Methodenartikel

Moleculaire veerconstante analyse door biomembrane force probe spectroscopie

DOI:

10.3791/62490

⸱

20 november 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een biomembrane force probe (BFP) is een in situ dynamic force spectroscopy (DFS) techniek. BFP kan worden gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol presenteert veerconstante analyse voor moleculaire bindingen gedetecteerd door BFP.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een biomembrane force probe (BFP) is onlangs naar voren gekomen als een native-cell-surface of in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool die single-molecular binding kinetics kan meten, mechanische eigenschappen van ligand-receptor interacties kan beoordelen, eiwitdynamische conformatieveranderingen kan visualiseren en receptor gemedieerde celmechanosensingmechanismen spannender kan ophelderen. Meer recent is BFP gebruikt om de veerconstante van moleculaire bindingen te meten. Dit protocol beschrijft de stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van moleculaire veerconstante DFS-analyse. Specifiek worden twee BFP-werkingsmodi besproken, namelijk de Bead-Cell- en Bead-Bead-modi. Dit protocol richt zich op het afleiden van veerconstanten van de moleculaire binding en cel uit DFS-ruwe gegevens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een live-cell DFS-techniek ontwikkelt BFP een menselijke rode bloedcel (RBC; Figuur 1) in een ultragevoelige en afstembare krachtopnemer met een compatibel veerconstantebereik bij 0,1-3 pN/nm1,2,3. Om ligand-receptorinteractie te onderzoeken, maakt BFP DFS-metingen mogelijk bij ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) en ~ 0,5 ms (10-3 s) in kracht, ruimtelijke en temporele resolutie4,5. De experimentele configuratie bestaat uit twee tegengestelde micropipettes, namelijk de Probe en het doelwit. De Probe micropipette aspirateert een RBC en een kraal wordt aan de top gelijmd via een biotine-streptavidin interactie. De kraal is bedekt met het ligand van belang (figuur 1A). De doelmicropipette aspirateert een cel of een kraal met de receptor van belang, overeenkomend met de modi Bead-Cell (Figuur 1B) en Bead-Bead (Figuur 1C) respectievelijk5.

BFP constructie, assemblage en de DFS experimentele protocollen werden eerder in detail beschreven1,6. In het kort bestaat een BFP-aanraakcyclus uit 5 fasen: Approach, Impinge, Contact, Retract en Dissociate(Figuur 1D). De horizontale RBC-toppositie wordt aangeduid als ΔxRBC. In het begin is de onbelaste (nulkracht) RBC-vervorming ΔxRBC 0 (tabel 1). Het doel wordt vervolgens aangedreven door een piëzotranslator om de sondekraal te impeneren en terug te trekken(figuur 1D). De RBC-sonde wordt eerst gecomprimeerd door het doel met negatieve RBC-vervorming ΔxRBC < 0. In een Bond-gebeurtenis gaat de Retract-fase over van een druk- naar een trekfase met positieve RBC-vervorming ΔxRBC > 0 (figuur 2C en D). Volgens de wet van Hooke kan de BFP-draagkracht worden gemeten als F = kRBC × ΔxRBC, waarbij kRBC ( tabel1) de RBC-veerconstante van de BFP is. Na het scheuren van de binding en het voltooien van de one-touch cyclus, keert de sondekraal terug naar de nulkrachtpositie met ΔxRBC = 0 (Figuur 1D).

Om de kRBCte bepalen, meten en registreren we de radii van de binnenste opening van de sondemicropipette (Rp), de RBC (R0) en het cirkelvormige contactgebied (Rc) tussen de RBC en de sondekraal ( Figuur1A). Vervolgens wordt kRBC berekend volgens het model van Evan (Eq. 1)7,8 met behulp van een LabVIEW-programma dat fungeert als een virtueel instrument (VI) om de BFP te bedienen (Figuur S1A)8,9.

figure-introduction-1 (Eq. 1)

Met een BFP vastgesteld en DFS ruwe gegevens verkregen, presenteren we hierbij hoe de veerconstante van ligand-receptorpaar of cellen te analyseren. De DFS ruwe gegevens over de interactie van het geglycosyleerde eiwit Thy-1 en K562 celdragende integrine α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuren 3A en 3B)10 en die van fibrinogeen en met kralen bekleed integrine αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figuur 3C) 11,12 zijn gebruikt om respectievelijk de Bead-Cell en Bead-Bead analysemodi te demonstreren.

BFP Experimentele Voorbereiding
Voor meer informatie over de experimentele voorbereiding en instrumentatie van BFP verwijzen wij u naar de eerder gepubliceerde protocollen3. Kortom, humane RBC is gebiotinyleerd met behulp van de Biotine-PEG3500-NHS in de koolstof / bicarbonaatbuffer. Interessante eiwitten zijn covalent gekoppeld aan de borosilicaatglasparels met behulp van MAL-PEG3500-NHS in de fosfaatbuffer. Om zich aan de gebiotinyleerde RBC te hechten, wordt de sondekraal ook bedekt met streptavidin (SA) met behulp van de MAL-SA. Zie de tabel met materialen en tabel 2.

