Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

Samenvatting

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Samenvatting

Het identificeren van liganden die specifiek zijn voor therapeutisch significante celreceptoren is cruciaal voor veel toepassingen, waaronder het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2) is een belangrijke receptor die mestcelactivatie reguleert en dus de algemene immuunrespons stuurt. Talrijke liganden voor MRGPRX2 zijn geïdentificeerd en omvatten endogene peptiden zoals PAMPs, defensinen, LL-37 en andere eiwitfragmenten (d.w.z. afgebroken albumine). Verdere identificatie van MRGPRX2-specifieke liganden vereist de screening van een groot aantal peptiden (d.w.z. peptidebibliotheek); mestcellen zijn echter moeilijk en duur om in vitro te onderhouden en daarom niet economisch in gebruik voor het screenen van grote aantallen moleculen. Het huidige artikel demonstreert een methode om een bibliotheek van kleine peptidemoleculen te ontwerpen, ontwikkelen en screenen met behulp van MRGPRX2 die HEK-cellen tot expressie brengen. Deze cellijn is relatief eenvoudig en goedkoop te onderhouden en kan worden gebruikt voor in vitro high-throughput analyse. Een calciumgevoelige Fura-2 fluorescerende kleurstof om intracellulaire calciumflux bij activering te markeren, werd gebruikt om de activering te controleren. De verhouding van fluorescentie-intensiteit van Fura-2 bij 510 nm tegen excitatiegolflengten van 340 en 380 nm werd gebruikt om de calciumconcentratie te berekenen. De peptidebibliotheek die werd gebruikt om dit systeem te verifiëren, was gebaseerd op de endogene proadrenomedulline N-terminal 12 (PAMP-12) secretagoge, waarvan bekend is dat het MRGPRX2 bindt met hoge specificiteit en affiniteit. Latere peptiden werden gegenereerd door aminozuur-truncation en alanine scanning technieken toegepast op PAMP-12. De hier beschreven methode is eenvoudig en goedkoop maar robuust voor het screenen van een grote bibliotheek van verbindingen om bindingsdomeinen en andere belangrijke parameters te identificeren die een belangrijke rol spelen bij receptoractivering.

Inleiding

Mestcellen zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem en spelen een cruciale rol in zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Mestcellen worden voornamelijk geactiveerd door de binding van een antigeen aan het immunoglobuline E (IgE) - FcεRI-receptorcomplex, of door het onlangs ontdekte mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2)¹. MRGPRX2-activering is in verband gebracht met verschillende immuun- en ontstekingsziekten en daarom is het belangrijk om het bindingsmechanisme van de receptor aan zijn liganden te begrijpen². Om dit te doen, werd een bibliotheek van kleine peptidemoleculen ontwikkeld en gescreend tegen MRGPRX2-receptoren die overexpressie hadden in HEK-cellen. In de studie werd de peptidebibliotheek geconstrueerd met behulp van de eenvoudige en veelzijdige technieken van alaninescanning en aminozuur-truncation. Alanine scanning omvat het vervangen van specifieke aminozuren door een alanineresidu. Alanine is klein en neutraal, ontdoet het peptide van de specifieke eigenschappen die worden verleend door het vervangen residu en benadrukt achtereenvolgens de betekenis van de respectieve fysiochemische eigenschappen van het aminozuur in receptorinteracties. Integendeel, bij aminozuurafkapping zijn peptidesequenties zo ontworpen dat het een of meer aminozuurresiduen van de N-terminal, C-terminal of beide mist. Deze set peptiden werd gebruikt om de aminozuursequenties te identificeren die cruciaal zijn voor MRGPRX2-binding.

Ervaring met menselijke mestcellijnen (LAD-2) heeft aangetoond dat deze cellen moeilijk in vitrote kweken en te onderhouden zijn: een verdubbelingstijd van twee weken, dure medium supplementen en directe aandacht vereist tijdens passaging³. Deze eigenschappen maken de cellen ongeschikt voor grootschalige screening van potentiële liganden. Hierin werden stabiel getransfecteerde HEK-cellen die MRGPRX2-receptor (HEK-X2) tot expressie brengen, gebruikt om de peptidebibliotheek¹te screenen. HEK-293-cellen worden veel gebruikt en bestudeerd voor de heterologe expressie van oppervlaktereceptoren vanwege hun hoge transfectie-efficiëntie, snellere verdubbelingssnelheid en de noodzaak om niet-dure mediumsupplementen in laboratorium te kweken⁴. Het protocol om HEK-293 cellijn te transfecteren is aangetoond en is goed ingeburgerd⁵. HEK-293-cellen die stabiel MRGPRX2-receptor tot expressie brengen (passage 13-19) werden geactiveerd met de peptiden gegenereerd door N-truncation, C-truncation, N + C-truncation en alanine scanning¹. Wild type HEK cellen (HEK-WT) (passage 16-21) werden gebruikt als controle. Intracellulaire calciumafgifte bij activering werd gecontroleerd om de op MRGPRX2 gebaseerde activering te bestuderen.

Celactivering door MRGPRX2 wordt gevolgd door een cytosolische calciummobilisatie. Deze gereguleerde intracellulaire calciumafgifte in mestcellen wordt gereguleerd door de store operated calcium entry (SOCE), gecoördineerd door het stromale interactiemolecuul 1 (STIM1); en staat centraal in de immuunresponscascade^6,7. Er zijn verschillende methoden gebruikt om de intracellulaire calciumconcentratie te detecteren, waaronder patchklemmen en fluorescerende kleurstoffen⁸. Van alle beschikbare technieken worden fluorometrische calciumkleurstoffen in conjugatie met verschillende detectietechnieken op grote schaal gebruikt⁹. Twee soorten fluorometrische kleurstoffen die interesse hebben gekregen, zijn namelijk kleurstoffen met één golflengte zoals Fluo-4 en dubbele golflengte ratiometrische kleurstoffen zoals Indo -1 en Fura-2. Het voordeel dat dual golflengte ratiometrische kleurstoffen brengen ten opzichte van kleurstoffen met één golflengte is dat de ratiometrische kleurstoffen corrigeren voor experimentele fouten zoals kleurstofbelasting, fotobleken en scherpstellen^10,11.

Fura-2 acetoxymethylester (Fura-2 AM) is een celdoordringing, groen-fluorescerende kleurstof waarvan de excitatie verschuift naar een lagere golflengte bij calciumbinding. Experimenteel wordt Fura-2 geëxtst bij 340 en 380 nm, terwijl de emissie wordt geregistreerd bij 510 nm. Bij calciumbinding neemt de fluorescerende intensiteit bij 340 nm toe, terwijl die van 380 nm afneemt, zoals weergegeven in figuur 1. Gegevens worden weergegeven als een verhouding van fluorescentie-intensiteit na excitatie bij 340 nm (F340) tot die van intensiteit na excitatie bij 380 nm (F380), d.w.z. F340 / F380. De F340/F380-verhouding is evenredig met intracellulair calcium, waarvan de waarde kan worden berekend met de Grynkiewicz-vergelijking¹². Omdat het fluorescentiesignaal wordt verkregen uit de excitatie van de kleurstof op twee golflengten (340 nm en 380 nm), corrigeert de verhouding van de fluorescentiesignalen voor experimentele factoren zoals kleurstofbelasting, kleurstoflekkage, fotobleaching en celdichtheden.

Protocol

1. Ontwerp en ontwikkeling van peptidebibliotheek

1. Om de liganden van de mestcel MRGPRX2-receptor te identificeren op basis van een bekend ligand, d.w.z.^{PAMP-12 13,}volgt u de onderstaande stappen.
   1. Genereer N-afgekapte peptidebibliotheek door de N-terminale aminozuurresiduen van het ligand achtereenvolgens af te kapen door middel van vastefasepeptidesynthese (SPPS).
   2. Genereer C-afgekapte peptidebibliotheek door de C-terminale aminozuurresiduen van het bekende ligand achtereenvolgens af te splitsen door SPPS.
   3. Op basis van de resultaten van 1.1.1 en 1.1.2, genereer een N+C-afgekapte peptidebibliotheek met behulp van SPPS door de gewenste residuen van respectievelijk de N- en C-terminal af te kapen.
   4. Gebruik vaste-fase peptidesynthese om de peptiden te synthetiseren¹³.
   5. Wijzig de N-terminale naar acetyl (Ac) groep en C-terminal naar amide groep.
   6. Karakteriseer het peptide voor zijn zuiverheid met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en voor de massa met behulp van een massaspectrofotometer.
2. Om de betekenis van specifieke aminozuren binnen het ouder PAMP-12 molecuul te bestuderen, volgt u de onderstaande stappen.
   1. Genereer een alanine scanning peptide bibliotheek door de respectieve aminozuurresiduen in het peptide molecuul te vervangen door alanine, één voor één met behulp van SPPS. Wijzig de N-terminale naar acetyl (Ac) groep en C-terminal naar amide groep.
   2. Karakteriseer het peptide voor zijn zuiverheid met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en voor de massa met behulp van een massaspectrofotometer.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gesynthetiseerde peptiden van hoge zuiverheid zijn. Karakteriseer de peptiden met behulp van massaspectroscopie en HPLC.

