Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

Samenvatting

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Samenvatting

Het identificeren van liganden die specifiek zijn voor therapeutisch significante celreceptoren is cruciaal voor veel toepassingen, waaronder het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2) is een belangrijke receptor die mestcelactivatie reguleert en dus de algemene immuunrespons stuurt. Talrijke liganden voor MRGPRX2 zijn geïdentificeerd en omvatten endogene peptiden zoals PAMPs, defensinen, LL-37 en andere eiwitfragmenten (d.w.z. afgebroken albumine). Verdere identificatie van MRGPRX2-specifieke liganden vereist de screening van een groot aantal peptiden (d.w.z. peptidebibliotheek); mestcellen zijn echter moeilijk en duur om in vitro te onderhouden en daarom niet economisch in gebruik voor het screenen van grote aantallen moleculen. Het huidige artikel demonstreert een methode om een bibliotheek van kleine peptidemoleculen te ontwerpen, ontwikkelen en screenen met behulp van MRGPRX2 die HEK-cellen tot expressie brengen. Deze cellijn is relatief eenvoudig en goedkoop te onderhouden en kan worden gebruikt voor in vitro high-throughput analyse. Een calciumgevoelige Fura-2 fluorescerende kleurstof om intracellulaire calciumflux bij activering te markeren, werd gebruikt om de activering te controleren. De verhouding van fluorescentie-intensiteit van Fura-2 bij 510 nm tegen excitatiegolflengten van 340 en 380 nm werd gebruikt om de calciumconcentratie te berekenen. De peptidebibliotheek die werd gebruikt om dit systeem te verifiëren, was gebaseerd op de endogene proadrenomedulline N-terminal 12 (PAMP-12) secretagoge, waarvan bekend is dat het MRGPRX2 bindt met hoge specificiteit en affiniteit. Latere peptiden werden gegenereerd door aminozuur-truncation en alanine scanning technieken toegepast op PAMP-12. De hier beschreven methode is eenvoudig en goedkoop maar robuust voor het screenen van een grote bibliotheek van verbindingen om bindingsdomeinen en andere belangrijke parameters te identificeren die een belangrijke rol spelen bij receptoractivering.

Inleiding

Mestcellen zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem en spelen een cruciale rol in zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Mestcellen worden voornamelijk geactiveerd door de binding van een antigeen aan het immunoglobuline E (IgE) - FcεRI-receptorcomplex, of door het onlangs ontdekte mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2)¹. MRGPRX2-activering is in verband gebracht met verschillende immuun- en ontstekingsziekten en daarom is het belangrijk om het bindingsmechanisme van de receptor aan zijn liganden te begrijpen². Om dit te doen, werd een bibliotheek van kleine peptidemoleculen ontwikkeld en gescre....

Protocol

1. Ontwerp en ontwikkeling van peptidebibliotheek

1. Om de liganden van de mestcel MRGPRX2-receptor te identificeren op basis van een bekend ligand, d.w.z.^{PAMP-12 13,}volgt u de onderstaande stappen.
   1. Genereer N-afgekapte peptidebibliotheek door de N-terminale aminozuurresiduen van het ligand achtereenvolgens af te kapen door middel van vastefasepeptidesynthese (SPPS).
   2. Genereer C-afgekapte peptidebibliotheek door de C-terminale aminozuurresiduen van het bekende ligand achtereenvolgens af te splitsen door SPPS.
   3. Op basis van de resultaten van 1.1.1 en 1.1.2, genereer een N+C-afgekapte peptidebib....

Resultaten

Tabel 1 bevat de peptidesequenties die worden gegenereerd door terminale aminozuur-truncation en alanine scanning. Zoals weergegeven in tabel 1,mist peptidesequentie RKKWNKWALSR N-terminale fenylalanine (F) ten opzichte van zijn moeder PAMP-12 en is daarom een representatief peptide in de N-afgekapte bibliotheek. Evenzo is in FRKKWNKWALS PAMP-12 C-terminal serine verwijderd, wat een C-afgekapte peptidebibliotheek vertegenwoordigt die is afgeleid van PAMP-12. In de N+C-afgeknotte peptideb.......

Discussie

Calciumsignalering staat centraal bij mestceldegranulatie en is veel gebruikt in de studie van receptor-ligandinteracties, ligandidentificatie en medicijnontdekking¹⁴. MRGPRX2 is een recent ontdekte mestcelreceptor waarvan is gebleken dat deze een sleutelrol speelt bij veel ontstekingsziekten zoals jeuk, astma en atopische dermatitis, onder andere². Bovendien is aangetoond dat verschillende goedgekeurde geneesmiddelen een ontstekingsreactie opwekken via de MRGPRX2-receptor<.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	Hoge glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Steriele, biologische kwaliteit
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Aangepast	≥95% puur; N terminaal - acetylgroep C terminaal - amidegroep
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704