Een gegeneraliseerde methode voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteit van granen en peulvruchten

Samenvatting

Fenolzuren zijn belangrijke fytochemicaliën die aanwezig zijn in volle granen. Ze bezitten bioactieve eigenschappen zoals antioxiderende beschermende functies. Dit werk was gericht op het rapporteren over een gegeneraliseerde methode voor de HPLC-identificatie, schatting van het totale fenolgehalte en bepaling van de antioxidantcapaciteit van fenolzuren in granen en peulvruchten.

Samenvatting

Fenolzuren zijn een klasse van organische verbindingen die zowel een fenolgroep als een carbongroep dragen. Ze worden gevonden in granen en concentreren zich in de zemelen van granen of zaadlaag van peulvruchten. Ze bezitten antioxiderende eigenschappen die de afgelopen jaren veel onderzoeksinteresse hebben gegenereerd, over hun potentiële antioxidant beschermende gezondheidsfuncties. Dit werk presenteert een gegeneraliseerde methode voor de extractie van vrij oplosbare fenolzuren uit volle granen en analyse van hun antioxidantcapaciteit. Vijf volkoren monsters bestaande uit twee granen (tarwe en gele maïs) en drie peulvruchten (cowpea bonen, nierboon en sojabonen), werden gebruikt. De korrels werden gemalen tot meel en hun vrij oplosbare fenolzuren werden geëxtraheerd met behulp van waterige methanol. De verbindingen werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van een hogedrukvloeistofchromatograaf (HPLC). De Folin-Ciocalteu-methode werd gebruikt om hun totale fenolgehalte te bepalen, terwijl hun antioxidantcapaciteiten werden bepaald met behulp van de DPPH-radical scavenging-capaciteit, Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC) en zuurstofradicaalabsorptiecapaciteit (ORAC) -testen. De geïdentificeerde fenolzuren omvatten vanilline-, cafeïne-, p-coumarine- en ferulazuren. Vanillic zuur werd alleen geïdentificeerd in cowpea, terwijl cafeïnezuur alleen werd geïdentificeerd in nierbonen. p-coumarinezuur werd geïdentificeerd in gele maïs, cowpea en sojabonen, terwijl ferulazuur in alle monsters werd geïdentificeerd. Ferulazuur was het overheersende fenolzuur dat werd geïdentificeerd. De totale concentratie van fenolzuren in de monsters daalde in de volgende volgorde: sojabonen > cowpea-bonen > gele maïs = nierboon > tarwe. De totale antioxidantcapaciteit (som van de waarden van DPPH-, TEAC- en ORAC-assays) daalde als volgt: sojabonen > nierboon > gele maïs = cowpea-bonen > tarwe. Deze studie concludeerde dat HPLC-analyse en DPPH-, TEAC- en ORAC-assays nuttige informatie bieden over de fenolzuursamenstelling en antioxiderende eigenschappen van volle granen.

Inleiding

Fenolzuren behoren tot de belangrijkste fytochemicaliën die in planten worden bestudeerd vanwege de vitale rol die ze spelen bij de verdediging van planten tegen herbivore en schimmelinfecties, evenals het behoud van structurele ondersteuning en integriteit in plantenweefsels ^1,2. Ze zijn overvloedig aanwezig in de zemelen van granen en zaadlaag van peulvruchten³. Structureel zijn ze verdeeld in twee groepen: de hydroxybenzoëzuren (figuur 1) en hydroxycinnamic zuren (figuur 2). De veel voorkomende hydroxybenzoëzuren in granen en peulvruchten omvatten galluszuur, p-hydroxybenzoïcum, 2,4-dihydroxybenzoïcum, protocatechuic, vanillic en syringinezuur, terwijl de gemeenschappelijke hydroxycinnaminezuren cafeïnezuur, p-coumarinezuur, ferulazuur en sinapiczuren omvatten³. Fenolzuren bezitten ook antioxiderende eigenschappen omdat ze vrije radicalen kunnen opruimen, die oxidatieve ranzigheid in vetten veroorzaken, en radicaal-geïnduceerde oxidatieve stress in fysiologische systemen initiëren en verspreiden ^4,5. Vanwege deze vitale fysiologische rol als antioxidanten, zijn ze het onderwerp van recent onderzoek. Dit komt omdat wanneer ze worden geconsumeerd als componenten van plantaardig voedsel, ze antioxiderende bescherming kunnen uitoefenen.

