Methodenartikel

Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

DOI:

10.3791/62492

⸱

10 juli 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micropatterning is een gevestigde techniek in de celbiologiegemeenschap die wordt gebruikt om verbanden tussen de morfologie en de functie van cellulaire compartimenten te bestuderen en tegelijkertijd complicaties als gevolg van natuurlijke cel-tot-celvariaties te omzeilen. Om de celvorm te standaardiseren, worden cellen ofwel opgesloten in 3D-mallen of gecontroleerd voor lijmgeometrie via kleefeilanden. Traditionele micropatterningtechnieken op basis van fotolithografie en diepe UV-etsen zijn echter sterk afhankelijk van cleanrooms of gespecialiseerde apparatuur. Hier presenteren we een infrarood laser assisted micropatterning techniek (microphotopatterning) aangepast van Doyle et al. die gemakkelijk kan worden opgezet met commercieel beschikbare beeldvormingssystemen. In dit protocol gebruiken we een Nikon A1R MP+ beeldvormingssysteem om micropatterns met micronprecisie te genereren via een infrarood (IR) laser die vooraf ingestelde gebieden op poly-vinyl alcohol gecoate coverslips in brand slaagt. We gebruiken een aangepast script om geautomatiseerde patroonfabricage met hoge efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk te maken in systemen die niet zijn uitgerust met een hardware autofocus. We laten zien dat dit IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol resulteert in gedefinieerde patronen waaraan cellen zich uitsluitend hechten en de gewenste vorm aannemen. Bovendien kunnen gegevens van een groot aantal cellen worden gemiddeld vanwege de standaardisatie van de celvorm. Patronen gegenereerd met dit protocol, gecombineerd met hoge resolutie beeldvorming en kwantitatieve analyse, kunnen worden gebruikt voor schermen met een relatief hoge doorvoersnelheid om moleculaire spelers te identificeren die de link tussen vorm en functie bemiddelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celvorm is een belangrijke determinant van fundamentele biologische processen zoals weefselmorfogenese1, celmigratie2, celproliferatie3en genexpressie4. Veranderingen in celvorm worden gedreven door een ingewikkelde balans tussen dynamische herschikkingen van het cytoskelet dat het plasmamembraan vervormt en extrinsieke factoren zoals externe krachten die op de cel worden uitgeoefend en de geometrie van celcel- en celmatrixadhesie5. Migrerende mesenchymale cellen polymeriseren bijvoorbeeld een dicht actinenetwerk aan de voorrand dat het plasmamembraan naar voren duwt en een brede lamellipodia6creëert , terwijl actomyosinecontractiliteit de smalle achterrand van de cel intrekt om de cel los te maken van zijn huidige positie7,8. Verstoren van signaleringsgebeurtenissen die aanleiding geven tot dergelijke gespecialiseerde cytoskeletstructuren verstoren vorm en polariteit en vertragen celmigratie9. Bovendien vereist epitheelbladbuiging tijdens gastrulatie op actomyosine gebaseerde apicale vernauwing die ervoor zorgt dat cellen en hun buren wigvormig worden10. Hoewel deze studies het belang van celvorm benadrukken, heeft de inherente heterogeniteit in celvorm de inspanningen bezwaard om mechanismen te identificeren die morfologie verbinden met functie.

Hiertoe zijn in de afgelopen drie decennia talrijke benaderingen ontwikkeld om de celvorm te manipuleren. Deze benaderingen bereiken hun doel door ofwel de cel te beperken met een driedimensionale mal of de cellulaire adhesiegeometrie te controleren door patroondepositie van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten op een antifouling oppervlak, een techniek die micropatterning11wordt genoemd . Hier zullen we een aantal technieken bekijken die door de jaren heen aan populariteit hebben gewonnen.

