Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Samenvatting

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Samenvatting

Leverkanker is momenteel de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte wereldwijd, en Hepatocellulair Carcinoom (HCC) is goed voor 75-90% van alle gevallen van leverkanker. Met de introductie van effectieve behandelingen om hepatitis B / C te voorkomen en te behandelen, worden niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en de agressievere vorm die bekend staat als niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), snel de nummer één risicofactoren om HCC in moderne samenlevingen te ontwikkelen. Om de rol van NASH op de ontwikkeling van HCC beter te begrijpen, hebben we een NASH-geassocieerde HCC-zebravis ontworpen. De optische helderheid en genetische handelbaarheid van de zebravislarven maken ze een aantrekkelijk en krachtig model om de micro-omgeving van de lever en de samenstelling van immuuncellen te bestuderen met behulp van niet-invasieve fluorescerende live beeldvorming. Dit protocol beschrijft hoe een NASH-geassocieerd HCC-zebravismodel kan worden gebruikt om het effect van cholesteroloverschot in de levermicro-omgeving en de impact ervan op de samenstelling van immuuncellen in vroege stadia van de ziekte te onderzoeken. Ten eerste voeden we HCC-larven (s704Tg), die hepatocyt-specifieke geactiveerde bèta-catenine tot expressie brengen, met een 10% hoog cholesteroldieet gedurende 8 dagen om een NASH-geassocieerd HCC-model te ontwikkelen. Hier beschrijven we hoe gebruik te maken van verschillende transgene lijnen om verschillende vroege maligniteitskenmerken in de lever te evalueren door niet-invasieve confocale microscopie, zoals levergebied, cel- en nucleaire morfologie (hepatocytengebied, nucleair gebied, nucleaire: cytoplasmatische verhouding (N: C-verhouding), nucleaire circulariteit, micronuclei / nucleaire herniatiescore) en angiogenese. Vervolgens laten we met behulp van transgene lijnen met gelabelde immuuncellen (neutrofielen, macrofagen en T-cellen) zien hoe we de samenstelling van leverimmuuncellen in NASH-geassocieerde HCC-larven kunnen analyseren. De beschreven technieken zijn nuttig om de micro-omgeving van de lever en de samenstelling van immuuncellen in vroege stadia van hepatocaroclocinogenese te evalueren, maar ze kunnen ook worden gewijzigd om dergelijke kenmerken in andere leverziektemodellen te bestuderen.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is een agressieve kanker met beperkte therapeutische opties. Het is gebleken dat meer dan 30% van alle patiënten met HCC zwaarlijvig is en NASH heeft, een agressieve vorm van NAFLD 1,2,3,4. Consumptie van calorierijke diëten verhoogt drastisch de beschikbaarheid van vetzuren die lokale en systemische metabole verschuivingen veroorzaken en steatose, hepatocytenletsel, ontsteking en fibrose veroorzaken - allemaal belangrijke kenmerken van NASH. NASH-progressie naar HCC omvat de accumulatie van lipiden in de lever, wat ontstekingen en veranderde immuuncelsamenstelling veroorzaakt ^5,6,7. Het is van bijzonder belang en belangrijk om te begrijpen hoe de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap worden veranderd tijdens de progressie van de leverziekte en hoe het verandert als gevolg van bepaalde etiologische factoren. Om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap beter te identificeren, hebben we een uniek zebravismodel van NASH-geassocieerde HCC ontwikkeld. Het gebruik van dit model heeft ons een beter begrip gegeven van de impact van voeding en overvoeding op de micro-omgeving van de lever en de progressie van de leverziekte.

Zoogdiermodellen, zoals muizen en menselijke weefselmonsters, zijn essentieel geweest bij het begrijpen van de pathogenese van steatohepatitis en steatose⁸. Muizen zijn het voorkeursmodel voor leverziekte en kanker, maar ze missen optische helderheid op cellulair niveau, terwijl menselijke weefselmonsters vaak de 3D-omgeving missen die diermodellen kunnen imiteren. Deze obstakels hebben zebravissen tot een krachtig model in de onderzoeksgemeenschap gemaakt. Zebravissen hebben opmerkelijke overeenkomsten met mensen, met ten minste 70% genbehoud. Ze handhaven de micro-omgeving van de lever, de cellulaire samenstelling van de lever, de functie, de signalering en de reactie op verwondingen ^9,10. Met behulp van een cholesterolrijk dieet (HCD) in combinatie met een gevestigd transgeen zebravismodel van HCC, hebben we een zebravismodel van NASH-geassocieerd HCC ontwikkeld.

Hier presenteren we een protocol waarin wordt uitgelegd hoe een NASH-geassocieerd HCC-zebravismodel kan worden gegenereerd en hoe de micro-omgeving van de lever kan worden bestudeerd en vroege maligniteitskenmerken in vivo kunnen worden aangepakt. Met behulp van niet-invasieve confocale microscopie in combinatie met transgene lijnen van zebravissen met fluorescerend gelabeld hepatocytenmembraan en -kern, kunnen we vroege maligniteitskenmerken aanpakken door levermorfologie (gebied, volume en oppervlakte), cel- en nucleaire morfologie (hepatocytengebied, nucleair gebied, N: C-ratio, nucleaire circulariteit, micronuclei / nucleaire herniatiescore) en angiogenese (vaatdichtheid) te analyseren. Immuuncelmicro-omgeving is ook een belangrijk kenmerk van hepatocarcinogenese 11,12,13,14, daarom laten we ook zien hoe we de samenstelling van leverimmuuncellen in NASH-geassocieerde HCC-larven kunnen analyseren, met behulp van transgene zebravislijnen met gelabelde immuuncellen (neutrofielen, macrofagen en T-cellen). De beschreven technieken zijn uniek voor het model en uiterst nuttig om de micro-omgeving van de lever en de samenstelling van immuuncellen in de progressie van leverziekte te evalueren.

