Methodenartikel

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62487

⸱

6 april 2021

 ,  ,  , 
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Samenvatting

De COVID-19-pandemie heeft de noodzaak onderstreept van snelle high-throughput-methoden voor gevoelige en specifieke serologische detectie van infecties met nieuwe pathogenen, zoals SARS-CoV-2. Multiplex serologische testen kunnen bijzonder nuttig zijn omdat het tegelijkertijd antilichamen tegen meerdere antigenen kan analyseren die de dekking van pathogenen optimaliseren en controles op variabiliteit in het organisme en de individuele gastheerrespons. Hier beschrijven we een SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende microsfeergebaseerde test die zowel IgM- als IgG-antilichamen kan detecteren tegen drie belangrijke SARS-CoV-2-antigenen- het spike (S) -eiwit, spike angiotensine-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-bindend domein (RBD) en nucleocarpsid (Nc). De test bleek vergelijkbare prestaties te hebben als een SARS-CoV-2-referentietest voor IgG in serum verkregen na ≥21 dagen na het begin van de symptomen, maar had een hogere gevoeligheid met monsters verzameld op ≤5 dagen na het begin van de symptomen. Verder werd met behulp van oplosbare ACE2 in een neutralisatietestformaat remming van antilichaambinding aangetoond voor S en RBD.

Inleiding

De COVID-19-pandemie heeft het belang benadrukt van het snel kunnen ontwikkelen en implementeren van snelle, high-throughput, hoogwaardige serologische tests die kunnen worden gebruikt voor de diagnose en surveillance van nieuwe pathogenen zoals SARS-CoV-2. Multiplex serologische testen kunnen uiterst nuttig zijn in een pandemie, omdat het tegelijkertijd antilichamen tegen meerdere antigenen kan analyseren, wat zorgt voor een brede pathogeendekking en controles voor variabiliteit in het organisme en de reactie van de gastheer op infectie. De ontwikkeling van een multiplex fluorescerende op kralen gebaseerde test, het SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), dat antilichamen kan detecteren tegen het spike (S) -eiwit, het spike angiotensine-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD) en nucleocapsid (Nc) van SARS-CoV-2 werd onlangs gemeld1. 3Flex bleek vergelijkbare prestaties te hebben als een referentie SARS-CoV-2 IgG-test voor serum verkregen op ≥21 dagen na het begin van de symptomen, maar had een hogere gevoeligheid met monsters verzameld op ≤5 dagen na het begin van de symptomen. Bovendien werd remming van antilichaambinding aangetoond voor S- en RBD-antigenen met behulp van oplosbare ACE2 in een neutralisatietestformaat. Multiplex-op kralen gebaseerde technologie is op grote schaal toegepast als een bewezen technologie voor multiplex serologische testen en heeft duidelijke voordelen voor grootschalige screening, waaronder een korte tijd tot resultaten, kleine monstervereisten en verminderde arbeid2,3,4.

Onlangs is een nieuw stroomanalyse-instrument beschikbaar gekomen dat dezelfde high-plex, high-throughput-capaciteit biedt als het systeem dat in eerder werk1werd gedemonstreerd, maar met het extra voordeel van twee reporterkanalen. De mogelijkheid om twee fluorescerende reportersignalen in een enkele reactie te meten, maakt de beoordeling van twee resultaten per analyt voor elk monster mogelijk en is ideaal voor isotyperingstoepassingen, die meestal in afzonderlijke reactieputten moeten worden uitgevoerd5. De dubbele reportercapaciteit biedt twee keer de gegevens voor elk monster in half zoveel reactieputten met de helft van de vereisten voor het monstervolume, en heeft dus een duidelijk voordeel ten opzichte van systemen met één verslaggever. Deze studie beschrijft het standaard serologische assay protocol en beschrijft de aanpassing aan een neutralisatie assay. Daarnaast beschrijft dit rapport de conversie van de single reporter assay naar een dual reporter serologische assay, en vervolgens een dual reporter neutralisatie assay, om tegelijkertijd neutraliserende antilichamen van zowel IgG- als IgM-isotypen tegen de SARS-CoV-2 S, RBD en Nc-antigenen te meten. Een visueel overzicht van het testprotocol is te vinden in figuur 1.

Protocol

Residuele menselijke serummonsters die eerder waren getest voor SARS-CoV-2 diagnostische analyses werden gebruikt in deze studie die werd goedgekeurd door de University of Rochester Institutional Review Board.

1. Reagentia en apparatuur

  1. Verkrijg coronavirusantigenen en menselijke IgG en IgM uit commerciële bronnen.
  2. Verkrijg assay control (AC) kralensets (45 en 220) van de instrumentleverancier. De AC-kralenset 45 bewaakt de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) verzameling op single reporter channel (RP1) instrumenten. De AC-kralenset 220 bewaakt de MFI-verzameling op het tweede reporterkanaal (RP2).
  3. Verkrijg detectieantistoffen en antigeenspecifieke konijnensera en antilichamen die worden gebruikt voor koppelingsbevestiging.
  4. Voer de detectie uit met biotine-gelabelde antilichamen met een streptavidin, R-phycoerythrin conjugaat (SAPE) of een streptavidin-conjugaat van fluorofoor Super Bright 436 (SASB; excitatie bij 405 nanometer (nm) en emissie bij 436 nm).
  5. Verkrijg menselijk ACE2-eiwit (d.w.z. de SARS-receptor). Rehydrateer vóór gebruik het gelyofiliseerde ACE2-eiwit door het op te lossen tot een concentratie van 1 mg/ml in nucleasevrij water (niet met DEPC behandeld, geautoclaveerd en 0,2 μm steriel gefilterd) en bewaar bij 4 °C.
  6. Voer alle reacties uit in 96-well nonbinding surface (NBS) zwarte platen met platte bodem. Sluit de platen af met 96 well microplate aluminium afdichtingstapes voor testincubatiestappen. Gebruik een magnetische platenscheider voor de wasstappen.