Om de BFP te assembleren(figuur 1, links),zal de derde micropipette met de term 'Helper' worden gebruikt om de sondekraal af te leveren en te lijmen op de top1,3vande RBC. De covalente interactie tussen de SA-gecoate sondekraal en gebiotinyleerde RBC is veel sterker dan de ligand-receptorbinding van belang. Het dissociate stadium kan dus worden geïnterpreteerd als de ligand-receptorbindingsruptuur in plaats van de loslating van probekraal van de RBC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analyseerbare DFS-gebeurtenissen verkrijgen

  1. Start het experiment in de software (bijv. LabVIEW VI) voor de BFP-besturing en parameterinstelling(Figuur S1A).
  2. Observeer de repetitieve sonde kraal-target kraal / cel aanrakingen in de software voor BFP Monitor(Figuur S1B).
  3. Test en bereik de adhesiefrequentie ≤ 20% binnen de eerste 50 aanrakingen door de impingementkracht en contacttijd af te stemmen, waardoor het ervoor zorgt dat ≥ 89% van de DFS-adhesiegebeurtenis wordt gemedieerd door enkele bindingen12,13,14.
    OPMERKING: Voor elk Bead-Cell/Bead-paar voeren we 200 repetitieve aanraakcycli uit. Om publiceerbare gegevenskwaliteit te verkrijgen, voeren we meestal n ≥ 3 Bead-Bead- of Bead-Cell-paren uit.
    1. Sla gegevens op, in de vorm van Force vs. Time, in de door de gebruiker gerichte map aan het einde van elk paar, gevraagd door de software voor BFP-besturing en parameterinstelling.
  4. Verzamel de Force vs. Time ruwe gegevens van Bond-gebeurtenissen, zoals geïllustreerd in figuur 2A,met behulp van het BFP-acquisitieplatform(figuur S1C).
    1. Open de BFP-software voor gegevensanalyse. Klik op het gele mappictogram en selecteer het bijbehorende onbewerkte gegevensbestand door erop te dubbelklikken.
  5. Voer het programma uit en klik vervolgens op de knop Omhoog en Omlaag om tussen gebeurtenissen te schakelen. Gebruik de uitsluitingscriteria voor uitschieters (Figuur S2) om ongeldige gebeurtenissen af te schermen. Selecteer het exporterende gegevenstype als Force vs. Time-indeling en klik op de knop Plotgegevens exporteren.

2. Converteer de kracht versus tijdcurve naar de kracht versus verplaatsingscurve

  1. Exporteer het gegevenssegment dat overeenkomt met de fase Intrekken naar een spreadsheet(Afbeelding 2A, vierkant selectiekader), dat relevant is voor de analyse van de veerconstante.
  2. Plot de Force vs. Time Curve met behulp van spreadsheetsoftware. Om de curve Kracht versus verplaatsing te verkrijgen, converteert u de tijdwaarden(Figuur 2A, x-as) naar de totale verplaatsingswaarden (Δxtot ) door tijdwaardentevermenigvuldigen met piëzo-bewegingssnelheid (d.w.z. 4.000 nm/s per preset).
  3. Nul het eerste gegevenspunt door de kleinste verplaatsingswaarde af te trekken van elke verkregen verplaatsingswaarde. Deze horizontale transformatie heeft geen invloed op de oplopende hellingen van de Retract-fase of de daaropvolgende veerconstanteberekening.
  4. Met name wordt de BFP beschouwd als een serieel veersysteem waarin Δxtot ( tabel1) vervormingen van de RBC, ΔxRBC ( tabel1), de moleculaire binding, Δxmol ( tabel1) en de doelcel, Δxcel ( tabel1), als de Eq. 2:
    figure-protocol-1 (Eq. 2)
  5. Plot de curve Kracht (F) vs. Verplaatsing (Δxtot) zoals weergegeven in figuur 2B.