Protocol

Dierstudies worden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik (IACUC) van het Albert Einstein College of Medicine. Voor recepten voor buffers en oplossingen die in het protocol worden gebruikt, wordt verwezen naar aanvullende tabel 1.

1. Bereiding van 10% cholesterolverrijkt dieet voor acuut cholesteroloverschot.

1. Weeg 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) in twee glazen bekers van 25 ml - een voor het normale dieet (ND) en de andere voor het 10% cholesterolrijke dieet (HCD).
   OPMERKING: Elk commercieel droogvoerdieet voor zebravislarven kan worden gebruikt.
2. Weeg 0,4 g cholesterol in een glazen bekerglas van 10 ml. Bedek het bekerglas met wat folie.
3. Meet 5 ml diethylether met een spuit van 10 ml met een naald van 20 g. Voeg vervolgens de Diethyl Ether toe aan het ND-bekerglas en meng het onmiddellijk met het droge voedsel met behulp van een spatel.
   LET OP: Diethylether veroorzaakt irritatie van ogen, huid en luchtwegen. Alleen te gebruiken in een chemische zuurkast.
4. Meet opnieuw 5 ml diethylether met behulp van een spuit van 10 ml met een naald van 20 g en voeg deze toe aan het bekerglas van 10 ml met cholesterol, meng onmiddellijk op en neer met de spuit.
5. Voeg snel de cholesteroloplossing toe aan het HCD-bekerglas en meng het onmiddellijk met een spatel totdat de oplossing uniform is.
6. Laat bekers tot 24 uur in de kap zitten om de Diethylether volledig te verdampen. Vermaal de volgende dag GPAS-diëten tot fijne deeltjes met behulp van een stamper en vijzel.
   OPMERKING: Het malen van de diëten is een cruciale stap, larven zullen geen deeltjes groter dan 50 nm kunnen eten.
7. Breng elk dieet over in een kleine, gelabelde plastic zak of in een centrifugebuis van 50 ml en bewaar het bij -20 °C.

2. NASH-inductie met kortdurende larven die zich voeden met een cholesterolverrijkt dieet - statische omstandigheden.

1. Stel transgene vislijnen in op dag -1 (tabel 1). De volgende ochtend (dag 0), nadat vissen hebben gebroed, verzamel je eieren in een zeef van gaas.
2. Gebruik een wasfles met embryowater (E3), spoel eieren grondig af en breng de eieren voorzichtig over naar een petrischaaltje van 10 cm met E3-medium.
3. Reinig de platen van al het puin dat zich mogelijk in de broedkasten heeft opgehoopt, inclusief dode of onbevruchte eieren.
   OPMERKING: Het spoelen van de eieren en het reinigen van de platen is cruciaal om ongecontroleerde groei van micro-organismen en daaruit voortvloeiende defecten op de ontwikkeling van larven te voorkomen.
4. Verdeel eieren in een dichtheid van 70/80 per petrischaaltjes van 10 cm (in 25 ml E3). Op dag 1, onder een dissectie scope uitgerust met een transilluminatiebasis, controleer en reinig dode embryo's of embryo's met ontwikkelingsstoornissen.
   OPMERKING: Gebruik de transilluminatiebasis darkfield-modus om embryo's met ontwikkelingseffecten te identificeren en om te controleren op groei van micro-organismen in de platen. Verschillende faciliteiten hebben verschillende micro-organismen in hun systemen. Verander E3 medium en/of gerechten indien nodig, om negatieve effecten te voorkomen.
5. Combineer op dag 5 larven uit alle gerechten in een petrischaaltje van 15 cm, voeg E3 toe zonder methyleenblauw. Verdeel vervolgens larven in de voerbakken als volgt (tabel 2).
   OPMERKING: In controleomstandigheden, om gezonde larven te genereren zonder systemische chronische ontsteking te veroorzaken, moeten larven worden gevoed met ongeveer 0,1 mg voedsel per larve per dag. Merk op dat de totale hoeveelheid voedsel (tabel 2) gelijkelijk is verdeeld in twee voedingen per dag.
6. Houd larven in een broedmachine bij 28 °C, in een donker-lichte cyclus (bijv. 14 uur licht/10 uur donkere cyclus) en voed larven twee keer per dag van dag 5 tot dag 12.
7. Zuig dagelijks voedselresten aan, evenals 90-95% van het medium met behulp van een vacuümsysteem dat is bevestigd aan een pipetpunt van 1 ml. Giet vervolgens voorzichtig nieuwe E3 zonder methyleenblauw in een hoek van de voerbak om te voorkomen dat de larven worden beschadigd.
   OPMERKING: Dagelijkse reiniging van de voerbakken is cruciaal om de ongecontroleerde groei van micro-organismen te voorkomen.

3. Verzameling van 13 dagen na de bevruchting larven uit voederbakken.

1. Bereid op dag 13 verzamelgerechten die zijn afgestemd op het aantal experimentele omstandigheden dat is ingesteld. Maak met een permanente markeerpen een markering op de zijkant van de gerechten (deksel en bodem) om te voorkomen dat monsters worden gewisseld, bijvoorbeeld één zwarte streep voor normale voeding (ND) en twee zwarte strepen voor HCD.
2. Giet voldoende E3 zonder methyleenblauw om de bodem van elk gerecht te bedekken. Gebruik voorzichtig het vacuümsysteem om het water uit de voerbakken te zuigen, probeer vuil of dode larven van de bodem te zuigen om te voorkomen dat deze materialen naar de verzamelschalen worden overgebracht.
3. Wanneer het waterniveau laag begint te worden, til je de voederbak langzaam op om larven naar een van de hoeken te laten zwemmen en adem dan in de tegenovergestelde richting.
   OPMERKING: Gebruik 1 ml pipet met gesneden uiteinden, op verschillende hoogtes, om rekening te houden met verschillende diameters bij het aanzuigen van het water. Wissel af tussen de verschillende maten, begin met een grotere diameter en verander in een kleinere naarmate het watervolume afneemt en de larvendichtheid toeneemt.
4. Zodra er slechts ongeveer 20-30 ml vloeistof is, decanteert u de larven zorgvuldig in de petrischaal van de verzameling die in stap 1 is bereid. Plaats de gelabelde tape van de voerbak op het deksel van de schaal.
5. Herhaal stap 3.2-3.4 voor alle voerboxen.

4. Controletest voor dieet geïnduceerde leversteatose - Olie Rode O (ORO) kleuring, beeldvorming en scoring.

1. Breng met behulp van een glazen Pasteur-pipet 15-20 larven over naar een ronde bodembuis van 2 ml en plaats deze ongeveer 15-30 minuten op ijs. Verwijder de meeste media uit de buis.
2. Voeg 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe om de larven te fixeren en incubeer 's nachts bij 4 °C.
3. Verwijder de volgende ochtend 4% PFA-oplossing en was larven drie keer met 2 ml 1x PBS.
4. Bereid een plaat van 12 putten (figuur 2A) per voorwaarde voor met één mesh putinzet.
5. Breng met behulp van een glazen pipet de larve over van de buis van 2 ml naar de insert die eerder in de put is geplaatst, voeg 5 ml 1x PBS toe. Bewaar de 2 ml buizen voor monsteropslag na het kleuren.
   LET OP: Larven zijn in dit stadium extreem plakkerig en gebruiken geen plastic pipetten.
6. Breng insert met larven over naar een andere put met 5 ml 60% isopropanoloplossing. Incubeer larven gedurende 30 minuten kamertemperatuur (RT).
7. Bereid ondertussen een 0,3% Olie Rode O in 60% Isopropanol oplossing. Filtreer de 0,3% Olierode oplossing tweemaal met een spuitfilter van 0,45 μm.
   OPMERKING: Bereid 5 ml oplossing per put door 3 ml 0,5% olierood O in isopropanol te mengen met 2 ml gedestilleerd water. De 0,3% Olie Rode O in 60% Isopropanol oplossing moet vers worden bereid.
8. Breng vervolgens de mesh-insert met larven over naar een andere put met 5 ml vers gemaakte 0,3% olierode O in 60% isopropanoloplossing. Geïncubeerde larven gedurende 3 uur bij RT met zacht schommelen.
9. Spoel na ORO-kleuring larven door insert over te brengen naar een andere put met 60% Isopropanol. Was larven tweemaal in 60% Isopropanol gedurende 30 minuten elke keer door insert opeenvolgend over te brengen naar putten met 60% Isopropanol.
10. Was larven drie keer gedurende 5 minuten in 1x PBS-0,1% Tween door insert sequentieel over te brengen naar putten met 1x PBS-0,1% Tween.
11. Breng larven over naar de buizen van 2 ml. Verwijder PBST, voeg 1 ml 80% Glycerol toe en bewaar bij 4 °C totdat u beeld krijgt.
12. Voor een betere beeldvorming, breng larven over naar 1x PBS-0,1% Tween en onder een dissectiebereik ontleed levers door voorzichtig weefsels te trekken met behulp van twee # 55-tangen.
    OPMERKING: Als u een Casper-achtergrondbeeldvorming gebruikt, kan deze worden uitgevoerd met de hele larve.
13. Breng met behulp van een glazen pipet de levers voorzichtig over naar een put van een porseleinen spotplaat met 50% glycerol. Plaats levers met behulp van een klein hulpmiddel om larven te manipuleren (bijv. Wimpergereedschap - figuur 2B). Beeldlevers in een stereomicroscoop uitgerust met een kleurencamera.
14. Score hepatische steatose (geen ORO-kleuring = geen; lichtrode ORO-kleuring = mild; rood-donkerrode ORO-kleuring = matig / ernstig).

5. Niet-invasieve confocale beeldvorming met behulp van het zebravis Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging (zWEDGI).