2. In vitro celkweek

1. Kweek HEK-X2- en HEK-WT-cellen door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Bereid kweekmedium voor door dmem met hoge glucose aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.
   2. Doorloop de cellen in met weefselkweek (TC) behandelde T-75 kweekkolven en groei in een incubator bij 37 °C met 5% CO_2,totdat ze 75-80% confluent zijn.
   3. Zodra 75% confluent, was de cellen en voeg 2-3 ml trypsine toe gedurende 2 - 3 minuten. Incubeer in een 37 °C, 5% CO₂ incubator om de cellen los te maken.
   4. Zodra de cellen zich hebben losgemaakt, verzamel je de cellen in trypsine. Voeg 6-9 ml vers medium toe.
   5. Centrifugeer de cellen bij 1620 x g gedurende 3-5 min.
   6. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg om de pellet op te vangen. Resuspend de cellen in een vers kweekmedium. Verdun de cellen volgens de gewenste concentratie.
      OPMERKING: HEK-cellen zijn snelgroeiende cellen en optimaliseren daarom de celmediumsupplementen. HEK-cellen zijn aanhankelijke cellen; plaats ze in tc-behandelde kweekkolven om de hechting te ondersteunen.
2. Bereid een 96 well assay plaat voor het experiment.
   1. Voeg 200 μL van de celsuspensie toe in elke put, met een concentratie van 200.000 cellen / ml, om 40.000 cellen / put te zaaien.
   2. Kweek de cellen gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO_2.
      OPMERKING: Optimaliseer de celdichtheid per put op basis van de plaatgrootte en het celstamtype. Voer het experiment uit in drievoud in een zwarte TC-behandelde 96-putplaat met vlakke transparante bodem.

3. Fura-2 AM calcium assay

1. Bereid kleurstof voor door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Gebruik Fura-2 AM-kleurstof voor het experiment.
   2. Bereid de bufferbuffer (HTB) van HEPES-Tyrode met 25 mM HEPES-buffer, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glucose, 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) en vers toegevoegde 1,8 mM CaCl₂ in autoclaaf gesteriliseerd water.
   3. Voeg 50 μL DMSO toe in een injectieflacon van 50 μg Fura-2 AM om 1 mM stamoplossing van Fura-2 AM-kleurstof te bereiden. Voeg 1 μL van 1 mM Fura-2 AM-kleurstof per ml vers medium toe om het kleurstofbelastingsmedium met een kleurstofconcentratie van 1 μM te bereiden.
   4. Haal de 96 well plaat uit de couveuse en gooi het medium weg. Vervang het medium door een nieuw kleurstofbeladingsmedium. Voeg in elke put 200 μL kleurstofbeladingsmedium toe. Incubeer de cellen gedurende 30-40 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO_2.
   5. Verwijder na 40 minuten incubatie het medium. Was de cellen met de HTB-buffer. Voeg 100 μL HTB-buffer toe voor fluorescentiemeting. Neem de plaat voor fluorescentiemeting.
      OPMERKING: Optimaliseer de concentratie van kleurstof in het kleurstofbelastingsmedium. Kleurstoflekkage en fotobleaching zijn mogelijke zorgen in verband met de kleurstof. Voeg CaCl₂ vers toe aan de HTB-buffer om neerslag te voorkomen.

4. Celactivering en fluorescerende aflezing

OPMERKING: Fluorescentieplaatlezer met een geautomatiseerd pipettersysteem maakt de automatische overdracht van verbindingen van een samengestelde bron naar de testplaat mogelijk zonder de plaat uit de plaatlezer te halen.