2. Antigeen-gekoppelde en antilichaam-gekoppelde controle kralen voorbereiding

  1. Koppel magnetische, polystyreen en kleurgecodeerde microsfeersets (diameter 6,5 μm) covalent aan S-, RBD- en Nc-antigenen zoals beschreven in Cameron et al.1. Coronavirus-antigenen zijn gekoppeld aan 10pmol/10 6 kralen (S) en 100 pmol/106 kralen (RBD en Nc). Controlekralen in combinatie met menselijk IgG of IgM worden gegenereerd zoals eerder beschreven1. IgG en IgM zijn gekoppeld aan 5 μg/106 kralen.
  2. Bepaal na de koppeling de kraalconcentraties en verdun elke bouillon tot 1 x 106 kralen/ml met behulp van beschreven procedures6.
  3. Voer bevestiging uit van antigeenkoppeling met antigeenspecifieke antilichamen van konijn of met positieve menselijke sera zoals beschreven in Cameron et al.1.
    1. Bevestig de menselijke IgG-koppeling met de gebiotinyleerde anti-humane IgG / SAPE-detectiereagentia van de test en IgM-koppeling met een fycoerythrin (PE) -gelabelde geit anti-humaan IgM.
      OPMERKING: Koppelingsbevestiging wordt uitgevoerd met behulp van een titratie van eiwitspecifiek serum of antilichaam, omdat de optimale concentratie voor deze reagentia niet bekend is. Voor serum worden seriële vouwverdunningen gebruikt, terwijl voor antilichamen die als mg/ml-voorraden worden geleverd, seriële μg/ml verdunningsreeksen worden gebruikt.
  4. Verdunde assay control (AC) kralen die de MFI-verzameling in de twee reporterkanalen bewaken tot een concentratie van 1 x 106 kralen / ml voorafgaand aan gebruik in multiplexkraalmengsels.

3. Verse multiplex kralen mix bereiding

  1. Bereid multiplex kralenmixen elke dag vers van de individuele gekoppelde kraal en controleer de kraalvoorraden op 1 x10 6 kralen / ml.
    OPMERKING: Multiplexkraalmengsels zijn bereid om 2.500 kralen te leveren voor elk kralengebied in een volume van 50 μL. Berekeningen voor het bereiden van multiplexkraalmengsels voor een willekeurig aantal reacties worden beschreven in de blog gepubliceerd door Angeloni (2020)6.

4. Monsterverdunning

  1. Bereid een verdunning van het serummonster van 1:100 door 10 μL serum te mengen in 990 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween 20, 0,02% natriumazide en 1% runderserumalbumine (BSA) (PBS-TBN-buffer).
  2. Verdun monsters opnieuw 10-voudig door 20 μL van de 1:100 verdunning toe te voegen tot 180 μL PBS-TBN.
    OPMERKING: Serummonsters bestaan uit negatieve sera, van monsters die in 2019 vóór de COVID-19-pandemie zijn verzameld, en positieve sera van SARS-CoV-2 PCR-positieve patiënten, die lage en hoge antilichaamtiters vertegenwoordigen. Positieve monsters werden verzameld tussen ≈3 tot >60 dagen vanaf het begin van de symptomen (DFSO). Alle serummonsters en IgG-gestripte negatieve controlesera worden verdund tot 1:1000 zoals hieronder beschreven. Voor neutralisatietests worden sera verdund met 1:500 zoals beschreven in de onderstaande neutralisatieprotocollen (rubrieken 6 en 8).

5. Serologisch testprotocol voor één verslaggever

  1. Voeg 50 μL multiplexkraalmix toe aan elke toegewezen put van een 96-well niet-bindende microtiterplaat.
  2. Pipetteer 50 μL van 1:1000 serum of PBS-TBN in de juiste putjes; de uiteindelijke verdunning van serum in de put is 1:2000.
  3. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  4. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  5. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
  6. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  7. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (eerste incubatiewas na het monster).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de plaatmagneet om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  8. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (tweede incubatiewas na het monster).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de plaatmagneet om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Verwijder de plaat van de magneet.
  9. Maak een verse mix van biotine-anti-humaan IgG met SAPE door het antilichaam te verdunnen tot 0,62 μg/ml en de SAPE tot 1 μg/ml. Voeg 100 μL toe aan elk put goed.
  10. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  11. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  12. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
  13. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  14. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (eerste postdetectie antilichaam incubatie wassen).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de plaatmagneet om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  15. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (tweede antilichaamincubatiewassing na detectie).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Verwijder de plaat van de magneet.
  16. Voeg 100 μL PBS-TBN toe aan elke put.
  17. Dek af met folieafdichting en schud gedurende 2 min bij 37 °C.
  18. Verwijder de plaat van de bordenchudder. Verwijder vervolgens de folieafdichting en lees 50 μL van elke put op de flow analyzer volgens de gebruikershandleiding. Hieronder volgt een korte beschrijving.
    1. Selecteer het vervolgkeuzemenu in de linkerbovenhoek van het scherm en navigeer naar Plaatconfiguratie.
    2. Selecteer Plaat uitvoeren.
    3. Selecteer het pictogram Uitwerpen om de plaatdrager uit te werpen.
    4. Plaats de plaat op de plaatdrager en selecteer het pictogram Intrekken om de plaatdrager in te trekken.
    5. Selecteer het pictogram Uitvoeren om de plaat uit te voeren.