1. Bereid een petrischaaltje van 10 cm met 15-20 ml 1x Tricaine-E3, net genoeg om de bodem te bedekken.
   OPMERKING: Een 1x Tricaine-E3 werkoplossing (0,16 mg/ml) kan worden verkregen door 2 ml van een 25x Tricaine stockoplossing (4 mg/ml) in 48 ml E3 te verdunnen. De Tricaïneconcentratie mag niet hoger zijn dan 0,16 mg / ml, omdat larven in dit ontwikkelingsstadium extreem gevoelig zijn voor de anesthesie.
2. Breng 15-20 larven met een plastic Pasteur pipet over naar de petrischaal met 1x Tricaine-E3 en verdoof larven gedurende 5 minuten.
3. Bereid een 6-wells plaat met 2-3 ml E3 zonder methyleenblauw per put.
4. Screen op een fluorescerende stereomicroscoop de verdoofde larven op gewenste fluorescerende markers (tabel 1). Breng gescreende larven over in de minimale hoeveelheid Tricaine op E3 en laat ze herstellen in de 6 putplaat totdat het tijd is om te fotograferen.
   OPMERKING: Screening van dubbele, drievoudige en viervoudige transgene larven kost tijd, plaats larven in E3 en verander vaak van media van de 6 putplaat om onnodige blootstelling aan Tricaine te verminderen. Ook drijven larven in dit ontwikkelingsstadium, dus gebruik een wimpergereedschap om larven te positioneren voor screening zonder weefselschade te veroorzaken.
5. Bereid na de screening een petrischaaltje van 10 cm met 25 ml 1x Tricaine-E3. Breng 15-20 larven met een plastic Pasteur pipet over naar de petrischaal met 1x Tricaine-E3 en verdoof larven gedurende 5 min.
6. Voeg ondertussen onder de stereomicroscoop 1x Tricaine-E3 toe aan de kamers van het verwondings- en beknellingsapparaat (bijv. zWEDGI)^15,16. Verwijder luchtbellen uit de kamers en de fixatietunnel met behulp van een P200-micropipette. Verwijder alle overtollige 1x Tricaine-E3 en laat slechts voldoende volume over om de kamers te vullen.
7. Breng een verdoofde larve over in de laadkamer van de zWEDGI en plaats deze met behulp van een wimpergereedschap onder de stereomicroscoop. Tik voorzichtig op het hoofd van de larven en duw het zo dat de staart de fixatietunnel binnengaat. Bovendien verwijder met behulp van de micropipette 1x Tricaine-E3 uit de verwondingskamer om de larve in de tunnel te helpen. Zorg ervoor dat de larve op de juiste manier is gepositioneerd voor beeldvorming van de linkerkwab - Omgekeerde microscoop: linkerkant naar beneden gericht; Rechtopstaande microscoop: linkerkant naar boven gericht.
   OPMERKING: Als een zWEDGI niet beschikbaar is, kan vis worden gemonteerd en gepositioneerd in 1% laag smeltpunt agarose in 1x Tricaine-E3, maar agarose-onderdompeling kan alleen worden gebruikt voor snelle beeldvorming (tot 15 min).
8. Voor hepatocyten- en nucleaire morfologieanalyses wordt levers afgebeeld met een confocale microscoop met behulp van een 40x luchtobjectief en z-stacks van 2 μm optische secties. Voor levermorfologie, angiogenese en immuuncelrekruteringstests worden levers afgebeeld met behulp van een 20x luchtdoelstelling en z-stacks van 5 μm optische secties. Voor larven met grote levers moeten 2 x 2 tegelafbeeldingen worden gemaakt om beeldvorming van alle lever en het omliggende gebied van 75 μm te garanderen.
9. Gebruik na beeldvorming een plastic Pasteur pipet met 1x Tricaine-E3 om de larve uit de fixatietunnel te trekken en over te brengen naar een petrischaaltje met E3 zonder methyleenblauw.

6. Analyse van morfologische variaties in de lever.

OPMERKING: De onderstaande stappen worden uitgevoerd voor leveroppervlak en volumekwantificering:

1. Open imaging software. Voeg een map met te analyseren afbeeldingsbestanden toe aan Arena en selecteer het pictogram Van de map Observeren . Selecteer vervolgens door met de rechtermuisknop op miniaturen te klikken Converteren naar native Imaris-bestandsindeling om bestanden naar het formaat (.ims) te converteren.
2. Pas in het submenu Overtreffen de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan. Maak vervolgens een oppervlak van de lever door op de blauwe knop Nieuwe oppervlakken toevoegen te klikken.
3. Selecteer vervolgens op het deelvenster Voor het maken van oppervlakken alleen een interessant gebied segmenteren om handmatig een oppervlak van de lever te maken.
4. Klik op Automatisch aanmaken | overslaan Optie Handmatig bewerken . Selecteer Contour en deselecteer de optie "Volume" in het scènepaneel.
   OPMERKING: De optie Volumeweergave moet worden uitgeschakeld, anders kan selectie van interessegebied in verschillende z-stacks niet worden geselecteerd.
5. Navigeer door z-stacks en teken het interessegebied in elk vlak door Modus te selecteren, kies de tekenmodus die u verkiest. Om te beginnen met het tekenen van de wijzigingsaanwijzer naar de selectiemodus en niet naar navigeren, klikt u vervolgens op Tekenen en begint u de aanwijzer door de lever te slepen om een ROI te tekenen.
6. Nadat u een ROI in de verschillende focusvlakken hebt geselecteerd, selecteert u Een oppervlak maken om alle geselecteerde ROI's samen te voegen en leveroppervlak te maken.
7. Vervolgens maakt u met behulp van het nieuw gecreëerde oppervlak een masker van het hepatocytensignaal. Klik op het oppervlak en kies onder het tabblad Bewerken (het potlood) Alles maskeren. Kies in het venster dat verschijnt het kanaal dat u wilt maskeren en dat wordt gebruikt om het levervolume en het oppervlak te kwantificeren. Kies vervolgens voxels buitenoppervlak instellen op 0 en vink de optie Kanaal dupliceren aan voordat u het masker toepast.
8. Gebruik het leveroppervlak en de levervolumewaarden uit het statistische analysemenu voor analyse.