Granen en graanproducten zijn belangrijke koolhydraatvoedselbronnen voor mens en dier wereldwijd⁶. Granen omvatten tarwe, rijst, maïs (maïs), gerst, triticale, gierst en sorghum. Onder hen is maïs de meest gebruikte, met een geschat wereldwijd gebruik van 1.135,7 miljoen ton in 2019/2020, gevolgd door tarwe met een geschat wereldwijd gebruik van 757,5 miljoen ton in dezelfde periode⁷. Graanproducten zijn geweldige energiebronnen voor consumenten, omdat ze rijke bronnen van koolhydraten zijn. Ze bieden ook wat eiwitten, vetten, vezels, vitamines en mineralen⁶. Naast hun voedingswaarde zijn granen goede bronnen van fytochemische antioxidanten, met name fenolzuren, die het potentieel hebben om het fysiologische systeem te beschermen tegen radicaal-geïnduceerde oxidatieve schade³. Peulvruchten zijn ook goede bronnen van voedingsstoffen en zijn over het algemeen hoger in eiwitten dan granen. Ze bevatten ook vitamines en mineralen en worden gebruikt bij de bereiding van verschillende voedingsmiddelen⁸. Bovendien zijn peulvruchten goede bronnen van een verscheidenheid aan fytochemische antioxidanten, waaronder fenolzuren, flavonoïden, anthocyanen en proanthocyanidinen ^9,10. Verschillende soorten granen en peulvruchten kunnen een verschillende fenolzuursamenstelling hebben. Er is daarom de noodzaak om de fenolzuursamenstelling van granen en peulvruchten en hun variëteiten te bestuderen, om hun potentiële gezondheidsvoordelen met betrekking tot fenolische antioxidanten te kennen.

Een aantal testen zijn gerapporteerd voor het meten van de hoeveelheid fenolzuren in granen en peulvruchten en het bepalen van hun antioxiderende activiteiten. De meest voorkomende analysemethoden voor volkorenfenolzuren zijn spectrofotometrie en vloeistofchromatografie¹¹. Het doel van dit werk was om een gegeneraliseerde hogedruk vloeistofchromatografische methode te demonstreren voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en spectrofotometrische methoden voor het bepalen van het totale fenolgehalte en de antioxidantcapaciteit van sommige volkoren granen en peulvruchten.

Protocol

1. Soort monsters

1. Gebruik vijf volkorenmonsters, bestaande uit twee granen (bijv. Durumtarwe en gele maïs) en drie peulvruchten (bijv. Blackeye cowpea-boon, sojaboon en rode nierboon) voor deze studie.
2. Maal 50 g van elk graan in drievoud tot bloem, met behulp van een koffiemolen, en laat ze door een zeef van 500 μm gaan.
3. Bewaar ze bij -20 °C.

2. Monstervoorbereiding

1. Bepaling van het drogestofgehalte en uitdrukking van de drogestofbasis
   OPMERKING: Bepaal het drogestofgehalte van elk monster in poedervorm volgens de methode van AOAC (2000)¹².
   1. Zet een geforceerde heteluchtoven aan en stel de temperatuur in op 130 °C.
   2. Droog droog droogmiddel (silicagel) gedurende 30 min tot 1 uur in de oven en breng de gedroogde silicagel over in een exsiccator.
   3. Weeg nauwkeurig 2 g van elk monster in een schoon, voorgedroogd en gewogen aluminium blik.
   4. Droog de gewogen monsters gedurende 1 uur bij 130 °C in een geforceerde heteluchtoven.
   5. Breng het gedroogde monster over naar de exsiccator en laat afkoelen tot omgevingstemperatuur.
   6. Weeg het gedroogde, afgekoelde monster en noteer het gewicht.
   7. Bereken het drogestofgehalte van elk monster als volgt:
      