6. Single reporter neutralization assay protocol

  1. Bereid een verse multiplex kralenmix zoals beschreven in sectie 3 hierboven.
  2. Verdun patiënt- en controle sera 1:500 als volgt.
    1. Verdun het serum 1:100 door 10 μL serum te mengen tot 990 μL PBS-TBN.
    2. Verdun het serum nog eens 5 keer door 40 μL 1:100 serum toe te voegen aan 160 μL PBS-TBN.
  3. Voeg 50 μL multiplexkraalmix toe aan elke toegewezen put van een 96-well niet-bindende microtiterplaat.
  4. Voeg 25 μL van 2 μg/ml ACE2-verdunning toe aan elke put.
  5. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 2 minuten met schudden bij 600 tpm.
  6. Verwijder de plaat van de platenschudder en verwijder de folieafdichting.
  7. Voeg 25 μL 1:500 serum of PBS-TBN toe aan de toegewezen putjes.
  8. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  9. Volg voor de rest van de testprocedure de stappen 5.4 tot en met 5.18.5 zoals hierboven beschreven.

7. Conversie naar een dubbele IgG- en IgM-serologische test

  1. Bereid antigeen-gekoppelde kralen zoals beschreven in sectie 2 hierboven.
    OPMERKING: Een extra kralenset, gekoppeld aan menselijk IgM, is inbegrepen om te controleren op de toevoeging van anti-IgM-detectiereagentia, evenals een extra AC-kralenset (220) om de verzameling van MFI voor RP2 te controleren. Alle kralenvoorraden zijn op 1 x 106 kralen / ml voor opname in multiplex kralenmixen zoals hieronder beschreven.
  2. Bereid verse multiplexkraalmengsels zoals beschreven in sectie 3 hierboven.
  3. Verdun serummonsters en IgG-gestripte negatieve controlesera 1:1000 zoals beschreven in rubriek 4 hierboven.
  4. Voeg 50 μL multiplexkraalmix toe aan elke toegewezen put van een 96-well niet-bindende microtiterplaat.
  5. Pipetteer 50 μL van 1:1000 serum of PBS-TBN naar de juiste putjes. De uiteindelijke verdunning van serum in de put is 1:2000.
  6. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  7. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  8. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
  9. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  10. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (eerste incubatiewas na het monster).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de plaatmagneet om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  11. Was de reactieputten opnieuw met PBS-TBN (tweede incubatiewas na het monster), precies zoals hierboven beschreven in stappen 7.10.1-7.10.5.
  12. Verwijder de plaat van de magneet.
  13. Maak een nieuw detectiereagensmengsel met de vereiste combinatie van reagentia en voeg 50 μL of 100 μL toe aan elke put.
    OPMERKING: Detectiereagensmengsels die de anti-humane IgG bevatten die zijn geconjugeerd aan de Brilliant Violet 421 reporterkleurstof (BV; excitatie bij 405 nm en emissie bij 421 nm) werden gebruikt bij 50 μL / put vanwege de beperkte hoeveelheden van de beschikbare voorraadreagentia. Alle andere detectiereagensmengsels worden gebruikt bij 100 μL/put.
  14. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  15. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  16. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
  17. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  18. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven met PBS-TBN (eerste wasbeurt na detectie van antilichaamincubatie).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het supernatant voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  19. Was de reactieputten opnieuw met PBS-TBN (tweede wasbeurt na detectie van antilichaamincubatie), precies zoals hierboven beschreven in stappen 7.17.1-7.17.5.
  20. Verwijder de plaat van de magneet.
  21. Voeg 100 μL PBS-TBN toe aan elke put.
  22. Dek af met folieafdichting en schud gedurende 2 min bij 37 °C.
  23. Verwijder de plaat van de bordenchudder. Verwijder vervolgens de folieafdichting en lees 50 μL van elke put op de flow analyzer zoals hierboven beschreven in stappen 5.18.1-5.18-5.

8. Conversie naar dual reporter neutralisatie assay

  1. Gebruik de gekoppelde kralen zoals beschreven in stap 7.1 hierboven.
  2. Bereid een verse multiplex kralenmix zoals beschreven in stap 7.2.
  3. Serummonsters en IgG-gestripte negatieve controlesera worden als volgt 1:500 verdund.
    1. Bereid een verdunning van 1:100 door 10 μL serum te mengen in 990 μL PBS-TBN.
    2. Verdun de 1:100 monsters nog eens 5 keer door 40 μL van de 1:100 verdunningen toe te voegen aan 160 μL PBS-TBN.
  4. Voeg 50 μL multiplexkraalmix toe aan elke toegewezen put van een 96-well niet-bindende microtiterplaat.
  5. Voeg 25 μL van 2 μg/ml ACE2-verdunning toe aan elke put.
  6. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 2 minuten met schudden bij 600 tpm.
  7. Verwijder de plaat van de platenschudder en verwijder de folieafdichting.
  8. Voeg 25 μL 1:500 serum of PBS-TBN toe aan de toegewezen putjes.
  9. Dek de plaat af met een folieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  10. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  11. Met de plaat vastgehouden op de magneet, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het bovennatuurlijk voorzichtig uit de putten.
  12. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  13. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (eerste post sample incubatie wassen).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Met de plaat vastgehouden op de magneet, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het bovennatuurlijk voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  14. Was de reactieputten opnieuw met PBS-TBN (tweede incubatiewas na het monster), precies zoals hierboven beschreven in stappen 8.13.1-8.13.5.
  15. Verwijder de plaat van de magneet.
  16. Maak een nieuw detectiereagensmengsel met de vereiste combinatie van reagentia en voeg 50 μL of 100 μL toe aan elke put.
    OPMERKING: Detectie Reagensmengsels die het anti-humane IgG bevatten dat is geconjugeerd aan de BV reporterkleurstof, werden gebruikt bij 50 μL / put vanwege de beperkte hoeveelheden van de beschikbare voorraadreagentia (zie tabel met materialen). Alle andere detectiereagensmengsels worden gebruikt bij 100 μL/put.
  17. Bedek de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeer op een verwarmde platenschudder bij 37 °C gedurende 15 minuten met schudden bij 600 tpm.
  18. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
  19. Met de plaat vastgehouden op de magneet, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het bovennatuurlijk voorzichtig uit de putten.
  20. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  21. Was de reactieputten zoals hieronder beschreven (eerst was na detectie antilichaamincubatie).
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Met de plaat vastgehouden op de magneet, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het bovennatuurlijk voorzichtig uit de putten.
    5. Dep de plaat op absorberend papier terwijl je de plaat nog steeds op de magneet houdt.
  22. Was de reactieputten opnieuw met PBS-TBN (tweede wasbeurt na detectie van antilichaamincubatie), precies zoals hierboven beschreven in stappen 8.21.1-8.21.5.
    1. Verwijder de plaat van de plaatmagneet en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elke put.
    2. Dek de plaat af met een verse folieafdichting en schud bij 37 °C gedurende 2 min bij 600 tpm.
    3. Verwijder de plaat van de platenschudder en plaats deze gedurende 2 minuten op de magnetische plaatscheider om de kralen van het reactiemengsel te scheiden.
    4. Met de plaat vastgehouden op de magneet, verwijdert u de folieafdichting, keert u de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veegt u het bovennatuurlijk voorzichtig uit de putten.
    5. Verwijder de plaat van de magneet.
  23. Voeg 100 μL PBS-TBN toe aan elke put.
  24. Dek af met folieafdichting en schud gedurende 2 min bij 37 °C.
  25. Verwijder de plaat van de bordenchudder. Verwijder vervolgens de folieafdichting en lees 50 μL van elke put op de flow analyzer zoals hierboven beschreven in stappen 5.18.1-5.18-5.

Resultaten

Optimalisatie van de Single Reporter Serological Assay.
De koppelingsstrategie voor alle SARS-CoV-2-antigenen wordt beschreven in Cameron, et al., 20201 en in stap 2.1 hierboven. De strategie voor koppelingsbevestiging wordt beschreven in stap 2.3 hierboven. Voor een efficiënte koppeling moeten de waarden van de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) aanzienlijk hoger zijn dan de negatieve controlereactie(s) zonder serum/geen antilichaam en moeten ze een dosisrespons van afnemend MFI-signaal aantonen met afnemende hoeveelheden detectiereagens. MFI's van ongeveer 1.000 MFI-eenheden of meer over achtergrond MFI duiden over het algemeen op efficiënte eiwitkoppeling en zijn afhankelijk van de concentratie en specificiteit van het gebruikte detectiereagens. Met behulp van deze methode werd de bevestiging van S-, RBD- en Nc-antigeenkoppeling getest op twee partijen kralen(figuur 2). De MFI-signalen voor alle antigenen waren significant hoger dan de MFI op de achtergrond en vertoonden een dosisrespons met titratie van de detectiereagentia. De gegevens toonden ook een goede reproduceerbaarheid van MFI-niveaus tussen de twee verschillende partijen gekoppelde kralen.

Optimalisatie van de single reporter assay werd gedaan zoals beschreven in Cameron, et al., 20201. Elk antigeen werd getest bij verschillende koppelingsconcentraties met verschillende verdunningen van verschillende serummonsters die hoge, gemiddelde, lage en negatieve monsters vertegenwoordigden. Omdat de test IgG-titers meet, werd bovendien een IgG-gestript serum gebruikt als een extra negatief monster. De resultaten van een representatieve monsterverdunningsreeks met verschillende antigeenkoppelingsniveaus zijn weergegeven in figuur 3. Deze initiële verdunningsreeks werd getest met een vaste concentratie van detectiereagentia om een potentieel bereik van representatieve antigeenspecifieke en achtergrond MFI-niveaus te krijgen. Op basis van deze gegevens werden aanvullende monsterverdunningsbereiken en antigeenkoppelingsniveaus bepaald en verder getest met aanvullende monsters (gegevens niet weergegeven).