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit voor de kwantificering van het levergebied.

9. Open Fiji-software. Selecteer in het menu Plug-ins de optie Bio-indelingen gevolgd door Bio-indelingen importeren en vink de optie Gesplitste kanalen aan om het afbeeldingsbestand te openen.
10. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Eigenschappen om te controleren of de afbeelding de juiste pixelgrootte en voxeldiepte heeft, zo niet de juiste waarden. Ga vervolgens naar het menu Afbeeldingen, klik op Aanpassen gevolgd door Helderheid en contrast, pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan.
11. Vervolgens, met behulp van hepatocyten kanaal creëren een maximale intensiteit projectie van de lever. Ga naar het menu Afbeeldingen, klik op Stapels gevolgd door Z Project. Selecteer Maximale intensiteitsprojectie.
12. Maak met behulp van de selectietool uit de vrije hand handmatig een gebied van interesse (ROI) rond de larvale lever. Klik vervolgens in het menu Analyseren op Meten om levergebied te verkrijgen. Sla resultaten op als spreadsheet voor verdere analyse.

7. Hepatocyten en nucleaire morfologische analyse.

1. Open Fiji-software. Selecteer in het menu Plug-ins de optie Bio-indelingen gevolgd door Bio-indelingen importeur op de optie Gesplitste kanalen om het afbeeldingsbestand te openen.
2. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Eigenschappen om te controleren of de afbeelding de juiste pixelgrootte en voxeldiepte heeft, zo niet de juiste waarden. Ga vervolgens naar het menu Afbeeldingen, klik op Aanpassen gevolgd door Helderheid en contrast, pas de helderheid en het contrast van het beeld aan.
3. Selecteer in het menu Analyseren de optie Metingen instellen voor alle parameters die u wilt analyseren (bijvoorbeeld gebieds-, omtrek- en vormbeschrijvingen). Selecteer het fluorescentiekanaal van het hepatocytmembraan. Navigeer door Z en gebruik de selectietool uit de vrije hand om een perfecte ROI rond één hepatocyt te tekenen. Klik vervolgens in het menu Analyseren op Meten om het gebied van de hepatocyten te berekenen.
4. Herhaal stap 7.3 voor 15-30 hepatocyten. Sla resultaten op als spreadsheet voor verdere analyse.
5. Selecteer vervolgens het fluorescentiekanaal van de kern. Navigeer door Z en gebruik de selectietool uit de vrije hand om de perfecte ROI rond de hepatocytenkern te tekenen. Klik vervolgens in het menu Analyseren op Meten om het nucleaire gebied en de circulariteit te berekenen.
6. Herhaal stap 7.5 voor 15-30 hepatocyten. Sla resultaten op als een spreadsheet voor verdere analyse, inclusief kwantificering van de verhouding nucleair:cytoplasmatisch.
7. Score monsters voor de aanwezigheid van micronuclei en herniatie als volgt (tabel 3).

8. Angiogenese analyse.

1. Maak handmatig een oppervlak voor de lever zoals beschreven in sectie 6 van dit protocol. Noem dit oppervlak "Leveroppervlak".
2. Maak een masker voor het signaal van endotheelcellen in de lever. Klik op het oppervlak en kies onder het tabblad Bewerken (het potlood) Alles maskeren. Kies in het venster dat verschijnt het kanaal van de endotheelcellen om vaatsignalen alleen van de lever te isoleren. Kies voxels buitenoppervlak instellen op 0 en vink de optie Kanaal dupliceren aan voordat u Masker toepast.
3. Hernoem het nieuwe gemaskerde kanaal van endotheelcellen tot levervasculatuur.
4. Om het volume en het oppervlak van het vat te meten, ontstaat een tweede oppervlak. Klik op de blauwe knop Nieuwe oppervlakken toevoegen . Zorg er in de eerste stap van het maken van het oppervlak voor dat alle opties zijn uitgeschakeld om automatisch een oppervlak te maken.
5. Kies in de tweede stap levervasculatuurkanaal om een oppervlak over te creëren. Schakel de optie vloeiend maken uit om zoveel mogelijk details van vaten te detecteren en achtergrondaftrek in te schakelen in de drempeloptie.
6. Pas de drempel aan om ervoor te zorgen dat het gedetecteerde oppervlak colocaliseert met het signaal van de levervasculatuur. Gebruik oppervlakte- en volumewaarden uit het menu statistische analyse. Bereken de vaatdichtheidsindex met behulp van de volgende vergelijkingen:
   Vaatdichtheidsindex (door lever μm²) = (vaatoppervlak (μm²)) / (leveroppervlak (μm²))
   Vaatdichtheidsindex (door lever μm³) = (vaatvolume (μm³)) / (levervolume (μm³))