   8. Druk elke parameter gemeten in drooggewicht uit met behulp van de volgende formule:
      
2. Fenolzuur extractie
   OPMERKING: Extraheer de oplosbare vrije fenolverbindingen in de graanmonsters met behulp van een wijziging van de methode van Y. Qiu et ^al.5 die fenolextractie uit milligrammen volle granen mogelijk maakt.
   1. Weeg nauwkeurig 100 mg van het volkorenmeelmonster rechtstreeks in een amberkleurige microcentrifugebuis met een capaciteit van 2 ml. De donkere kleur van de buis helpt blootstelling van het mengsel aan licht te voorkomen.
   2. Voeg 1 ml 80% waterige hplc-ethanol toe aan elk van de buizen die de monsters bevatten.
   3. Vortex kort om de methanoloplossing en de monsters te mengen.
   4. Soniceer de monsters gedurende 60 minuten om de vrij oplosbare fenolverbindingen te extraheren. Plaats een deksel over de monsters voor de duur van de ultrasoonapparaat voor extra bescherming tegen licht.
   5. Centrifugeer na ultrasoonapparaat het mengsel op 20.000 × g gedurende 5 minuten om de vaste residuen te bezinken en het supernatant bovenop te laten. Vrije fenolverbindingen zullen na centrifugeren aanwezig zijn in het supernatant.
   6. Breng het supernatant over in een schone microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Het supernatant moet worden gefilterd voordat het in het HPLC-instrument wordt geïnjecteerd. Om het supernatant te filteren, verwijdert u de zuiger van een spuit van 3 ml en bevestigt u een spuitfilter. Het filter mag een poriegrootte hebben van niet groter dan 0,22 μm.
   7. Pipetteer ongeveer 0,4 ml van het supernatant in de bovenkant van de spuit. Plaats de zuiger opnieuw en duw de vloeistof door het filter in een HPLC-injectieflacon met een injectieflacon.
   8. Zodra het instrument is ingesteld om de methode uit te voeren die in het manuscript voor HPLC-analyse wordt beschreven, laadt u de injectieflacons in de carrousel om overeen te komen met de steekproeflijst.
   9. Verkrijg HPLC-chromatogrammen bij 320 nm en 280 nm die verschillende pieken laten zien die verschillende fenolverbindingen vertegenwoordigen.
   10. Kwantificeer hydroxycinnaminezuren met behulp van geschikte standaardcurven bij 320 nm, omdat ze maximale absorptie hebben bij deze golflengte. Kwantificeer volgens hetzelfde principe hydroxybenzoëzuren bij 280 nm.
   11. Bewaar de resterende extracten bij -20 °C voor andere analyses.

3. Fenolische samenstelling

1. Gebruik een hogedrukvloeistofchromatograaf (Table of Materials) om de geëxtraheerde fenolverbindingen in de monsters te identificeren en te kwantificeren, gebaseerd op de methode van J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu en T. Beta ⁴.
2. Bereid fenolzuurstandaarden voor (vanillinezuur, cafeïnezuur, p-coumarinezuur, ferulazuur en sinapic zuur) om samenstellende fenolverbindingen in de extracten te identificeren en te kwantificeren.
3. Om dit te doen, weegt u 1 mg van elke standaard en lost u op in 1 ml 50% waterige methanol om 1.000 μg / ml van elke standaard te produceren.
4. Meng gelijke volumes van alle vijf de standaarden in een amberkleurige centrifugebuis van 2 ml om een cocktail van normen te produceren, elk met een concentratie van 200 μg / ml.
5. Bereid seriële verdunningen van de standaardcocktail door een volume in een nieuwe buis te nemen en met hetzelfde volume van het waterige methanoloplosmiddel te verdunnen.
6. Herhaal de seriële verdunningen tot een concentratie van 3,125 μg/ml.
7. Verdun ook elke standaard 40 keer afzonderlijk met het oplosmiddel om een concentratie van 25 μg/ml van elke standaard te verkrijgen.
8. Stel de kolomtemperatuur in op 35 °C en de temperatuur van de monsteroven op 15 °C.
9. Om mobiele fase A (0,1% waterig mierenzuur) te bereiden, brengt u 1 ml mierenzuur over in een maatkolf met een capaciteit van 1 L en voegt u water van HPLC-kwaliteit toe aan de 1 L-markering. Schud goed om te mengen.
10. Om mobiele fase B (0,1% mierenzuur in methanol) te bereiden, brengt u 1 ml mierenzuur over in een maatkolf met een capaciteit van 1 L en voegt u methanol van HPLC-kwaliteit toe aan de 1 L-markering. Schud goed om te mengen.
11. Pas de volumes indien nodig aan op de 1 L-markering.
12. Filter beide mobiele fasen door een hydrofiel filhloorpapier van 0,45 μm.
13. Injecteer voor de analyse 10 μL van elk extract of standaard (25 μg/ml standaarden en de standaard cocktails) in de omgekeerde fasekolom.
14. Eluteer met de mobiele fasen volgens het lineaire gradiëntprogramma voor een run van 25 minuten als volgt: 0-3,81 min, 9% -14% B; 3,81-4,85 min, 14% -15% B; 4,85-5,89 min, 15% -15% B, 5,89-8,32 min, 15% -17% B; 8,32-9,71 min, 17% -19% B; 9,71-10,40 min, 19% -19% B; 10,40-12,48 min, 19% -26% B; 12,48-13,17 min, 16% -28% B; 13,17-14,21 min, 28% -35% B; 14,21-15,95 min, 35% -40% B; 15,95-16,64 min, 40% -48% B; 16,64-18,37 min, 48% -53% B; 18,37-22,53 min, 53% -70% B; 22,53-22,88 min, 70% -90% B; 22,88-25,00 min, 90% B.
15. Vergelijk de retentietijden van chromatografische pieken verkregen voor de authentieke normen van concentraties 25 μg/ml, bij 280 nm en 320 nm, met die van de extracten, om de samenstellende fenolverbindingen in de monsters te identificeren.
16. Plot kalibratiecurven voor de fenolzuurstandaardcocktails, met concentratie van de standaarden op de horizontale as en het piekgebied op de verticale as
17. Gebruik de kalibratiecurven om de concentraties van de geïdentificeerde fenolverbindingen te schatten door de piekgebieden op het perceel te vergelijken met die van de geïdentificeerde verbindingen bij 280 nm en 320 nm zoals vermeld in de eerdere sectie.

