Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62442

⸱

12 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology, Third Military Medical University, 2Guanghua School of Stomatology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Stomatological Hospital, Sun Yat-Sen University, 3Shigatse Branch, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Department of Emergency Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 5Cancer Center, The General Hospital of Western Theater Command

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Samenvatting

T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong en aanvulling van tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen in de tumormicro-omgeving (TME) blijven echter onduidelijk. Dit protocol maakt gebruik van de B16F10-OVA melanoom cellijn, die stabiel het surrogaat neoantigeen, ovalbumine (OVA) en TCR transgene OT-I muizen tot expressie brengt, waarin meer dan 90% van de CD8 + T-cellen specifiek het OVA-afgeleide peptide OVA257-264 (SIINFEKL) herkennen dat is gebonden aan het klasse I major histocompatibiliteitscomplex (MHC) molecuul H2-Kb. Deze kenmerken maken de studie van antigeenspecifieke T-celresponsen tijdens tumorigenese mogelijk.

Door dit model te combineren met tumortransplantatiechirurgie, werden tumorweefsels van donoren getransplanteerd in tumor-gematchte syngenetische ontvangermuizen om de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen in getransplanteerde donorweefsels nauwkeurig te traceren, waardoor de immuunresponsen van tumor-inherente en periferie-afkomstige antigeen-specifieke CD8 + T-cellen. Er bleek een dynamische overgang plaats te vinden tussen deze twee populaties. Gezamenlijk heeft dit experimentele ontwerp een andere benadering geboden om de immuunresponsen van CD8 + T-cellen in TME nauwkeurig te onderzoeken, wat nieuw licht zal werpen op de tumorimmunologie.

Inleiding

CD8+ T-cel-gemedieerde immuunrespons speelt een cruciale rol bij het beheersen van tumorgroei. Tijdens tumorigenese worden naïeve CD8+ T-cellen geactiveerd bij antigeenherkenning op een MHC klasse I-beperkte manier en differentiëren vervolgens in effectorcellen en infiltreren in tumormassa 1,2. Binnen de tumormicro-omgeving (TME) drijven langdurige blootstelling aan antigeen, evenals immunosuppressieve factoren, geïnfiltreerde tumorspecifieke CD8 + T-cellen echter in een hyporesponsieve toestand die bekend staat als "uitputting"3. Uitgeputte T-cellen (Tex) onderscheiden zich van effector- of geheugen-T-cellen die worden gegenereerd bij acute virale infectie, zowel transcriptioneel als epigenetisch. Deze Tex-cellen worden voornamelijk gekenmerkt door de aanhoudende en verhoogde expressie van een reeks remmende receptoren en het hiërarchische verlies van effectorfuncties. Verder resulteert de verminderde proliferatieve capaciteit van uitgeputte CD8+ T-cellen in afnemende aantallen tumorspecifieke T-cellen, zodanig dat de resterende CD8+ T-cellen in de TME nauwelijks voldoende beschermende immuniteit tegen tumorprogressie kunnen bieden3. Het behoud of de versterking van intratumorale antigeenspecifieke CD8+ T-cellen is dus onmisbaar voor tumorrepressie.

Bovendien wordt aangenomen dat immuun checkpoint blokkade (ICB) therapie Tex in tumoren nieuw leven inblaast door de infiltratie van T-cellen en dus T-celaantallen te verhogen en T-celfuncties te verjongen om tumorrepressie te stimuleren. De wijdverspreide toepassing van ICB-behandeling heeft het landschap van kankertherapie veranderd, met een aanzienlijke subgroep van patiënten die duurzame responsenervaren 4,5,6. Toch reageren de meeste patiënten en kankersoorten niet of slechts tijdelijk op ICB. Ontoereikende T-celinfiltratie in de TME is gepostuleerd als een van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voorICB-weerstand 7,8.