9. Immuuncel rekruteringsanalyse.

1. Open Fiji-software. Selecteer in het menu Plug-ins de optie Bio-indelingen gevolgd door Bio-indelingen importeur op de optie Gesplitste kanalen om het afbeeldingsbestand te openen.
2. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Eigenschappen om te controleren of de afbeelding de juiste pixelgrootte en voxeldiepte heeft, zo niet de juiste waarden. Ga vervolgens naar het menu Afbeeldingen , klik op Aanpassen gevolgd door Helderheid en contrast, pas de helderheid en het contrast van het beeld aan (bijv. Macrofagen - mCherry of dTomato; neutrofielen - BFP; T-cellen - EGFP; hepatocyten - EGFP of mCherry).
3. Maak vervolgens projecties met maximale intensiteit voor elk kanaal.
4. Zoals beschreven in rubriek 6 (stappen 6.9-6.12), creëert u een ROI rond de larvale lever en meet u het levergebied. Creëer een tweede ROI inclusief levergebied en 75 μm omgeving ("Recruitment area").
5. Selecteer vervolgens in het menu Bewerken de optie Selectie , gevolgd door Toevoegen aan manager. Als u een aangeboren immuuncelkanaal maximale intensiteitsprojectie selecteert, klikt u op de lever-ROI in het venster ROI Manager om het wervingsgebied in te stellen.
6. Selecteer in het menu Plug-ins de optie Analyseren gevolgd door Celteller en tel immuuncellen binnen het wervingsgebied. Recordaantal gerekruteerde immuuncellen naar het levergebied op een spreadsheet.
7. Bereken neutrofiele, macrofaag- en T-celdichtheden door het aantal immuuncellen per levergebied te normaliseren.

Resultaten

Door een kortdurend cholesterolrijk dieet te introduceren in een Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel, dat een hepatocytenspecifieke constitutief actieve vorm van Beta-catenine (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷, we zijn in staat om een niet-zoogdier gewerveld model van NASH-geassocieerde HCC te maken. De progressie van de leverziekte kan vroegtijdig worden gevolgd door het meten van leversteatose, levergrootte, hepatocyt, nucleaire morfologie, angiogenese en immuuncelinfiltratie (figuur 1).

HCC-larven gevoed met een normaal dieet vertonen geen milde hepatische steatose, gemeten door Oil Red O-kleuring. HCC-larven gevoed met een hoog cholesteroldieet vertonen echter een significante toename van leversteatose (figuur 2).

Een bekende marker van leverziekte is hepatomegalie¹⁷. Om de levergrootte te evalueren, kunnen HCC-larven worden doorkruist met een transgene lijn die specifiek een fluorescerende marker op hepatocyten tot expressie brengt, zoals de Tg (fabp10a: H2BmCherry). Om hepatomegalie te beoordelen, worden evaluatie van het levergebied (2D), het leveroppervlak en het levervolume (3D) uitgevoerd. Na 8 dagen blootstelling aan een cholesteroloverschot werd leververgroting waargenomen bij HCC-larven (figuur 3).

Met behulp van niet-invasieve live beeldvorming kunnen transgene vislijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in hepatocytmembranen (zoals Tg (fabp10a: Life-actine-EGFPP) en in hepatocytenkernen (zoals Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) worden gebruikt om cellulaire en nucleaire morfologische veranderingen geassocieerd met maligniteit in hepatocyten te beoordelen. Het hepatocytengebied was verhoogd in NASH-geassocieerd HCC (figuur 4A, B, D), evenals nucleair gebied (figuur 4C, E) en nucleaire: cytoplasmatische verhouding (figuur 4F). Een significante afname van nucleaire circulariteit werd ook waargenomen in de HCD + HCC-groep (figuur 4G). Lipotoxiciteit veroorzaakt DNA-schade, een kenmerk van carcinogenese in de aanwezigheid van micronuclei. Met behulp van de H2B-mCherry marker zagen we een grotere incidentie van micronuclei in de HCC-larven gevoed met een hoog cholesterol dieet (figuur 4H).

Hepatische vasculatuur kan gemakkelijk worden geëvalueerd in zebravismodellen met behulp van een transgene gelabelde lijn, zoals Tg (kdrl: mCherry of Tg (fli: EGFP), die vasculatuur labelen. Een significante toename van de vaatdichtheid werd waargenomen bij HCC+HCD-larven (figuur 5).

Om de ontstekingsreactie te observeren die vroeg in NASH-geassocieerde HCC werd geactiveerd, werd een transgene vislijn die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in macrofagen en neutrofielen, zoals Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), overgestoken met de HCC-transgene lijn. Infiltratie van neutrofielen en macrofagen komt voor in zowel HCC als HCC gevoed met HCD, wat werd beoordeeld door kwantificering van het aantal en de dichtheid van neutrofielen /macrofagen in de lever en omgeving (omgeving tot 75μm) (figuur 6A-H). Niettemin vertoonde de HCC+HCD een significante toename van het aantal neutrofielen en de dichtheid (figuren 6F-H). 13 dagen na de bevruchting is het adaptieve immuunsysteem al functioneel. Met behulp van een transgene vislijn die fluorescerend eiwit tot expressie brengt in T-cellen, zoals de Tg (lck: EGFP), en in combinatie met de HCC-transgene lijn; we evalueerden de impact van cholesteroloverschot op de rekrutering van T-cellen naar de lever. Een significante afname van de T-celdichtheid en het totale aantal werd waargenomen bij HCC-larven gevoed met HCD (figuur 6I-K).

Transgene Zebrafish lijnen	ZFIN referentie	Test
Casper	roya9; MitfaW2	Leversteatose
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Venus / fabp10a: H2B-mCherry )	S704TG / Uwm41Tg	Levermorfologie
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Venus; fabp10a: H2B-mCherry; fabp10a: LIFEACT-EGFP)	S704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Hepatocyten en nucleaire morfologie
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_ cryaa: Venus; fli: EGFP)	S704TG / Y1TG	Angiogenese
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Venus;  mfap4: Tomaat-CAAX; LyzC:BFP)	S704TG / XT6TG / ZF2171Tg	Macrofaag en Neutrofielen rekrutering
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Venus; lck: EGFP)	S704TG / cz1Tg	T-cellen rekrutering

Tabel 1: Transgene zebravislijnen voor gebruik in verschillende testen.

Aantal larven	Grootte voerbak	Hoeveelheid voedsel per dag (mg)	E3 Volume (ml)
30-40	Kleine kweekbak	3-4	200
60-80	Kleine/Grote kweekbak	6-8	400
100-150	Grote kweekbak	10-15	500

Tabel 2: Stel de voorwaarden van voerbakken in.

Fenotype	Scoringsmethode
Geen	Normale kernen, geen micronuclei of hernia
Redelijk	Laag aantal micronuclei (minder dan 5 per gezichtsveld) en/of hernia
Matig/ Ernstig	Matig tot hoog aantal micronuclei (meer dan 5 per gezichtsveld) en/of hernia

Tabel 3: Micronuclei en Nuclear Herniation Scoring.

Figuur 1: Protocoldiagram met een samenvatting van de belangrijkste experimentele stappen en analysebenadering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Controletest voor leversteatose - ORO-kleuring. HCC-larven werden gevoed met een normaal of hoog cholesteroldieet en Oil Red O (ORO) -kleuring werd uitgevoerd om leversteatose te beoordelen. (A) Diagram van de 12 putplaat om sequentiële ORO-kleuring uit te voeren met behulp van de mesh-putinzetstukken. (B) Afbeelding van wimpergereedschap dat wordt gebruikt om larven te manipuleren. C) representatieve afbeeldingen van met olierood gekleurde levers; HCC en HCC+HCD larven. (D) Chi-kwade grafiek met het percentage larven met verschillende scores van leversteatose. Schaalbalk= 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van levergrootte. Transgene HCC-larven die een levermarker tot expressie brengen (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) werden live en niet-invasief in beeld gebracht op een omgekeerde spinschijf confocale microscoop met behulp van een zWEDGI. (A) Representatieve 3D-reconstructies van levers in HCC- en HCC+HCD-larven. (B-D) Grafiek met morfologische veranderingen in de lever, waaronder levergebied (B) leveroppervlak (C) en levervolume (D) bij HCC- en HCC + HCD-larven. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Representatieve beelden van hepatocyten en kernmorfologie. Transgene HCC-lijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in hepatocytmembranen (Tg(fabp10a:Life-actine-EGFP) en in hepatocytenkernen (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) werden in beeld gebracht. (A-C) Representatieve 3D-reconstructies van F-actine en hepatocytenkernen van HCC- en HCC+HCD-larven. Open pijlpunten tonen vergrote kernen; witte pijlpunten tonen kern met veranderde vorm; en rode pijlen tonen micronuclei en nucleaire herniatie. (D-G) Grafieken met gemiddelden van cel- en nucleaire parameters in HCC en HCC + HCD 13-dagen oude larven. (D) Hepatocyten gebied. (E) Nucleaire ruimte. (F) Verhouding Nucleair:Cytoplasma. (G) Nucleaire circulariteit. Elke stip vertegenwoordigt gemiddelden per larve. Dot plots tonen gemiddelde ±SEM (H) Chi-kwadraat grafieken met percentage larven met verschillende scores van Micronuclei en Nucleaire herniatie. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van hepatische vasculatuur. Transgene HCC-lijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in hepatocytenkernen (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) en in endotheelcellen (Tg)fli:EGFP)). (A) Representatieve 3D-reconstructies van levervaculatuur in HCC- en HCC+HCD-larven. (B-C) Grafiek met de vaatdichtheidsindex per leveroppervlak (B) volume (C) in HCC- en HCC+HFCD-larven. Dot plots tonen gemiddelde ±SEM. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Representatieve beelden uit het leverimmuuncellandschap. Transgene HCC-lijn die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in macrofagen en neutrofielen (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) of in T-cellen (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Representatieve 3D-reconstructies van levers en leukocytenrekrutering naar levergebied bij 13 dagen oude HCC- en HCC + HCD-larven. (B) Diagram van het afgebeelde levergebied. (D-E) Grafiek met macrofaagdichtheid (D) en aantal (E) in levergebied bij HCC- en HCC+HCD-larven. (G-H) Grafiek met neutrofielendichtheid (G) en aantal (H) in levergebied in HCC- en HCC + HCD-larven. (G) Representatieve 3D-reconstructies van T-celrekrutering naar levergebied in HCC- en HCC+HCD-larven. (H-I) Grafiek met T-celdichtheid (H) en aantal (I) in levergebied in HCC- en HCC+ HCD-larven. Dot plots tonen gemiddelde ±SEM. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Tabel met buffers en oplossingen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Met een verhoogde incidentie van HCC, met name NASH geïnduceerde HCC, is het van groot belang om efficiëntere modellen te hebben om de cellulaire en moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij NASH-geassocieerde HCC. Deconvolutie van cel-celinteracties in de lever zijn cruciaal om de progressie van leverziekte en hepatorcinogenese beter te begrijpen. De aanpak die in dit protocol wordt beschreven, biedt een unieke manier om de progressie van leverziekte in vivo en niet-invasief te analyseren.