4. Totaal fenolgehalte

OPMERKING: Bepaal het totale fenolgehalte van de extracten met behulp van de Folin-Ciocalteu-methode beschreven door F.B. Apea-Bah et ^al.13.

1. Bereid ferulazuur- en galluszuurstandaarden voor binnen het concentratiebereik van 0,025 tot 0,150 mg/ml om kalibratiecurven in vergelijking uit te zetten voor de schatting van het totale fenolgehalte.
2. Om dit te doen, weeg nauwkeurig 1 mg ferulazuur en galluszuurstandaarden in centrifugebuizen met een capaciteit van 2 ml.
3. Voeg 1 ml 50% waterige methanol toe aan elke standaard en vortex om op te lossen, waardoor 1 mg / ml voorraad van elke standaard ontstaat.
4. Bereid een reeks verdunningen van elke stamoplossing in een totaal van 500 μL.
5. Pipetteer 18,2 μL van elk extract of standaard in een aparte put op een 96-well microplaat.
6. Voeg 36,4 μL van 10% (v/v) waterig Folin-Ciocalteu-reagens toe aan elk extract of standaard.
7. Voeg vervolgens 145,4 μL 700 mM natriumcarbonaat toe aan elk reactiemengsel.
8. Incubeer de reactiemengsels in het donker bij kamertemperatuur (20-25 °C) gedurende 2 uur.
9. Lees de absorptie op een microplaatlezer bij 750 nm.
10. Zet kalibratiecurven van verandering in absorptie af tegen de concentratie van de fenolzuurstandaarden en gebruik ze om het totale fenolgehalte te schatten.
11. Druk de resultaten uit als milligram ferulazuurequivalenten per gram gemalen monster (mg FAE/g) en milligram galluszuurequivalenten per gram gemalen monster (mg GAE/g) op basis van droog gewicht.

5. Antioxidant assays

OPMERKING: Bepaal de antioxidantcapaciteit van de graanextracten met behulp van de volgende drie assays: 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicaal opruimcapaciteit; 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) radicaal opruimcapaciteit, die ook wel de Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) wordt genoemd; en zuurstof radicalen absorptie capaciteit (ORAC).

