Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Samenvatting

De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.

Samenvatting

Orgaanontwikkeling, functie en regeneratie zijn afhankelijk van stamcellen, die zich bevinden in discrete anatomische ruimtes die stamcelniches worden genoemd. De continu groeiende muizensnijtand biedt een uitstekend model om weefselspecifieke stamcellen te bestuderen. De epitheliale weefselspecifieke stamcellen van de snijtand bevinden zich aan het proximale uiteinde van de tand in een nis die de cervicale lus wordt genoemd. Ze zorgen voor een continue instroom van cellen om de constante slijtage van de zelfslijpende punt van de tand te compenseren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie en cultuur van het proximale uiteinde van de muizensnijder die stamcellen en hun niche herbergt. Dit is een gemodificeerd Trowell-type orgaankweekprotocol dat in vitro kweek van weefselstukken (explantaten) mogelijk maakt, evenals de dikke weefselplakken op de vloeistof / lucht-interface op een filter ondersteund door een metalen rooster. Het hier beschreven orgaankweekprotocol maakt weefselmanipulaties mogelijk die in vivo niet haalbaar zijn, en in combinatie met het gebruik van een fluorescerende verslaggever (s), biedt het een platform voor de identificatie en tracking van discrete celpopulaties in levende weefsels in de loop van de tijd, inclusief stamcellen. Verschillende regulerende moleculen en farmacologische verbindingen kunnen in dit systeem worden getest op hun effect op stamcellen en hun niches. Dit biedt uiteindelijk een waardevol hulpmiddel om stamcelregulatie en -onderhoud te bestuderen.

Inleiding

Muizensnijtanden groeien continu door levenslang behoud van de stamcellen (SC) die de onophoudelijke productie van tandcomponenten ondersteunen. Deze omvatten epitheliale SC's, die glazuurproducerende ameloblasten genereren, en mesenchymale stamcellen (MSC's), die dentineproducerende odontoblasten genereren, naast andere cellen¹. De epitheliale SC's in de continu groeiende snijtanden werden aanvankelijk geïdentificeerd als labelkerende cellen ^2,3 en sindsdien is aangetoond dat ze een aantal bekende stamgenen tot expressie brengen, waaronder Sox2⁴. Deze cellen del....

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van dieren en alle procedures zijn goedgekeurd door ethische commissies voor het gebruik en de verzorging van dieren en de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Helsinki.

1. Bereiding van de orgelcultuurschaal

1. Voer alle procedures uit in een laminaire stromingskap. Reinig werkoppervlakken met 70% ethanol en gebruik instrumenten en oplossingen van autoclaved glas. Steriliseer een schaar en andere metalen apparatuur in een sterilisator met glaskralen.
2. Bereid filters voor die normaal in 70% ethanol worden bewaard door ze drie keer in 1x PBS te wassen om ethanol te verwijderen (

Resultaten

De epitheliale SC's bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, die zich aan het proximale uiteinde van de snijtand bevindt (figuur 3A). Cervicale lussen zijn morfologisch verschillende structuren die bestaan uit binnenste en buitenste glazuurepitheel die het stellaire reticulum omhullen, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen (figuur 3B,C). Er zijn twee cervicale lussen in elke snijtand (figuur .......

Discussie

In vitro orgaankweek is op grote schaal gebruikt om inductief potentieel en epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die orgaangroei en morfogenese regelen. Het Thesleff-laboratorium heeft aangetoond hoe de Saxén-modificatie van de Trowell-type orgaancultuur kan worden aangepast en gebruikt om de ontwikkeling van tanden te^{bestuderen 14}. De reproduceerbare omstandigheden en vooruitgang in fluorescerende verslaggevers hebben dit een nuttige methode gemaakt voor het monitoren van t.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	verdeel in aliquoten, bewaar bij -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Bewaar in 70% ethanol bij kamertemperatuur.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	verdund 100 mg/ml in MilliQ, filter gesteriliseerd en verdeeld in 20μl aliquoten, bewaar in het donker, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercieel verkrijgbaar, of zelf gemaakt van roestvrijstalen gaas (corrosiebestendig, maaswijdte 0,7 mm). Snijd een schijf met een diameter van ongeveer 30 mm en buig de randen om een hoogte van 3 mm te geven. Gebruik spijkers om gaten te maken.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors