Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fagocytose is een georkestreerd proces dat verschillende stappen omvat: herkenning, binding en internalisatie. Professionele fagocyten nemen Leishmania-parasieten op door fagocytose, bestaande uit het herkennen van liganden op parasietoppervlakken door meerdere gastheercelreceptoren. Binding van Leishmania aan macrofaagmembranen vindt plaats via complementreceptor type 1 (CR1) en complementreceptor type 3 (CR3) en patroonherkenningsreceptoren. Lipofosfosfaliek (LPG) en 63 kDa glycoproteïne (gp63) zijn de belangrijkste liganden die betrokken zijn bij macrofaag-Leishmania interacties. Na de eerste herkenning van parasietliganden door gastheercelreceptoren, worden parasieten geïnternaliseerd, overleven en vermenigvuldigen zich in parasitofore vacuolen. Het rijpingsproces van leishmania-geïnduceerde vacuolen omvat de verwerving van moleculen uit intracellulaire blaasjes, waaronder monomeer G-eiwit Rab 5 en Rab 7, lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (LAMP-1), lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 2 (LAMP-2) en microtubule-geassocieerd eiwit 1A / 1B-lichtketen 3 (LC3).
Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen met behulp van confocale microscopie, waaronder (i) binding (ii) internalisatie en (iii) fagosoomrijping. Door toe te voegen aan de hoeveelheid kennis rond deze determinanten van infectie-uitkomst, hopen we het begrip van de pathogenese van Leishmania-infectie te verbeteren en de uiteindelijke zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische doelen te ondersteunen.
Inleiding
Leishmaniasis is een verwaarloosde tropische ziekte veroorzaakt door protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania, resulterend in een breed spectrum van klinische manifestaties in de gewervelde gastheer, waaronder cutane leishmaniasis, mucocutane leishmaniasis en viscerale leishmaniasis1. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat dat meer dan een miljard mensen risico lopen, met meer dan een miljoen nieuwe gevallen gemeld per jaar2.
Leishmania spp. zijn obligate intracellulaire protozoën die overleven in gastheercellen, waaronder monocyten, macrofagen en dendritische ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Cellen werden verkregen van gezonde donoren na goedkeuring van procedures door de Nationale Ethische Commissies voor Onderzoek (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Celculturen
- Van menselijke monocyten afgeleide macrofagen
OPMERKING: Om van menselijke monocyten afgeleide macrofagen te verkrijgen voor in vitro differentiatie in macrofagen, verzamelt u bloed van gezonde donoren en zuivert u perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) zoals beschreven door D. English en B. R. Andersen21.- Na het verzamelen van perifeer bloed (50 ml), giet het in een gehepariniseerde buis en verdun het bloed vervolgens....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit rapport is bedoeld om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens de fagocytose van L. braziliensis geïsoleerd van patiënten met L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL vorm van CL. Met behulp van confocale microscopie onderzochten we de belangrijkste gebeurtenissen geassocieerd met fagocytose van parasieten: binding, internalisatie en fagosoomrijping. We evalueerden eerst de L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL binding en fagocytose door menselijke m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Leishmania-macrofaag interactie is een complex proces en omvat verschillende stappen die de ontwikkeling van de ziekte kunnen beïnvloeden5. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de interactie van niet-geopsoniseerde Leishmania en gastheercellen beter te begrijpen, hebben we een protocol beschreven dat confocale fluorescentiemicroscopie gebruikt om fagocytose te beoordelen van vroege tot late stadia van Leishmania-infectie . Het gebruik van fluorescentietechnieken met .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling of -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
Wij danken het Gonçalo Moniz Instituut, Fiocruz Bahia, Brazilië en de afdeling microscopie voor hulp. Dit werk werd ondersteund door INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. heeft een subsidie voor productiviteit in onderzoek van CNPq (305235/2019-2). Plasmiden werden vriendelijk verstrekt door Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. De auteurs willen Andris K. Walter bedanken voor de Engelstalige revisie en hulp bij het bewerken van manuscripten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-geconjugeerd geit anti-konijn IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antilichaam | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Rund serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Kleurmiddel | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocale fluorescentiemicroscoop (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetaal rund serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescentiemicroscoop (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicine | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethaansulfonzuur) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normaal geit serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Apparaat | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector oplossing | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristaat acetaat (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Fosfaat buffer oplossing (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma | S5761 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referenties
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