Vervolgens werd de concentratie van het detectiereagens geoptimaliseerd voor gebruik met de verschillende serumverdunningen en antigeenkoppelingsniveaus. Representatieve gegevens met 6 positieve en 2 negatieve monsters zijn weergegeven in figuur 4. Na aanvullende tests met enkele honderden negatieve pre-COVID-19 serummonsters werden de uiteindelijke optimale antigeenkoppelingsniveaus en detectieconcentraties geselecteerd voor het definitieve testprotocol, zoals beschreven in rubriek 5.

Conversie naar één neutralisatietest voor verslaggevers
Conversie van de serologische test van de enkele reporter naar een neutralisatietest werd bereikt door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 (als een concurrerend reagens) met de kralen voorafgaand aan het toevoegen van het serummonster. Door de toegevoegde hoeveelheid ACE2 te titreren, werd remming van IgG-binding aan de S- en RBD-antigenen waargenomen, zoals weergegeven in figuur 5. Hoewel de sera van 11 patiënten verschillende titers van IgG hadden, vertoonden ze elk een significante afname van het MFI-signaal met een toenemende ACE2-concentratie. Zoals verwacht heeft ACE2 alleen invloed op de MFI-signalen van S en RBD, maar niet op het Nc-antigeen.

Het percentage resterende MFI-signaal ten opzichte van 0 μg/ml ACE2 voor alle monsters is weergegeven in figuur 6. Voor de meeste monsters werd een signaalverlies >30% waargenomen voor S en RBD met toenemende ACE2-concentratie. Zoals verwacht was er geen effect van ACE2 op het Nc-signaal.

Conversie naar een dual reporter IgG en IgM serologische assay
Voor de dual reporter IgG en IgM assay werden de standaard single reporter assay condities gebruikt om verschillende antilichaam- en reportercombinaties voor de twee reporter kanalen te testen. Het RP1-kanaal is vergelijkbaar met eerdere stroomanalyse-instrumenten met detectie van "oranje" fluorescentie voor reporterkleurstoffen zoals PE. Het tweede kanaal, RP2, maakt gebruik van een violette excitatielaser die kan worden gebruikt voor het detecteren van de "blauwe" fluorescentie van kleurstoffen die worden geëxciteerd bij 402 nm met emissiespectrapieken in het bereik van 421-441 nm.

Verschillende anti-humane IgG- en IgM-antilichaamcombinaties werden getest in verschillende concentraties met de standaard 2.000-voudige monsterverdunnings- en incubatieomstandigheden zoals beschreven in sectie 6. Een eerste test van anti-IgM geconjugeerd aan de DyLight 405 reporterkleurstof (DL 405; excitatie bij 400 nm en emissie bij 420 nm) voor het RP2-kanaal werd uitgevoerd met behulp van een set van 11 PCR-positieve monsters met DFSO variërend van 5 tot >60 dagen, en een IgG-gestript serummonster. Dit detectiereagens produceerde geen hoog signaal in het RP2-kanaal zoals weergegeven in figuur 7A, B, C. Voor monsters met de hoge IgM RP2 MFI werden de hoogste signalen gezien voor RBD en Nc(Figuur 7B,C). Hoewel IgM-titers op dit moment in sommige monsters verhoogd moeten zijn, waren de waargenomen MFI-niveaus niet hoger dan 140 MFI-eenheden met het IgM-detectiereagens. Bovendien ontbrak het de controlekraal voor IgM aan een significant dynamisch bereik voor MFI bij gebruik van DL 405 geconjugeerd aan anti-IgM in vergelijking met een PE-gelabelde anti-IgM RP1-reporter die bij dezelfde concentraties werd gebruikt(figuur 7D).

Omdat er geen geschikt detectiereagens met RP2-reporterlabel voor IgM beschikbaar was, werd het oorspronkelijke biotine anti-IgG met SASB getest voor gebruik in het RP2-kanaal. Het signaal voor IgG in het RP2-kanaal met SASB had niet hetzelfde dynamische bereik als met SAPE, maar het had nog steeds een geschikt bereik voor het meten van IgG-titers voor S, RBD en Nc(Figuur 8). Deze gegevens leidden tot het testen van verschillende RP1 IgM- en RP2 IgG-detectiereagenscombinaties, zoals hieronder beschreven.

Conversie naar dual reporter neutralisatie assay
De serologische test met dubbele reporter werd omgezet in een neutralisatietest door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 en kralen, voorafgaand aan het toevoegen van het serummonster. Een 2-voudige verdunningsreeks ace2 vanaf 16 μg/ml werd gebruikt en vervolgens getest met sets van 11 monsters en gestripte sera zoals hierboven beschreven. Daarnaast werden 3 verschillende combinaties van RP1 IgM en RP2 IgG detectie antilichaam mixen getest op een set van 11 monsters en gestripte serum controles. De uiteindelijke combinaties en reagensconcentraties die optimaal zijn, zijn vermeld in tabel 1.

Voor IgG-detectie werd de biotine anti-humane IgG / SASB die werd gebruikt in de oorspronkelijke single reporter-test getest samen met een andere anti-IgG geconjugeerd aan de BV reporter-kleurstof. Terwijl de BV-conjugaat hoge RP2 MFI-signalen had, varieerde de MFI-signaalintensiteit voor IgG-titer over de ACE2-titraties(Figuur 9A,C, E). De biotine anti-humaan IgG/SASB-combinatie had een consistentere MFI-signaalafname over de ACE2-titratie in vergelijking met het BV-conjugaat, wat een dosisrespons aantoont, hoewel de MFI-niveaus lager waren. De signaalfluctuatie door de BV-conjugaat over ACE2-concentraties interfereerde ook met het bepalen van de procentuele remming door ACE2 over het bereik van IgG-titers in vergelijking met de biotine anti-humane IgG / SASB-combinatie (Figuur 9B,D, F). Monsters met lage MFI-signalen, zoals het DFSO 3-monster, hebben geen titers die hoog genoeg zijn om de prestaties van deze reagentia te evalueren of de IgG-neutraliserende capaciteit te meten.