Verschillende studies hebben de heterogeniteit van tumor-infiltrerende CD8+ T-cellen (TILs) aangetoond bij zowel patiënten als muismodellen 9,10,11,12. Het is bevestigd dat een subset van CD8 + T-cellen die T-celfactor-1 (TCF1) in een tumormassa tot expressie brengen, stamcelachtige eigenschappen vertoont, die verder aanleiding kunnen geven tot terminaal uitgeputte T-cellen en verantwoordelijk is voor de proliferatie-uitbarsting na ICB-therapie 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Het is echter bewezen dat slechts een klein deel van de antigeenspecifieke TCF1+CD8+ T-cellen in de TME aanwezig is en een uitgebreide pool van gedifferentieerde nakomelingen genereert als reactie op ICB 23,24,25,26. Of de beperkte omvang van deze populatie voldoende is om de persistentie van cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) te garanderen om tumorprogressie onder controle te houden, blijft onbekend en of er aanvulling is vanuit periferieweefsels vereist verder onderzoek. Bovendien suggereert recent onderzoek de onvoldoende revitaliseringscapaciteit van reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen en het verschijnen van nieuwe, voorheen niet-bestaande clonotypen na anti-geprogrammeerde celdoodeiwit 1-behandeling. Dit geeft aan dat de T-celrespons op checkpointblokkade te wijten kan zijn aan de nieuwe instroom van een duidelijk repertoire van T-celklonen27. Samen met de aanwezigheid van omstanders niet-tumor-reactieve cytotoxische T-celfractie in de TME, leidden deze bevindingen tot de oprichting van een tumor allograftmodel om de rol van periferie-afgeleide CD8 + T-cellen11 te bestuderen.

Tot nu toe werden verschillende soorten tumorimplantatie, evenals immuuncel adoptieve overdracht, op grote schaal gebruikt op het gebied van tumorimmunologie28. TILs, perifere mononucleaire bloedcellen en tumorreactieve immuuncellen afkomstig uit andere weefsels kunnen goed worden gekarakteriseerd met behulp van deze methoden. Bij het bestuderen van de interacties tussen systemische en lokale antitumorimmuniteit lijken deze modellen echter ontoereikend om de interacties tussen immuuncellen afgeleid van de periferie en de TME te onderzoeken. Hier werden tumorweefsels getransplanteerd van donoren in tumor-gematchte ontvangermuizen om de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen nauwkeurig te traceren en de van de donor afgeleide cellen in de TME tegelijkertijd te observeren.

In deze studie werd een murine syngenetisch model van melanoom vastgesteld met de B16F10-OVA melanoom cellijn, die stabiel het surrogaat neoantigeen ovalbumine tot expressie brengt. TCR transgene OT-I muizen, waarbij meer dan 90% van de CD8+ T cellen specifiek het OVA-afgeleide peptide OVA257-264 (SIINFEKL) herkennen gebonden aan het klasse I MHC molecuul H2-Kb, maken de studie van antigeenspecifieke T-celresponsen mogelijk die zijn ontwikkeld in het B16F10-OVA tumormodel. Door dit model te combineren met tumortransplantatie, werden de immuunresponsen van tumor-inherente en periferie-afkomstige antigeen-specifieke CD8 + T-cellen vergeleken om een dynamische overgang tussen deze twee populaties te onthullen. Gezamenlijk heeft dit experimentele ontwerp een andere benadering geboden om de immuunresponsen van CD8 + T-cellen in de TME nauwkeurig te onderzoeken, wat nieuw licht werpt op de dynamiek van tumorspecifieke T-celimmuunresponsen in de TME.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muisexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Dierverzorgings- en Gebruikscommissies van de Derde Militaire Medische Universiteit. Gebruik 6-8 weken oude C57BL/6 muizen en naïeve OT-I transgene muizen met een gewicht van 18-22 g. Gebruik zowel mannelijk als vrouwelijk zonder randomisatie of 'verblinding'.