Voorbereiding van het dieet is van cruciaal belang voor het succes van het opzetten van een NASH-geassocieerd HCC-model. Het is belangrijk om diethylether volledig te laten verdampen in de zuurkast om schadelijke effecten te voorkomen, terwijl u diëten voor zebravissen voorbereidt. Om deze diëten met larven te gebruiken (5-12 dagen na de bevruchting), is het uiterst belangrijk om de diëten tot fijne deeltjes te vermalen om de voedselinname door de larven te verzekeren. Het gebruik van fluorescerend gelabelde vetzuuranalogen kan worden gebruikt om de voedselinname bij larven te evalueren.

Voordat de larven in de kweekbakken worden geplaatst en de voerprocedure wordt gestart, is het cruciaal om ervoor te zorgen dat experimentele bemonstering wordt geüniformeerd door larven van verschillende platen te mengen. Deze stap is belangrijk omdat verschillende micro-omgevingen, beginnend op dag 0, in elk van de platen worden bevorderd en de ontstekingsreactie kunnen beïnvloeden.

Een andere belangrijke stap is om de larven te tellen, om te weten hoeveel voedsel nodig is voor elke voederbox. Als de hoeveelheid voedsel niet voldoende is voor het aantal larven dat in elke doos aanwezig is, zal een van de twee scenario's optreden: 1) larven zullen ondervoed zijn; 2) larven zullen overvoed worden. Onnauwkeurige voeding zal leiden tot ongezonde omstandigheden die verband houden met ondervoeding of overvoeding, zoals ontstekingen, die de micro-omgeving van de lever drastisch zullen beïnvloeden. Als onnauwkeurige voeding optreedt, zullen larven bewegingsproblemen vertonen. In dit ontwikkelingsfase moeten larven intensief zwemmen, dus als bewegingsproblemen worden opgemerkt, werden larven onder ongezonde omstandigheden grootgebracht (ondervoeding of blootstelling aan toxische doses cholesterol als gevolg van overvoeding). Om deze reden moeten voedingsprocedures streng worden gecontroleerd voor zowel diëten, normaal als cholesterolverrijkt. Sommige testen kunnen worden uitgevoerd om snel de nauwkeurigheid van de voeding en gezondheid van larven aan te pakken, waaronder de aanwezigheid van hepatomegalie (levergrootte) en ontsteking van weefsel en organen, met name lever en darm (zichtbare verhoogde infiltratie van neutrofielen en macrofagen).

Dagelijkse reiniging en vervanging van 95% van de E3 is cruciaal om de groei van micro-organismen in de voerbakken te verminderen en de gezondheid en overleving van larven te verbeteren. Als alternatief kunnen larven in een stand-alone racksysteem worden geplaatst. Plaats voor de beste resultaten 60-80 larven in een tank van 3 liter. Houd de waterstroom op het minimale niveau door de stroom aan te passen aan een sneldruppelmodus en larven tweemaal daags 3-4 mg (AM en PM) te voeren. De waterstroom moet regelmatig worden gecontroleerd om een correcte stroming in elke tank te garanderen. In ons laboratorium geeft deze methode ons 95-100% overleving met kortdurende voeding van 10% HCD. Bovendien verminderde deze methode de werklast die inherent is aan de dagelijkse reiniging en wateruitwisseling die nodig is in het beschreven statische voedingsprotocol.

Hoewel we een 10% cholesterolverrijkt dieet gebruikten om NASH te induceren bij een kortdurende blootstelling (5 dagen is voldoende om steatohepatitis te induceren), kunnen dieetwijzigingen worden uitgevoerd en uitgebreid om fructose ¹⁸, vetzuren (zoals palmitinezuur) te gebruiken ¹⁹ of voedingsprotocollen die kunnen worden uitgebreid met een 4% cholesterolverrijkt dieet²⁰. Momenteel zijn er weinig succesvolle therapeutische doelen voor HCC en geen voor NASH. Het gebruik van zebravismodellen biedt een unieke kans om onze kennis over hepatocarcinogenese uit te breiden, maar ook een ongeëvenaard gewerveld systeem om screenings van geneesmiddelen met een grote doorvoer uit te voeren. De technieken die in dit protocol worden beschreven, zullen toekomstige bevindingen en therapeutische doelen voor leverziekte en hepatocarscinogenese vergemakkelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm	Fisher	07-200-223
Corning Netwells inserts	Fisher	07-200-212
Diethyl ether	Fisher	60-046-380	Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres	Brine Shrimp Direct	-	Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets	Fisher	22-170-404
Isopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack	Crystalgen	221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM	Fisher	08-747D
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol	Sigma	O1391-500ML
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope	Leica	M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope	Nikon	Nikon CSU-W1
Stereomicroscope	Leica	S9i with transilluminated base
Software
Fiji	Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6	Bitplane; Oxford Instruments.