Voor het bepalen van IgM-titers in het RP1-kanaal werd een PE-geconjugeerde anti-IgM vergeleken met een anti-humaan IgM geconjugeerd aan de DyLight 549 reporterkleurstof (DL 549; excitatie bij 562 nm en emissie bij 576 nm) bij de concentraties vermeld in tabel 1. Van deze twee reagentia vertoonde de PE anti-IgM hogere MFI's dan die gegenereerd door DL 549 anti-humaan IgM voor de geteste monsters(Figuur 9A,C, E). De IgM-controlekraal die de toevoeging van deze reagentia meet, had verschillende gemiddelde MFI's van ≈ 17.000 voor de PE-anti-IgM en 2.723 voor de DL 549-conjugaat. Zelfs met deze verschillen was de impact van de verschillende ACE2-concentraties op MFI meetbaar met het DL 549-conjugaat. Voor het bepalen van ACE2 procent remming van IgM binding was er een klein maar onbeduidend verschil tussen de twee IgM detectiereagentia(Figuur 9B,D,F).

CombinatieVerslaggeverEindconcentratie in put (μg/ml)
RP1RP2
1PE anti-IgM2-
Biotine-Ig-0.62
Sasb-4
2DyLight 549 Anti-Human IgM1-
Briljant Violet 421 Anti-Human IgG-1
3DyLight 549 Anti-Human IgM1-
Biotine-Ig-0.62
Sasb-4

Tabel 1: Lijst van geteste RP1- en RP2-reporterkleurstofcombinaties. Verschillende RP1- en RP2-reporterkleurstoffen werden geëvalueerd voor het meten van IgG- en IgM-titers. De drie hierboven getoonde combinaties werden getest bij verschillende RP1-detectiemodi en voor optimalisatie van de neutralisatietest. Voor RP2-combinaties met SASB worden concentraties voor het gebiotinyleerde detectieantilichaam en SASB weergegeven. *Eindconcentratie vertegenwoordigt de uiteindelijke concentratie in de reactieput.

figure-results-1
Figuur 1: Stroomdiagram met de belangrijkste stappen van het testprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bevestiging van de antigeenkoppeling. Antigenen werden gekoppeld aan 100, 10 en 1 pmol/106 kralen. Voor S- en RBD-antigenen werd konijn-anti-S-sera gebruikt en gedetecteerd met PE-anti-konijn IgG. Voor Nc werd een Eiwit G-gezuiverd konijn polyklonaal anti-Nc gebruikt. De titratiecurven voor kralen in combinatie met 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) en 100 pmol Nc (C) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Optimalisatie van serumverdunning met verschillende antigeenkoppelingsniveaus. Serummonsters die hoge, gemiddelde, lage en negatieve monsters vertegenwoordigden, werden getest met de verschillende pmolantigeen/10 6-kraalkoppelingen. Een 4-voudige serumtitratie werd getest met een multiplexmengsel van antigeen-gekoppelde kralen met behulp van het testprotocol beschreven in rubriek 5. De MFI-waarden van de titratiecurven voor S (A), RBD (B) en Nc (C) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Bepaling van de optimale serumverdunning en detectie van de reagensconcentratie. Acht serummonsters, waaronder negatieve patiënten (2 monsters) en laag- tot hoog-positief (6 monsters), werden getest op aanvullende serumverdunningen met drie verschillende detectiereagensconcentraties. De MFI-resultaten worden weergegeven voor S (A), RBD (B) en Nc (C). Op basis van deze en andere gegevens (niet getoond) werd een monsterverdunning van 1:2.000 en een biotinedetectieantilichaamconcentratie van 0,62 μg/ml geselecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Optimalisatie van single reporter neutralization assay. Modificatie van de serologische test van de enkele reporter naar een neutraliserende antilichaamdetectietest werd uitgevoerd door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 als concurrent, zoals beschreven in sectie 6. Een set van 11 monsters, variërend van laag- tot hoog-positieve titersera, en een IgG-gestreept serummonster werden getest met een tweevoudige verdunningsreeks ace2 vanaf 4 μg / ml, met behulp van standaard testomstandigheden. Over dit bereik van ACE2-concentraties kan een afname van MFI worden gezien bij verhoogde ACE2 voor S (A) en RBD (B), maar niet voor Nc (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Procentuele remming van het signaal met ACE2. Het percentage restsignalen voor de set van 11 monsters (uit figuur 4)wordt getoond. Voor elk monster, ongeacht de IgG-titer, werd een maximale afname van ≥30% MFI-signaal bereikt voor S (A) en RBD (B) bij de hoogste ACE2-concentratie. Voor het Nc-antigeen (C) was er geen significante remming van het signaal met enige hoeveelheid ACE2 getest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Test van DyLight 405 anti-IgM als RP2 IgM detectiereagens. Een set van 11 monsters en IgG-gestripte sera werden gebruikt om DL 405-geconjugeerde anti-IgM te testen als een RP2-detectiereagens. De RP2 IgM MFI-signalen voor S(A),RBD(B)en Nc(C)worden weergegeven. Het hoogste MFI-signaal voor elk antigeen met een monster was ongeveer 140 MFI-eenheden voor RBD met monster H (B). Zelfs het signaal op de IgM-controleparelset was minder dan 1.000 MFI in het RP2-kanaal over het hele antilichaamtiterbereik en vertoonde niet het verhoogde dynamische bereik dat werd waargenomen met het PE-anti-IgM-detectieantilichaam in het RP1-kanaal(D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Optimalisatie van SASB als RP2 reporter met Biotine anti-IgG. Een set van 11 monsters en IgG-gestripte sera werden gebruikt om een verdunningsreeks SASB te testen met de standaard 0,62 μg / ml biotine anti-IgG. De resulterende IgG MFI's in het RP2-kanaal voor S (A), RBD (B) en Nc (C) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Vergelijking van drie verschillende combinaties van RP1 IgM en RP1 IgG detectiemixen. Drie verschillende detectie antilichaammengsels werden getest op 11 monsters en IgG-gestripte sera. De gebruikte combinaties en eindconcentraties zijn beschreven in tabel 1. Alle monsters werden getest met een 2-voudige ACE2-verdunning, beginnend bij 16 μg / ml. Gegevens voor monsters bij DFSO van 3, 12 en 30 dagen worden getoond. De MFI-signalen voor RP1 IgM (oranje) en RP2 IgG (blauw) worden weergegeven in A (DFSO 3), C (DFSO 12) en E (DFSO 30). De resterende ACE2 procent MFI's worden weergegeven in B (DFSO 3), D (DFSO 12) en F (DFSO 30). Signalen die een daling van >30% vertegenwoordigen in vergelijking met geen ACE2-besturingselementen worden lichtgroen gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze studie breidde de functionaliteit uit van een multiplex fluorescerende microsfeertest, 3Flex, die kwalitatief de IgG-respons op infectie door SARS-CoV-2beoordeelt 1. Hoewel veel serologische testen voor COVID-19 een enkel antigeen detecteren, evalueert deze test tegelijkertijd S-, RBD- en Nc-antigenen en bevat een interne antilichaamisotypecontrole7. Daarnaast wordt ACE2 gebruikt als indicator om neutraliserende antilichaamtiters tegen SARS-CoV-2 te detecteren.