1. Voorbereiding van Trolox-normen voor standaardcurven
   1. Gebruik Trolox, een in water oplosbaar analoog van vitamine E, als standaard om de in vitro antioxidantcapaciteit van de volkorenextracten te schatten.
   2. Weeg nauwkeurig 1 mg Trolox in een buis van 15 ml. Los op in 4 ml 50% waterige methanol. Vortex om op te lossen om een stamoplossing van 1 mM (1000 μM) te bereiden.
   3. Bereid zes concentraties Trolox voor, dat wil zeggen 50, 100, 200, 400, 600 en 800 μM om standaardcurven uit te zetten voor de schatting van dpph-radicale opruimcapaciteit en Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC). Bereid op dezelfde manier 6,25, 12,5, 25 en 50 μM concentraties Trolox voor voor het schatten van het absorptievermogen van zuurstofradicalen (ORAC). Stel het totale volume van elke concentratie samen tot 500 μL zoals aangegeven in tabel 1.
2. Verdunning van monsterextracten
   1. Verdun de monsterextracten met methanol voorafgaand aan de analyse. Hier werden gele maïs- en cowpea-extracten twee keer verdund, de tarwe en nierboon werden vijf keer verdund terwijl het soja-extract 10 keer werd verdund met methanol.
3. Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) test
   1. Meet de Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) van de monsters met behulp van de methode eerder beschreven door F.B. Apea-Bah et ^al.14.
   2. Weeg 8,23 mg ABTS af in een schone amberkleurige centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml.
   3. Weeg vervolgens 1,62 mg kaliumpersulfaat in een andere schone amberkleurige centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml.
   4. Voeg 1 ml gedestilleerd water toe aan elk van hen en vortex om ze op te lossen.
      OPMERKING: Dit resulteert in 16 mM ABTS-stamoplossing met 6 mM waterige kaliumpersulfaatoplossing.
   5. Bereid de ABTS-stamoplossing door de ABTS- en kaliumpersulfaatoplossingen in gelijke volumes te mengen. De oplossing verandert onmiddellijk in een donkere kleur.
   6. Incubeer het reagensmengsel in het donker gedurende 12-16 uur.
   7. Verdun de ABTS-stamoplossing 30 keer met 200 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de ABTS-werkoplossing te vormen. Voeg hiervoor 58 ml pbs van 200 mM toe aan 2 ml van de ABTS-voorraadoplossing. De werkoplossing bevat 0,27 mM ABTS en 0,1 mM kaliumpersulfaat.
   8. Plaats voor de analyse 10 μL van elk verdund extract of Trolox in een 96-well microplaat.
   9. Voeg 190 μL ABTS-werkoplossing toe aan elke put en incubeer de reactiemengsels gedurende 60 minuten.
   10. Meet de absorptie van de reactiemengsels bij 750 nm in een microplaatlezer.
   11. Gebruik de Trolox-standaarden in een concentratie van 100 tot 800 μmol/L om een kalibratiecurve uit te zetten.
   12. Schat de ABTS-capaciteit voor radicale opruiming uit de kalibratiecurve.
   13. Druk de resultaten uit als micromol Trolox-equivalenten per gram (μmol TE/g) monster op basis van droog gewicht.
4. DPPH-test
   OPMERKING: Bepaal de DPPH-capaciteit voor het opruimen van radicalen van de monsters met behulp van de methode die eerder is beschreven door F.B. Apea-Bah et ^al.13. De DPPH antioxidant assay vereist een radicaal-genererende verbinding, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).
   1. Weeg nauwkeurig 1,2 mg DPPH in een lege centrifugebuis met een capaciteit van 50 ml. Los de DPPH op in 30 ml methanol om een methanoloplossing van 60 μmol/l te bereiden.
      OPMERKING: De DPPH-test test het vermogen van de monsterextracten om vrije radicalen geproduceerd door DPPH op te ruimen.
   2. Voeg voor de analyse 5 μL van de monsterextracten of Trolox-oplossing toe aan de microplaatputten.
   3. Voeg vervolgens 195 μL van de 60 μmol/L DPPH methanoloplossing toe en incubeer gedurende 60 minuten.