1. Bereiding van medium en reagentia

  1. Bereid celkweekmedium D10 zoals eerder beschreven29 door 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine toe te voegen aan Dulbecco's Modified Eagle Medium.
  2. Bereid celkweekmedium R10 voor door RPMI-1640 aan te vullen met 10% FBS, 100 E / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine.
    OPMERKING: De kweekmedia, D10 en R10, kunnen ten minste 2 weken steriel en stabiel blijven wanneer ze bij 2-4 °C worden bewaard.
  3. Bereid fluorescentie-geactiveerde celsorteringsbuffer (FACS) voor door 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aan te vullen met 2% FBS en 0,01% natriumazide.
    OPMERKING: Met de toevoeging van natriumazide kan FACS Buffer maandenlang bij 2-4 °C worden bewaard.
  4. Bereid rode bloedcellysis (RBL) buffer door 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen aan dubbel gedestilleerd water en de pH aan te passen aan 7,3.
    OPMERKING: RBL-buffer is tot 3 maanden stabiel bij kamertemperatuur (RT).
  5. Bereid magnetisch geactiveerde celsorteringsbuffer (MACS) voor door PBS aan te vullen met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA.
    OPMERKING: De oplossing moet door een filter van 0,22 μm worden geleid nadat het reagens is opgelost en in asepsis is bewaard.
  6. Bereid een werkoplossing van 2,2,2-tribroomethanol.
    1. Los 2,5 g 2,2,2-tribroomethanol op in 5 ml tert-amylalcohol (2-methyl-2-butanol). Roer er een dampbadende vibrator met constante temperatuur in bij 180 rpm, 40 °C 's nachts.
    2. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm in een steriele container. Voeg dubbel gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 200 ml en meng grondig en continu totdat de oplossing helder en transparant wordt.
    3. Bepaal en pas de pH-waarde van de oplossing aan op 7,3. Wikkel de container volledig in met aluminiumfolie om licht uit te sluiten en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de werkoplossing van 2,2,2-tribromoethanol is 12,5 mg/ml. Een meer geconcentreerde oplossing wordt niet aanbevolen omdat het materiaal bij hogere concentraties irriterend is. Test de pH-waarde van de werkoplossing vóór elk gebruik en gooi deze weg als de pH lager is dan 5.

2. Bereiding van B16F10-OVA-celsuspensie

OPMERKING: Celkweek moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskap onder strikte aseptische omstandigheden.

  1. Ontdooi en kweek een injectieflacon met B16F10-OVA-cellen met D10 in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Wanneer de cellen de samenvloeiing van ongeveer 80-90% bereiken, subcultureren de cellen.
    1. Verwijder het kweekmedium met een pipettor en spoel de cellen tweemaal met PBS.
      OPMERKING: Voeg PBS niet krachtig toe aan de aanhangende cellen in de kolf of celkweekschaal. Pipetteer in plaats daarvan de PBS naar een zijwand of voeg het druppelsgewijs toe aan de kolf of schaal.
    2. Verwijder de PBS en voeg 1-2 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de kolf of schaal. Schommel het heen en weer om het hele celoppervlak te bedekken. Plaats de kolf of schaal in een incubator bij 37 °C gedurende ~1 min of bij RT totdat de cellen loskomen.
      OPMERKING: Een omgekeerde microscoop kan worden gebruikt om te controleren of de cellen zijn losgekomen.
    3. Voeg verse D10 toe om de trypsinisatie te stoppen. Pipetteer de suspensie op en neer om ervoor te zorgen dat alle cellen los staan van de kolf of het oppervlak van de schaal.
    4. Breng de B16F10-OVA-celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 125 × g gedurende 5-7 minuten bij RT.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met D10. Doseer de B16F10-OVA-celsuspensie in een nieuwe kolf of celkweekschaal met D10 en incubeer in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Oogst op de dag van de tumorimplantatie B16F10-OVA-cellen die ~ 90% confluent zijn zoals beschreven in stappen 2.2.1 tot 2.2.4. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml PBS.
  4. Tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer met behulp van 0,4% trypan blauw. Pas de celdichtheid aan op 1 × 106 cellen per 100 μL door PBS toe te voegen. Houd de cellen op ijs.