Multi-antigeentests kunnen in de toekomst bijzonder nuttig zijn voor het onderscheiden van immuunresponsen tussen geïnfecteerde en gevaccineerde personen. Met SARS-CoV-2, als alleen S- en RBD-antilichamen worden geëvalueerd, zou het onmogelijk zijn om te onderscheiden of dit te wijten was aan een eerdere infectie of aan een vaccinatie-antilichaamrespons. Geen van de vaccins die momenteel in gebruik zijn, is gericht op het Nc-antigeen, dus door S / RBD- en Nc-antigenen te evalueren, is het mogelijk om eerdere virale infectie (Nc- en S / RBD-positief) te onderscheiden van een vaccinatierespons (alleen S / RBD-positief; Nc-negatief).

In de huidige studie werden de 3Flex serologische en neutralisatie assays (secties 5 en 6) overgebracht naar een nieuw dual reporter flow analyse-instrument (secties 7 en 8). Typische immunoassayprotocollen voor op kralen gebaseerde multiplextests zijn vergelijkbaar met standaard ELISA-protocollen, volgens vergelijkbare stappen voor monsterincubatie, detectie van antilichaam / reporter-incubatie en analyse van resultaten8. Eerdere studies hebben ook aangetoond hoe standaard ELISA-assays kunnen worden overgebracht naar een op kralen gebaseerd multiplexingplatform9.

De testprotocollen konden naadloos worden overgezet van het vorige single reporter-instrument naar het nieuwe dual reporter-systeem, zoals blijkt uit de resultaten die zijn verkregen voor de testmonsters en -controles(figuur 4 en figuur 5). In de serologische test vertoonden alle positieve serummonsters een karakteristieke dosisresponsieve afname van het signaal die overeenkomt met zowel een hogere monsterverdunning als een lagere detectieantilichaamconcentratie, terwijl de signalen voor de negatieve monsters op achtergrondniveaus bleven. Evenzo kwamen voor de neutralisatietest afnemende signalen voor S en RBD, maar niet voor Nc, overeen met toenemende concentraties van de ACE2-concurrent, terwijl het IgG-gestripte serum veel minder werd beïnvloed door de toevoeging van ACE2. Het vooraf incuberen van de kralen met ACE2 gedurende 2 minuten voorafgaand aan de toevoeging van het serummonster (zoals beschreven in rubrieken 6 en 8), werd ook vergeleken met het tegelijkertijd combineren van de kralen met ACE2 en serum en produceerde weinig verschil in de resultaten (gegevens niet getoond). Omdat de resultaten verkregen met de kralen plus ACE2 pre-incubatiestap echter consistenter waren, was dit de definitieve procedure die werd gevolgd voor het neutralisatietestprotocol (secties 6 en 8).

