Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong en aanvulling van tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen in de tumormicro-omgeving (TME) blijven echter onduidelijk. Dit protocol maakt gebruik van de B16F10-OVA melanoom cellijn, die stabiel het surrogaat neoantigeen, ovalbumine (OVA) en TCR transgene OT-I muizen tot expressie brengt, waarin meer dan 90% van de CD8 + T-cellen specifiek het OVA-afgeleide peptide OVA257-264 (SIINFEKL) herkennen dat is gebonden aan het klasse I major histocompatibiliteitscomplex (MHC) molecuul H2-Kb. Deze kenmerken maken de studie van antigeenspecifieke T-celresponsen tijdens tumorigenese mogelijk.
Door dit model te combineren met tumortransplantatiechirurgie, werden tumorweefsels van donoren getransplanteerd in tumor-gematchte syngenetische ontvangermuizen om de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen in getransplanteerde donorweefsels nauwkeurig te traceren, waardoor de immuunresponsen van tumor-inherente en periferie-afkomstige antigeen-specifieke CD8 + T-cellen. Er bleek een dynamische overgang plaats te vinden tussen deze twee populaties. Gezamenlijk heeft dit experimentele ontwerp een andere benadering geboden om de immuunresponsen van CD8 + T-cellen in TME nauwkeurig te onderzoeken, wat nieuw licht zal werpen op de tumorimmunologie.
Inleiding
CD8+ T-cel-gemedieerde immuunrespons speelt een cruciale rol bij het beheersen van tumorgroei. Tijdens tumorigenese worden naïeve CD8+ T-cellen geactiveerd bij antigeenherkenning op een MHC klasse I-beperkte manier en differentiëren vervolgens in effectorcellen en infiltreren in tumormassa 1,2. Binnen de tumormicro-omgeving (TME) drijven langdurige blootstelling aan antigeen, evenals immunosuppressieve factoren, geïnfiltreerde tumorspecifieke CD8 + T-cellen echter in een hyporesponsieve toestand die bekend staat als "uitputting"3. Uitgeputte T-cellen (Te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muisexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Dierverzorgings- en Gebruikscommissies van de Derde Militaire Medische Universiteit. Gebruik 6-8 weken oude C57BL/6 muizen en naïeve OT-I transgene muizen met een gewicht van 18-22 g. Gebruik zowel mannelijk als vrouwelijk zonder randomisatie of 'verblinding'.
1. Bereiding van medium en reagentia
- Bereid celkweekmedium D10 zoals eerder beschreven29 door 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine toe te voegen aan Dulbecco's Modified Eagle Medium. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het schema van dit protocol is weergegeven in figuur 1. Acht dagen na tumorinenting werden CD45.1+ en CD45.1+CD45.2+ OT-I cellen geïnjecteerd in B16F10-OVA tumordragende C57BL/6 muizen. De tumor werd chirurgisch ontleed van CD45.1+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (donor) op dag 8 na de overdracht en getransplanteerd in tumor-gematchte CD45.1+CD45.2+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (ontvanger) in de dorsale flank aan dezelfde kant .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij CTL's de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong van tumorantigeenspecifieke CTL's binnen TME is echter niet opgehelderd30. Het gebruik van dit tumortransplantatieprotocol heeft een belangrijke aanwijzing gegeven dat intratumorale antigeenspecifieke CD8 + T-cellen mogelijk niet lang blijven bestaan, ondanks het bestaan van stamachtige TCF1 + voorloper CD8
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr. 31825011 tot LY) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 31900643 tot QH, nr. 31900656 tot ZW).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referenties
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