3. Ectopische tumorimplantatie van B16F10-OVA-cellen in het liesgebied van muizen

  1. Gebruik 6-8 weken oude C57BL/6 muizen met een gewicht van 18-22 g. Gebruik zowel mannelijk als vrouwelijk zonder randomisatie of 'verblinding'.
  2. Zuig 100 μL van de bereide B16F10-OVA-celsuspensie op in een tuberculinespuit van 1 ml. Tik op de loop om bellen naar boven te verplaatsen en druk zachtjes op de zuiger om luchtbellen te verwijderen.
  3. Houd de muis in bedwang en stel zijn buik bloot. Druk met de pink op het linkerachterbeen om de huid van het linker liesgebied strakker te maken.
  4. Verwijder het haar van de muis uit de linker onderbuik met een elektrisch scheerapparaat. Gebruik katoen gedrenkt in 75% ethanol om het achterste kwadrant van de linkerbuik schoon te maken.
  5. Houd de spuit in een zeer ondiepe hoek (0-15°) met de schuine kant van de naald naar boven gericht, breng deze in op de plaats van de linker bovenbeen en ga 0,5-1 cm door het onderhuidse weefsel naar het liesgebied.
  6. Trek de zuiger terug voordat u gaat injecteren. Als er negatieve druk is, drukt u de zuiger volledig in en ziet u een kleine bolus (vorming van vloeistofzak) in de subcutis verschijnen.
    OPMERKING: Als er bloed wordt teruggetrokken in de naaldnaaf, trek je terug en probeer het opnieuw op een andere plaats.
  7. Verwijder de naald nadat de injectie is uitgevoerd en gooi deze op de juiste manier weg. Laat de muis los en plaats hem terug in de kooi.
  8. Meet de tumorgrootte op dag 6-8 met behulp van een vernierschaal na B16F10-OVA-implantatie. Selecteer muizen met een tumor met een diameter van ~ 3 mm (mungboonformaat) en verdeel ze gelijk en willekeurig in twee groepen.
    OPMERKING: Muizen met tumoren van vergelijkbare grootte worden willekeurig toegewezen als donor- en ontvangermuizen; het gematchte tumorweefsel dat uit donormuizen wordt weggesneden, wordt getransplanteerd in de ontvangende muizen. Bovendien moeten niet-geopereerde controles en schijncontroles worden opgenomen om de effecten van chirurgie op de overdracht van adoptiecellen en op de algemene gezondheid van muizen te evalueren. Eén groep tumordragende muizen dient dus als niet-geopereerde controles en ontvangt CD45.1 + CD45.2 + of CD45.1 + OT-I-cellen, maar geen operatie. De andere groep muizen dient als schijnbediende controles, die CD45.1 + CD45.2 + of CD45.1 + OT-I-cellen ontvangen en daaropvolgende chirurgie vergelijkbaar met de experimentele groep, maar geen allografttransplantatie.

4. Adoptieve overdracht van congentisch gemarkeerde OT-I T-cellen in tumordragende muizen

  1. Dien op de dag vóór de overdracht 4 mg cyclofosfamide opgelost in 200 μL PBS toe via intraperitoneale injectie aan elke tumordragende muis.
    OPMERKING: Behandeling met cyclofosfamide is gericht op het induceren van lymfopenie in de gastheer die "ruimte" produceert voor overgedragen cellen, waardoor hun overleving wordt bevorderd en homing aan lymfoïde organen om efficiënt te functioneren.
  2. Gebruik naïeve OT-I transgene muizen met verschillende congene markers (6-8 weken oud, 18-22 g, hetzelfde geslacht als de tumordragende muizen). Gebruik CD45.1+ OT-I muizen en CD45.1+CD45.2+ OT-I muizen om OVA257-264 antigeenspecifieke T-cellen adoptief over te brengen naar respectievelijk tumordragende donor- en ontvangermuizen.
    OPMERKING: De oorsprong van adoptief overgedragen OT-I-cellen kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als ze verschillende congene of fluorescerende markers vertonen. Injecteer bijvoorbeeld CD45.1+ OT-I T-cellen in B16F10-OVA-dragende donormuizen terwijl u CD45.1+CD45.2+ OT-I T-cellen injecteert in B16F10-OVA-dragende ontvangermuizen. CD45.1 en CD45.2 zijn beide isovormen van de panlymfocytenmarker CD45 (Ly5). Andere veelgebruikte congene markers zijn verschillende isovormen van CD90 (Thy1). Dit protocol kan worden gebruikt voor muizen die verschillende congene markers dragen. OT-I-muizen moeten van hetzelfde geslacht zijn als de muizen die OT-I-celoverdracht ontvangen om afstotingsproblemen te voorkomen.
  3. Isoleer de lymfocyten uit de milt en lymfeklieren van de OT-I muis.
    OPMERKING: De volgende procedures in deze stap moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om strikte asepsis te behouden.
    1. Bereid twee petrischalen van 60 mm × 10 mm. Voeg 3 ml R10 medium toe aan de ene schotel en voeg 3 ml RBL-buffer toe aan een andere schaal. Plaats een nylon celzeef van 70 μm in de schaal met RBL-buffer.
    2. Euthanaseer een OT-I muis in een isofluraankamer gevolgd door cervicale dislocatie.
    3. Oogst de milt, inguinale (subiliacale) en axillaire lymfeklieren van de muis en breng ze over naar een 60 mm × 10 mm schaal met 3 ml R10 op ijs.
      OPMERKING: Het aantal geofferde OT-I-muizen kan worden aangepast afhankelijk van het aantal tumordragende muizen dat moet worden overgedragen. Een typische opbrengst van OT-I CD8 + T-cellen uit een milt en bilaterale inguinale en axillaire lymfeklieren van OT-I CD8 + T-cellen is ~ 30-100 × 106 cellen per muis.
    4. Gebruik het eindvat van een spuit van 1 ml en macereer de milt in 3 ml RBL-buffer door de zeef. Incubeer gedurende 3 minuten bij RT en beëindig de reactie door 3 ml koud R10-medium toe te voegen.
    5. Pureer de lymfeklieren totdat alleen bindweefsel overblijft. Spoel het filter af met R10. Breng de celsuspensie over in een nieuwe conische buis van 15 ml. Centrifugeer bij 500 × g, 4 °C gedurende 6 min.
    6. Decanteer het supernatant en resuspend de cellen in 3 ml MACS-buffer. Laat de celsuspensie door een nieuwe celzeef van 70 μm gaan om eventuele vlokken te verwijderen.
    7. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovennatuurlijke.
    8. Gebruik een CD8+ T-celisolatiekit voor muizen (zie de tabel met materialen) om CD8+ T-cellen te zuiveren door negatieve selectie, volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant wanneer u kits van andere bedrijven gebruikt.
    9. Houd de gezuiverde celsuspensie op ijs. Neem een klein monster van cellen en meng met trypan blue om cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
  4. Bepaal het percentage OT-I (live/dead-CD8+Va2+) cellen door middel van flowcytometrie.
    OPMERKING: Gelijktijdige kleuring van congene markers en de transgene TCR moet worden uitgevoerd om het juiste fenotype van de cellen te verifiëren voorafgaand aan de overdracht.
    1. Voeg 5 × 104-1 × 105 cellen toe aan 1 ml FACS-buffer in een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 350 × g, 4 °C.
    2. Gooi het supernatant weg en verspreid de cellen door over de onderkant van de buis te vegen. Plaats de tube op ijs.
    3. Bereid de volgende geconjugeerde antilichaammengsels (verdund in 100 μL FACS-buffer): anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 01:200; anti-CD45.2, 1:200; en levend/dood, 1:200 (zie de Tabel der Materialen).
    4. Vortex de antilichaamcocktail en centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 3 minuten om antilichaamaggregaten te pelleteren. Bewaar de cocktail op ijs en bescherm hem tegen licht.
    5. Resuspend de cellen met 100 μL antilichaamcocktail en meng grondig door de buis te vegen. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten op ijs.
      OPMERKING: Vermijd het verstoren van de antilichaamaggregaten aan de onderkant van de buis.
    6. Was de pellets tweemaal met 1 ml FACS-buffer. Centrifugeer bij 350 × g, 4 °C gedurende 3 min. Resuspend de cellen in 200 μL FACS-buffer en breng de celsuspensie over naar een FACS-buis.
      OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de over te dragen OT-I-cellen te behouden, test u het monster zo snel mogelijk. Als de gekleurde OT-I-cellen niet onmiddellijk kunnen worden getest, houd de cellen dan in het donker op ijs of koel bij 4 °C tot de analyse. Als alternatief kunnen de monsters worden geresuspendeerd in 1-4% paraformaldehyde voor uitgebreide opslag (16 uur) om verslechtering te voorkomen.
    7. Voer het monster uit op een flowcytometer. Bereken het percentage levende/dode-CD8+Va2+-cellen door het aantal levende/dode-CD8+Vα2+-cellen te delen door het aantal levende/dode cellen.
  5. Bepaal het absolute aantal OT-I-cellen (live/dead-CD8+Va2+) door het percentage levende/dode CD8+Va2+-cellen te vermenigvuldigen met het levensvatbare celnummer dat is verkregen in stap 4.3.9.
  6. Pas de concentratie van OT-I-cellen (live/dead-CD8+Va2+) aan op 1,5 × 106 /ml met PBS.
  7. Injecteer 3 × 105 verschillende congentisch gemarkeerde OT-I-cellen (levend / dood-CD8 + Va2 +) in 200 μL PBS intraveneus in twee groepen B16F10-OVA-dragende muizen (tumordragende muizen verdeeld in donor- en ontvangermuizen uit stap 3.8).
    1. Zuig 200 μL OT-I-cel (live/dead-CD8+Va2+) suspensie op in een insulinespuit van 100 U (29 G) en verwijder bubbels zoals in stap 3.2.
    2. Plaats de muis afzonderlijk in een kooi met een infraroodlamp over de kooi gedurende 5-10 minuten om de staartader te verwijden. Immobiliseer de muis met een fixatieapparaat van de juiste grootte. Trek aan de staart om deze recht te trekken en spuit met 75% ethanol om de ader zichtbaar te maken.
    3. Houd de spuit evenwijdig aan de ader en breng deze in een hoek van 0-15° in de ader. Trek de zuiger iets terug en als er bloed in de loop komt, injecteer de suspensie langzaam en gestaag met een snelheid van niet meer dan 1 ml / min.
      OPMERKING: Weerstand of zwelling op de injectieplaats geeft aan dat de naald zich niet in de ader bevindt; de injectieplaats moet proximaal worden verplaatst.
    4. Nadat de injectie is voltooid, verwijdert u de spuit en drukt u gedurende 3-5 s voorzichtig op het inbrenggebied om het bloeden te stoppen. Breng de muis terug naar de kooi en observeer deze een paar minuten nauwlettend op bijwerkingen. Als het normale mobiliteit en nasale afscheiding heeft, plaats het dan terug in het gezelschap van de andere muizen.