Omdat het dual reporter-systeem een tweede fluorescerend reporterkanaal bevat, werden beide assays omgezet in isotyping-assays om tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-responsen te meten. De dual reporter-functionaliteit van de flow analyzer maakt het mogelijk om fluorescerende signalen te verzamelen van twee reporterdetectiereagentia voor elke analyt in de multiplex voor elk monster, waardoor de gegevens die per monster in een test worden gegenereerd, effectief worden verdubbeld. Voor de ontwikkeling en optimalisatie van de dual reporter assay protocollen werden verschillende commercieel beschikbare reporter kleurstoffen en detectie antilichamen geëvalueerd voor het nieuwe RP2 kanaal (Figuur 7 en Figuur 8) om de beste beschikbare optie(s) te bepalen. Het anti-IgM-antilichaam geconjugeerd met de DL 405 reporterkleurstof presteerde niet goed in het RP2-kanaal(figuur 7),dus biotine anti-IgG met SASB werd vervolgens geëvalueerd voor detectie in het RP2-kanaal(figuur 8). Drie combinaties van RP1- en RP2-detectiereagentia werden vergeleken in de dual reporter neutralisatietest (tabel 1 en figuur 9) om de best presterende combinaties te bepalen voor gelijktijdige detectie van IgG- en IgM-neutraliserende antilichamen. Hoewel er significante verschillen waren in de signaalintensiteit tussen het RP1-kanaal met PE-anti IgM en het RP2-kanaal met DL 549 anti-IgM, was er geen significant verschil in de meting van de procentuele bindingsremming door ACE2.

Verschillende beperkingen van de huidige methode en deze studie worden erkend. Ten eerste waren de monsters die werden getest en gebruikt bij de ontwikkeling en optimalisatie van de methode beperkt tot sets van 8-11 monsters. Meer monsters zullen worden getest in uitgebreide studies om te controleren of de methode volledig is geoptimaliseerd. Ten tweede werd een beperkt aantal reporter fluoroforen en reporterparen getest. Verder testen van alle beschikbare melders in alle mogelijke combinaties zal bepalen welke reagentia met succes kunnen worden gebruikt in deze methode. Het anti-IgG-antilichaam geconjugeerd aan biotine was anders dan het anti-IgG-antilichaam geconjugeerd aan de BV 421-verslaggever. Dus, hoewel variabiliteit in de signaalintensiteit voor de BV 421 anti-IgG bestond, kan dit te wijten zijn aan de specificiteit van het antilichaam en niet gerelateerd aan de reporterkleurstof. Het testen van andere beschikbare BV 421-geconjugeerde antilichamen kan een ander antilichaam identificeren dat goed zou presteren in het RP2-kanaal. Toekomstige studies zullen ook de combinatie van PE anti-IgM met BV 421 anti-humaan IgG evalueren voor detectie in respectievelijk RP1 en RP2. Ten slotte zijn assays, zelfs met de dual reporter-capaciteit van het instrument, beperkt tot twee isotypen (twee parameters) per reactie. Als extra isotypen moeten worden gemeten of volledige isotypering gewenst is, moeten extra reacties met dezelfde twee reporterkanalen in afzonderlijke putten worden uitgevoerd.

Op kralen gebaseerde multiplexingtechnologie maakt een snel en flexibel testontwerp mogelijk met eenvoudige implementatie in routinematige laboratoriumworkflows3,4,10. Deze studie toonde het gemak aan bij het overbrengen van de eerder beschreven 3Flex serologische en neutralisatietests voor SARS-CoV-2 naar een stroomanalysesysteem voor het meten van IgG met een enkele reporter, of met lichte modificatie, waarbij tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-responsen worden gemeten met behulp van twee reporters. De dual reporter-optie heeft duidelijke voordelen ten opzichte van single reporter-platforms omdat het twee keer zoveel gegevens per monster kan leveren, met behulp van de helft van het steekproefvolume en in de helft van het aantal reactieputten. Met de juiste reporterkleurstoffen en detectieantistoffen kunnen isotyping-assays eenvoudig worden ontwikkeld en uitgevoerd op het dual reporter flow analysis-instrument.

Openbaarmakingen

Stephen Angeloni en Sherry Dunbar zijn werknemers van Luminex Corporation dat enkele van de reagentia en instrumenten produceert die in deze studie werden gebruikt. Open Access publicatie van dit artikel werd gesponsord door Luminex Corporation

Dankbetuigingen

Dit rapport werd gefinancierd door Luminex Corporation (Austin, TX). De auteurs bedanken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) voor wetenschappelijke redactiehulp.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACE2 (human) (rec.)AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ-fragment specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
Bovine Serum AlbumineMilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicatorVarious
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, NonsterileCorning6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ-fragment specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab’)2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 ConjugateThermoFisher Scientific62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate ShakerThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PEThermoFisher ScientificP-2771MP
Luminex Magnetic Plate SeparatorLuminex CorporationCN-0269-01
MagPlex beadsLuminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab’)2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
Phosphate Buffered SalineMilliporeSigmaP3813Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56683Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56049Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56047Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56048Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAbSinoBiological40150-R007
Sodium AzideMilliporeSigmaS2002Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)ThermoFisher ScientificS21388premium grade
Tube Revolver/ RotatorThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng KitLuminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO

Referenties

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplex bead assayIgG IgM detectieflowcytometriedual reporter assayspike prote ne antilichaamACE2 receptorbindingnucleocapside antigeenserologisch onderzoekantilichaaminhibitie

Gerelateerde artikelen