   4. Meet de absorptie van het reactiemengsel bij 515 nm.
   5. Gebruik de Trolox-normen (50-800 μmol/L) om een kalibratiecurve uit te zetten, met de verandering in absorptie op de verticale as en de Trolox-concentraties op de horizontale as.
   6. Schat de DPPH-opruimcapaciteit op basis van de kalibratiecurve.
   7. Druk de resultaten uit als micromol Trolox-equivalenten per gram (μmol TE/g) monster op basis van droog gewicht.
5. Absorptievermogen zuurstofradicaal
   1. Bepaal de zuurstofradicalenabsorptiecapaciteit (ORAC) van de monsters op basis van de methode van F.B. Apea-Bah et ^al.13.
   2. Bereid om te beginnen Trolox-normen voor van concentraties 6,25, 12,5, 25 en 50 μM uit een Trolox-standaardvoorraadoplossing van 1.000 μM in 75 mM kaliumfosfaat (K₂HPO₄ / KH₂PO₄) buffer.
   3. Om dit te doen, weeg 1 mg Trolox poeder en los op in 4 ml van de bufferoplossing onder ultrasoonapparaat om een 1.000 μM stamoplossing te bereiden.
   4. Neem vervolgens 50 μL van de stamoplossing in een centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml en verdun met 950 μL bufferoplossing om 1.000 μL 50 μM Trolox-oplossing te verkrijgen.
   5. Pipetteer 500 μL van de 50 μM-oplossing in een nieuwe buis en verdun met een gelijk volume buffer om een Trolox-oplossing van 25 μM te verkrijgen.
   6. Herhaal de seriële verdunning van de 25 μM om 12,5 μM te verkrijgen en herhaal vervolgens op dezelfde manier de verdunning van 12,5 μM om 6,25 μM te verkrijgen.
   7. Bereid passende verdunningen van de monsterextracten.
   8. Verdun de gele maïs- en cowpea-extracten 20 keer, de tarwe- en nierbonenextracten 50 keer en het soja-extract 100 keer met de bufferoplossing.
   9. Breng 200 μL van elk monster of Trolox standaard over in de putten van een zwarte 96-well microplaat voor automatisch pipetteren.
   10. Vul vervolgens de drie reagenstanks die bij de ORAC-apparatuur zijn geleverd, met het volgende: (1) de bufferoplossing; (2) 0,816 nM fluoresceïne in de buffer; en (3) 153 mM van 2,2′-azobis(2-amidinopropaan) dihydrochloride (AAPH) in buffer.
   11. Plaats ze in hun recipiënten voor automatisch pipetteren.
   12. Stel de ORAC-machine en het automatische pipetteersysteem in voor analyse, op basis van de standaardwerkprocedure.
   13. Stel voor de analyse het geautomatiseerde pipetteersysteem in om 25 μL van elk verdund extract of standaard over te brengen naar de putten van een heldere zwarte 96-well microplaat.
   14. Voeg vervolgens automatisch 150 μL 0,816 nM fluoresceïne toe in buffer.
   15. Incubeer het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten in de ORAC-machine.
   16. Voeg daarna automatisch 25 μL van de AAPH toe aan elk reactiemengsel.
   17. Incubeer ze bij 37 °C gedurende 50 minuten in de ORAC-machine.
   18. Stel de ORAC-machine in om het fluorescentieverval te meten, gedurende de incubatietijd, bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 485 nm en 520 nm.
   19. Zet na de metingen een Trolox-standaardcurve uit, met Trolox (6,25-50 μM) op de horizontale as en fluorescentieverval op de verticale as.
   20. Schat het absorptievermogen van zuurstofradicalen van de extracten uit de Trolox-standaardcurve.
   21. Druk de resultaten uit als μmol TE/g monster op basis van drooggewicht.
6. Statistische analyse
   1. Presenteer alle resultaten als middel ± standaarddeviatie van ten minste drievoud.
   2. Voer variantieanalyse (ANOVA) uit om het effect van het korreltype op de responsvariabelen te bepalen.
   3. Wanneer er significante verschillen bestaan bij p < 0,05, gebruik dan het kleinste significante verschil (LSD) om de gemiddelden te vergelijken.
   4. Voer Pearson-correlatieanalyse uit om de relatie tussen het fenolgehalte en de antioxidantcapaciteiten te schatten.