3. Spring Cnstant Analyse van Kraal-Cell Mode

  1. In de kracht versus verplaatsingscurve kunnen twee verschillende slop worden geïdentificeerd, waarbij elk de drukfase en de trekfase kan vertegenwoordigen. Plaats een regressielijn op elke gegevensgroep (figuur 2B), waarbij de grotere lineaire helling de totale veerconstante in de drukfase vertegenwoordigt (figuur 2B, rood), aangeduid als k1 (tabel 1); en de kleinere lineaire helling vertegenwoordigt de totale veerconstante in de tensliele fase (figuur 2B, blauw), gegaan als k2 (tabel 1).
  2. Voor veren die in serie zijn verbonden volgens stap 2.2 beschrijving, de reciproke van de totale veerconstante, ktot (tabel 1), uitdrukken als de som van de veerconstante inverses van RBC, kRBC (tabel 1), de moleculaire binding, kmol (tabel 1) en de doelcel, kcel (tabel 1). Tijdens de compressiefase van de Bead-Cell-modus wordt de moleculaire binding niet uitgerekt, daarom wordt kmol niet in aanmerking genomen. De reciproke van de ktot in dit scenario (1/k1) wordt uitgedrukt als
    figure-protocol-2 (Eq. 3).
    In de voorbeeldgegevens is kRBC vooraf bepaald (standaard 0,25 pN/nm). k-cel kan worden afgeleid van het Eq. 3 met de verworven k1 en kRBC ( figuur3B).
  3. Tijdens de trekfase wordt adhesie gevormd tussen het ligand-receptorpaar. Druk de reciproke van de ktot in dit scenario (1/k2) uit als
    figure-protocol-3 (Eq. 4)
    waarbij k2 (tabel 1) de totale veerconstante tijdens de trekfase weergeeft.
  4. Leid kmol af van het aftrekken van 1/k1 van 1/k2 (vergelijk Eq. 3 vs. Eq. 4).

4. Veer constante analyse van kraal-kraal modus

  1. Plaats een regressielijn op de compressiefasegegevens om k1 te verkrijgen (vergelijkbaar met figuur 2B, rood). Let op, in de Bead-Bead-modus wordt de doelcel vervangen door een glazen kraal bedekt met de receptor van belang(Figuur 1C). Aangezien de vervorming van de kralen verwaarloosbaar is, kan decelterm 1/kdienovereenkomstig uit de Eq. 3 en Eq. 4 worden verwijderd. De reciproke k tot van de drukfase (1/k1) kan worden uitgedrukt als:
    figure-protocol-4 (Eq. 5)
  2. Plaats een regressielijn op de trekfasegegevens om k2 te verkrijgen (vergelijkbaar met figuur 2B, blauw). De reciproke k tot van de trekfase (1/k2) kan worden uitgedrukt als:
    figure-protocol-5 (Eq. 6)
  3. Leid kmol af van het aftrekken van 1/k1 van 1/k2 (vergelijk Eq. 5 vs. Eq. 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk hebben we het protocol van de BFP veerconstante analyse gedemonstreerd. Voor de Bead-Cell-analysemodus analyseerden we de kmol van de moleculaire binding tussen het geglycosyleerde eiwit Thy-1 gecoat op de Probe-kraal en het integrine-α5β1 uitgedrukt op de Target K562-cel (Thy-1-integrine α5β1; Figuur 3A) 10. Dek-cel is ook afgeleid van de Bead-Cell-modus (K562-cel;

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samenvattend hebben we een gedetailleerd data-analyseprotocol geleverd voor het voorbewerken van de DFS-ruwe gegevens en het afleiden van moleculaire veerconstanten in de BFP Bead-Bead en Bead-Cell analysemodi. Biomechanische modellen en vergelijkingen die nodig zijn voor het bepalen van moleculaire en cellulaire veerconstanten worden gepresenteerd. Hoewel verschillende integrinen worden bestudeerd, heeft de kmol gemeten door de Bead-Bead-modus en de Bead-Cell-modus significante bereiksverschillen ( F...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen te melden hebben met betrekking tot de huidige studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Guillaume Troadec voor de nuttige discussie, Zihao Wang voor hardwareconsultatie en Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning en Simon Ringer voor ondersteuning van onze labstart-up. Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), en The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju is een Decra fellow van de Australian Research Council (DE190100609).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)Uct, Specialties, llc4420-74-0Functionalisering van glazen bolletjes
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Bereiding van fosfaatbuffer
BFP data acquisition VILabVIEWBFP controle en parameterinstelling
BFP data analysis VILabVIEWBFP grondgegevensanalyse
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC biotinylering
Borosilicate Glass beadsDistrilab Particle Technology, Netherlands9002Functionalisering van glazen bolletjes
Bovine serum albuminSigma-AldrichA0336Ligand functionalisering
Camera VILabVIEWBFP monitoring
D-glucoseSigma-AldrichG7021Bereiding van Tyrode’s buffer
HepesSigma-AldrichH3375Bereiding van Tyrode’s buffer
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Functionalisering van glazen bolletjes
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Bereiding van Tyrode’s buffer
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Bereiding van koolzuur/bicarbonaatbuffer; bereiding van Tyrode’s buffer
Sodium Carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Bereiding van koolzuur/bicarbonaatbuffer
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Bereiding van Tyrode’s buffer
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O)Sigma-AldrichS9638Bereiding van fosfaatbuffer
Streptavidin-MaleimideSigma-AldrichS9415Functionalisering van glazen bolletjes

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

Gerelateerde artikelen