5. Ontleed tumormassa van tumordragende donormuizen

OPMERKING: Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de operatie in rubrieken 5 en 6. Steriliseer alle chirurgische instrumenten door autoclaveren voor en na elk gebruik. Desinfecteer het operatiegebied in de bioveiligheidskast met 75% ethanol gevolgd door ultraviolette bestraling. Draag een schone jurk, pet, gezichtsmasker en steriele handschoenen.

  1. Acht tot tien dagen na de adoptieve overdracht selecteert u donormuizen met een vergelijkbare tumormassa van ~ 5 mm diameter (sojabonenformaat) voor transplantatiechirurgie.
  2. Bereid een schaal van 100 mm × 20 mm in een bioveiligheidskast en voeg 10 ml steriel ijskoud PBS toe.
  3. Euthanaseer een tumordragende donormuis in een isofluraankamer gevolgd door cervicale dislocatie. Dompel de muis gedurende 3-5 minuten onder in 75% ethanol en breng over naar de bioveiligheidskast.
    OPMERKING: De volgende procedures in deze stap moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om strikte asepsis te behouden.
  4. Plaats de muis op een dissectiebord bedekt met schoon absorberend papier in rugligging. Houd de muisledematen in bedwang met dissectienaalden.
  5. Knip de huid langs de middellijn van boven de urethrale opening naar de xiphoid met een schaar. Rek de huid naar de linkerkant van het muizenlichaam met een pincet en houd de huid in bedwang met dissectienaalden.
  6. Snijd de tumor weg en houd de capsule zo intact mogelijk. Verwijder voorzichtig en voorzichtig het bindweefsel in de buurt van de tumor met een chirurgische schaar.
    OPMERKING: Om de integriteit van de tumor te behouden, mag u het tumorkapsel niet afpellen of het tumorweefsel in stukken snijden.
  7. Plaats het tumorweefsel in een schaal van 100 mm × schaal van 20 mm met 10 ml steriel ijskoud PBS voor verdere transplantatie.