Resultaten

Tabel 2 toont de fenolzuren die werden geïdentificeerd in de granen en peulvruchten. Op basis van beschikbare authentieke normen werden vier fenolzuren geïdentificeerd in de monsters en dat zijn: vanillic, caffeic, p-coumaric en ferulazuren. Vanillinezuur is een hydroxybenzoëzuur terwijl de andere drie hydroxycinnamic zuren zijn. Vanillic zuur werd alleen geïdentificeerd in Blackeye cowpea bean, terwijl cafeïnezuur alleen werd geïdentificeerd in nierboon. p-Coumarinezuur werd geïdentif...

Discussie

De volle granen werden geselecteerd als representatieve graankorrels en peulvruchten die wereldwijd brede voedseltoepassingen vinden. Hoewel er variaties kunnen bestaan tussen cultivars van elk graan, was de focus van deze studie om een gegeneraliseerde methode voor vrije fenolzuurextractie en analyse voor volle granen aan te tonen. De extractiemethode werd gewijzigd door de hoeveelheden monsters en oplosmiddelen aanzienlijk te verminderen, om de hoeveelheid chemicaliën die bij dergelijke experimenten in het milieu zoude...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL Falcon conische centrifugebuizen	Fisher Scientific	05-527-90
2 mL Amber glazen ID Surestop-flesje	Thermo Scientific	C5000-2W
2 mL Amber microcentrifugebuizen	VWR	20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropaan) dihydrochloride (AAPH)	Sigma-Aldrich	440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%,	Sigma Aldrich	A1888-2G
2,2-Difenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)	Sigma Aldrich	D913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur (Trolox) (C14H18O4), ≥98%	Fluka Chemika	56510
9 mm Autosampler Vial Schroefdraaddoppjes	Thermo Scientific	60180-670
96-well platen met platte bodem	Fisher Scientific	12565501
Agilent BioTek ELx800 microplate reader	Fisher Scientific	BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 geautomatiseerd microplate pipetteringssysteem	Fisher Scientific	N/A
Agilent BioTek FLx800 microplate fluorescentie lezer	Fisher Scientific	N/A
Analytische weegschaal SI-114	Denver Instrument	SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus	Waters	WAT078900
BD 3 mL spuit Luer-Lok Tip	BD	309657
Bransonic ultrasoonreiniger, Branson 5510	Millipore Sigma	Z245143
Corning LSE Vortex Mixer	Corning	6775
Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membraan)	Merck Millipore Ltd	HVLP04700
Durapore Membraanfilters (0.45 µm HV)	Merck Millipore Ltd	HVHP04700
Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL	Eppendorf	3123000071
Eppendorf Research plus, 100-1000 µL	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research plus, 10-100 µL	Eppendorf	3123000047
Ethylacetaat, HPLC-kwaliteit	Fisher Chemical	E195-4
Ferulinezuur standaard	Sigma Aldrich	128708-5G
Fluoresceïne	Fisher Scientific	AC119245000
Folin & Ciocalteu fenolreagens	Sigma Aldrich	F9252
Forminezuur, 99%	Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a	27048-0010
Gallinezuur standaard	Sigma	G7384
Hoge prestatie vloeistof chromatograaf (HPLC), Waters 2695	Waters	960402
Methanol, HPLC-kwaliteit	Fisher Chemical	A452-4
Micro pipet tips, 0.5-10 µL	Fisherbrand	21-197-2F
Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge	Thermo Scientific	75002435
Multikanaals micropipet, Proline Plus, 30-300 µL	Sartorius	728240
Fotodiode array detector, Waters 2996	Waters	720000350EN
Pipet tips, 1000 µL	VWR	83007-382
Pipet tips, 1-5 mL	VWR	82018-840
Kaliumpersulfaat (K2S2O8), ≥99.0%	Sigma Aldrich	216224-100G
Kaliumfosfaat dibasisch anhydrisch (K2HPO4)	Fisher Scientific	P288-500
Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
PYREX 250 mL Kort Hals Kookkolf, Ronde Bodem	Corning	4321-250
Omgekeerde fase C18 Analytische Kolom (100 x 3 mm) Accucore aQ	Thermo Scientific	17326-103030
Rotor verdamper, IKA RV 10	IKA	0010005185
Natriumcarbonaat (NaCO3) anhydrisch	Fisher Chemical	S263-1
Natriumchloride (NaCl)	Mallinckrodt AR®	7581
Natriumfosfaat dibasisch anhydrisch (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-500
Natriumfosfaat monobasisch anhydrisch (NaH2PO4)	Fisher bioreagents	BP329-500
Standaardisatie pipet tips 0-200µL	Fisherbrand	02-681-134
Spuit aangedreven Filter unit (0.22 µm)	Millex®-GV	SLGVR04NL
Target micro-serts v