1. Terwijl de cellen worden geïncubeerd, stelt u de plaatlezer in.
   1. Stel de temperatuur in op 37 °C.
   2. Selecteer in Instellingende optie Flex.
   3. Stel de leesmodus in op Fluorescentie en Onder lezen.
   4. Stel bij Golflengten het aantal golflengten in op 2. Stel de excitatie in op 340 nm en 380 nm. Stel de emissie in op 510 nm.
   5. Laat de gevoeligheid op Standaard staan.
   6. Stel in Timinghet interval in op 3,9 s. Stel de looptijd in op 94 s om 25 keer te lezen.
   7. Selecteer vervolgens het type testplaat.
   8. Selecteer vervolgens de te lezen putten.
   9. Stel in Compound Transfer Transfers in op 1 en Initial Volume op 100 μL. Stel de pipethoogte in op 100 μL, Volume op 50 μL en Time Point op 36 s om de verbinding toe te voegen bij de 10e meting.
   10. Selecteer vervolgens het type compoundbronplaat.
   11. Laat Triturate staan op Niet gebruikt.
   12. Selecteer de tips in de pipettipslay-out.
   13. Zorg er voor samengestelde en tipkolommenvoor dat de over te brengen verbindingen zich in kolom 1 van de samengestelde plaat bevinden. Stel de tipkolom in op 1 en samengestelde kolom op 1.
   14. Laat de Autocalibrate aan .
   15. Klik op OK.
2. Wanneer de temperatuur 37 °C heeft bereikt, laadt u de platen in de plaatlezer.
   1. Druk op de leeskamer om de testplaat in de fluorescentieplaatlezerte plaatsen.
   2. Druk op de bron om de samengestelde plaatte plaatsen. Bereid de samengestelde plaat door 200 μL van respectievelijke peptiden, ionomycine en ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N′, N′-tetra-azijnzuur (EGTA) - Triton X-100-oplossingen toe te voegen.
   3. Druk op het tiprek om de tipbox teplaatsen. Gebruik een zwarte punt om autofluorescentie van de tip te voorkomen.
   4. Zodra de platen zijn geladen, controleert u de instellingen van de software en drukt u op Lezen.

5. Data-analyse

1. Bepaal de calciumconcentratie uit de fluorescentieverhouding met de Grynkiewicz-vergelijking -
   
   waarbij K_d de dissociatieconstante is van Fura-2 AM, R de emissieverhouding is na excitatie bij 340 nm en 380 nm (F340/F380) voor respectievelijke peptiden, R_max de maximale fluorescentieverhouding is die wordt waargenomen door de toevoeging van 50 μL van 30 μM ionomycine, R_min de minimale fluorescentie is die wordt waargenomen door de toevoeging van 50 μL van 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100; en F380_min en F380_max zijn de absolute fluorescentie-intensiteit van Fura-2 AM in respectievelijk calciumvrije en gebonden toestand.
   OPMERKING: De machine geeft de vloeistof met enige kracht af. Stel de peptidedoseerhoogte niet te dicht bij de bodem van de plaat in; het kan de cellen losmaken. Gebruik zwarte pipetpunten om autofluorescentie te voorkomen. Lees de maximale fluorescentie en de minimale fluorescentie voor elke plaat voor elk experiment.

Resultaten

Tabel 1 bevat de peptidesequenties die worden gegenereerd door terminale aminozuur-truncation en alanine scanning. Zoals weergegeven in tabel 1,mist peptidesequentie RKKWNKWALSR N-terminale fenylalanine (F) ten opzichte van zijn moeder PAMP-12 en is daarom een representatief peptide in de N-afgekapte bibliotheek. Evenzo is in FRKKWNKWALS PAMP-12 C-terminal serine verwijderd, wat een C-afgekapte peptidebibliotheek vertegenwoordigt die is afgeleid van PAMP-12. In de N+C-afgeknotte peptideb...

Discussie

Calciumsignalering staat centraal bij mestceldegranulatie en is veel gebruikt in de studie van receptor-ligandinteracties, ligandidentificatie en medicijnontdekking¹⁴. MRGPRX2 is een recent ontdekte mestcelreceptor waarvan is gebleken dat deze een sleutelrol speelt bij veel ontstekingsziekten zoals jeuk, astma en atopische dermatitis, onder andere². Bovendien is aangetoond dat verschillende goedgekeurde geneesmiddelen een ontstekingsreactie opwekken via de MRGPRX2-receptor<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	Hoge glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Steriele, biologische kwaliteit
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Aangepast	≥95% puur; N terminaal - acetylgroep C terminaal - amidegroep
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704