6. Subcutane transplantatie van donor-afgeleide tumor op de tumor-gematchte ontvanger muizen

OPMERKING: Het allograft wordt verondersteld te worden geïmplanteerd in de onderste flank van de muis aan dezelfde kant als de eerder bestaande tumor om twee tumoren naar de identieke lymfeklier te laten draineren. In het hier gepresenteerde protocol, toen de B16F10-OVA-tumor subcutaan werd geïmplanteerd op het linker inguinale gebied van de muis (sectie 3), werd het donor-afgeleide tumorweefsel in deze stap op de linkerflank van de ontvanger getransplanteerd. De transplantatieplaats kan worden aangepast aan de eerst geïmplanteerde tumorplaats.

  1. Verdoof een tumorgematchte ontvangende muis met 250 mg/kg 2,2,2-tribromoethanol via intraperitoneale injectie. Knijp in de teen van een extensor ledemaat van de muis om het niveau van anesthesie te beoordelen en wacht op een gebrek aan pijnreflex, wat de juiste diepte van de anesthesie aangeeft voor het uitvoeren van de operatie. Als vocalisatie of terugtrekking van de achterpoten wordt waargenomen, injecteer dan verder 0,01−0,03 ml 2,2,2-tribroomethanol.
    OPMERKING: De tumor-gematchte ontvangermuis moet van hetzelfde geslacht zijn als de donormuis die het allograft levert om afstotingsproblemen te voorkomen.
  2. Gebruik veterinaire zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Scheer de linkerflank van de muis met een elektrisch scheerapparaat. Breng een ontharingscrème aan om het resterende haar te verwijderen.
    OPMERKING: Vermijd het schuren van de huid, wat het risico op besmetting en infectie kan verhogen.
  3. Plaats de muis in de bioveiligheidskast. Plaats het in de buikligging op een dissectiebord bedekt met schoon absorberend papier, met de verticale as van de muis evenwijdig aan en de kop aan de rechterkant van het experimenteermiddel.
    OPMERKING: De volgende procedures in deze stap moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om strikte asepsis te behouden.
  4. Wrijf de huid van het geschoren gebied met katoen gedrenkt in povidon-jodium.
    OPMERKING: Gebruik povidon-jodium in plaats van 75% ethanol voor sterilisatie om verlies van lichaamswarmte te voorkomen.
  5. Til de huid op het middelpunt tussen de heupgewrichten van de muis op met een chirurgisch pincet. Gebruik de schaar om een 5 mm lange verticale excisie te maken. Verleng de snede rostrally langs de dorsale middellijn tot ~ 10-15 mm.
  6. Voer een scherpe dissectie uit door de gesloten uiteinden van de schaar in de incisie in te brengen en vervolgens te openen om het peritoneum van de linkerflank van de huid en het zachte weefsel te scheiden.
    OPMERKING: Om schade aan het onderhuidse weefsel en peritoneum te voorkomen, tilt u de huid in het midden van de incisie op en plaatst u vervolgens de gesloten schaar zo dicht mogelijk bij de huid.
  7. Maak een huidzak op de linkerflank door meerdere keren een scherpe dissectie uit te voeren. Deponeer de ingekapselde, intacte donor-afgeleide tumormassa in de capsule.
    OPMERKING: Muizen in de schijnbediende controlegroep krijgen dezelfde operatie zonder de van de donor afgeleide tumortransplantatie.
  8. Sluit de incisie door een onderbroken hechting (zie Materialenlijst). Plaats 2-3 hechtingen voor elke incisie. Desinfecteer de huid rond de snee met katoen gedrenkt in povidon-jodium.
    OPMERKING: Er moet 5 mm tussen twee opeenvolgende hechtingen en een afstand van 3 mm van de incisie zijn.
  9. Plaats de muis in de zijwaartse positie in een schone en warme kooi. Houd het continu in de gaten totdat het voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden.
  10. Dien buprenorfine subcutaan toe in een dosis van 0,1 mg/kg lichaamsgewicht om de 8 uur driemaal na de operatie om de pijn te verlichten. Controleer het eten, drinken, bewegen en het geopereerde gebied van de muis. Breng de ontvanger van de transplantatie pas terug naar het gezelschap van andere dieren nadat deze volledig is hersteld.
    OPMERKING: De muis herstelt meestal binnen 3 dagen van het trauma van de operatie. Als de muis niet terug is naar normale voeding en mobiliteit en manifestaties van infectie vertoont, raadpleeg dan een dierenarts voor interventies of euthanaseer hem.
  11. Offer (euthanaseer de dieren zoals in stap 4.3.2) de muizen op de aangegeven tijdstippen en herstel de cellen van belang voor flowcytometrische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het schema van dit protocol is weergegeven in figuur 1. Acht dagen na tumorinenting werden CD45.1+ en CD45.1+CD45.2+ OT-I cellen geïnjecteerd in B16F10-OVA tumordragende C57BL/6 muizen. De tumor werd chirurgisch ontleed van CD45.1+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (donor) op dag 8 na de overdracht en getransplanteerd in tumor-gematchte CD45.1+CD45.2+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (ontvanger) in de dorsale flank aan dezelfde kant ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij CTL's de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong van tumorantigeenspecifieke CTL's binnen TME is echter niet opgehelderd30. Het gebruik van dit tumortransplantatieprotocol heeft een belangrijke aanwijzing gegeven dat intratumorale antigeenspecifieke CD8 + T-cellen mogelijk niet lang blijven bestaan, ondanks het bestaan van stamachtige TCF1 + voorloper CD8

