 (3), 575-583 (2016).
  3. Kieffer, C., Ladinsky, M. S., Ninh, A., Galimidi, R. P., Bjorkman, P. J. Longitudinal imaging of HIV-1 spread in humanized mice with parallel 3d immunofluorescence and electron tomography. eLife. 6, 23282(2017).
  4. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  5. Compton, A. A., Schwartz, O. They might be giants: Does syncytium formation sink or spread HIV infection. PLoS Pathogens. 13 (2), 2-8 (2017).
  6. Symeonides, M., et al. HIV-1-induced small T cell syncytia can transfer virus particles to target cells through transient contacts. Viruses. 7 (12), 6590-6603 (2015).
  7. Sharova, N., Swingler, C., Sharkey, M., Stevenson, M. Macrophages archive HIV-1 virions for dissemination in trans. The EMBO Journal. 24 (13), 2481-2489 (2005).
  8. Colby, D. J., et al. Rapid HIV RNA rebound after antiretroviral treatment interruption in persons durably suppressed in Fiebig I acute HIV infection. Nature Medicine. 24 (7), 923-926 (2018).
  9. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. eLife. 8, 46916(2019).
  10. Buettner, M., Bode, U. Lymph node dissection--understanding the immunological function of lymph nodes. Clinical and Experimental Immunology. 169 (3), 205-212 (2012).
  11. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10, 1860-1896 (2015).
  12. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  13. Sompuram, S. R., Vani, K., Bogen, S. A. A molecular model of antigen retrieval using a peptide array. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 91-98 (2006).
  14. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. The journal of histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  15. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  16. Guldner, I. H., et al. An Integrative platform for three-dimensional quantitative analysis of spatially heterogeneous metastasis landscapes. Scientific Reports. 6, 24201(2016).
  17. Muntifering, M., et al. Clearing for deep tissue imaging. Current Protocols in Cytometry. 86 (1), 38(2018).
  18. DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 00796(2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

WeefselverhelderingCUBIC techniekCLARITY techniekconfocale microscopielight sheet microscopieoptische doorsnedenvirus gastheerinteracties
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.