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr. 31825011 tot LY) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 31900643 tot QH, nr. 31900656 tot ZW).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm filterMilliporeSLGPR33RB
1 mL tuberculin syringeKDLBB000925
1.5 mL centrifuge tubeKIRGENKG2211
100 U insulin syringeBD Biosciences320310
15 mL conical tubeBEAVER43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)SigmaT48402-25G
2-Methyl-2-butanolSigma240486-100ML
70 μm nylon cell strainerBD Falcon352350
APC anti-mouse CD45.1BioLegend110714Clone:A20
B16F10-OVA cell linebluefbioBFN607200447
BSA-V (bovine serum albumin)Biossbs-0292P
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Horizon562895Clone:104
cell culture dishBEAVER43701/43702/43703
centrifugeEppendorf5810R-A462/5424R
cyclophosphamideSigmaC0768-25G
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibcoC11995500BT
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation KitStemcell Technologies19853
EDTASigmaEDS-500g
FACS tubesBD Falcon352052
fetal bovine serumGibco10270-106
flow cytometerBDFACSCanto II
hemocytometerPorLab ScientificHM330
isofluraneRWD life scienceR510-22-16
KHCO3Sangon BiotechA501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL10199
needle carrierRWD Life ScienceF31034-14
NH4ClSangon BiotechA501569-0500
paraformaldehydeBeyotimeP0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2BioLegend127808Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8aBioLegend100734Clone:53-6.7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
sodium azideSigmaS2002
surgical forcepsRWD Life ScienceF12005-10
surgical scissorsRWD Life ScienceS12003-09
suture threadRWD Life ScienceF34004-30
trypsin-EDTASigmaT4049-100ml

Referenties

  1. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
  2. Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
  3. McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
  4. Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
  7. Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
  8. Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
  9. Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
  10. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867(2020).
  11. Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
  12. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
  13. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
  14. Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
  15. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  16. Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794(2019).
  17. Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
  18. Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
  19. Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
  20. Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
  21. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507(2018).
  22. E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
  23. Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
  25. Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169(2019).
  26. Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
  27. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
  28. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  29. Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806(2020).
  30. Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
  31. Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
  32. Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
  33. Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.

Step 6.10 of the Protocol was updated from:

Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

to:

Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

Tags

Tumor-infiltrerende T-cellenCD8-positieve T-cellentumormicro-omgevingB16F10-OVA-melanoomOT-I-muizenantigeenspecifieke T-cellenflowcytometrieadoptieve celtransfertumorimmunologie
Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.