Oorspronkelijk geïntroduceerd als een benadering voor micro-elektronische toepassingen, is op zachte lithografie gebaseerde microcontactdruk ondubbelzinnig een cultfavoriet geworden12. Een master wafer wordt eerst vervaardigd door gebieden van een met fotoresistent bedekt siliciumsubstraat selectief bloot te stellen aan fotoirradiatie, waardoor een patroonoppervlak achterblijft13. Een elastomeer, zoals PDMS, wordt vervolgens op de hoofdwafel gegoten om een zachte "stempel" te genereren die ECM-eiwitten overbrengt naar een gewenst substraat11,14. Eenmaal vervaardigd, kan een master wafer worden gebruikt om veel PDMS-stempels te gieten die aanleiding geven tot zeer reproduceerbare micropatterns12. De patronen kunnen echter niet gemakkelijk worden aangepast vanwege het lange fotolithografieproces. Dit proces vereist ook zeer gespecialiseerde apparatuur en cleanrooms die meestal niet beschikbaar zijn op biologieafdelingen.

Meer recentelijk is gemeld dat direct printen met diepe UV beperkingen van traditionele lithografie-gebaseerde benaderingen omzeilt. Diep UV-licht wordt door een fotomasker geleid naar selectieve delen van een glazen hoes bedekt met poly-L-lysine-geënt-polyethyleenglycol. Chemische groepen die aan diepe UV worden blootgesteld, worden gefotoconverteerd zonder het gebruik van lichtgevoelige linkers om binding van ECM-eiwitten mogelijk te maken15. Het ontbreken van lichtgevoelige linkers maakt het mogelijk patroonafdekkingslips gedurende meer dan zeven maanden stabiel te houden bijkamertemperatuur 15. Deze methode vermijdt het gebruik van cleanrooms en fotolithografieapparatuur en vereist minder gespecialiseerde training. De eis voor fotomaskers vormt echter nog steeds een aanzienlijke hindernis voor experimenten die direct beschikbare veranderingen in patronen vereisen.

Naast methoden die celgeometrie manipuleren door gecontroleerde afzetting van ECM-eiwitten op een 2D-oppervlak, proberen anderen de celvorm te controleren door cellen in 3D-microstructuren te beperken. Veel studies hebben de hierboven beschreven zachte lithografie-gebaseerde benadering aangepast om 3D- in plaats van 2D PDMS-kamers te genereren om vormafhankelijke biologische processen in embryo's, bacteriën, gist en planten te onderzoeken16,17,18,19. Twee-foton polymerisatie (2PP) heeft ook het voortouw genomen als een microfabrication techniek die complexe 3D hydrogel steigers met nanometer resolutie20kan creëren. 2PP baseert zich op de principes van adsorptie met twee fotonen, waarbij twee fotonen die in femtoseconde pulsen worden geleverd tegelijkertijd worden geabsorbeerd door een molecuul - in dit geval foto-initiator - dat lokale polymerisatie van fotopolymeren mogelijk maakt21. Deze techniek is zwaar gebruikt om 3D-steigers te printen die de inheemse ECM-structuren van menselijk weefsel nabootsen en waarvan is aangetoond dat ze lage fotochemische schade aan cellenveroorzaken 22.

Het debuut van microphotopatterning 10 jaar geleden gaf onderzoekers de mogelijkheid om micropatterns te fabriceren terwijl ontoegankelijke en gespecialiseerde apparatuur werd vermeden. Microfotopatterning creëert patronen op micronschaal door selectieve gebieden van poly-vinylalcohol (PVA) die op geactiveerde glasoppervlakken zijn gecoat thermisch te verwijderen met behulp van een infraroodlaser23,24. ECM-eiwitten die alleen het onderliggende glasoppervlak hechten en niet PVA dienen dan als biochemische signalen om gecontroleerde verspreidingsdynamiek en celvorm mogelijk te maken. Deze methode biedt ook superieure flexibiliteit omdat patronen gemakkelijk in realtime kunnen worden gewijzigd. Hier bieden we een stapsgewijs protocol van microfotopatterning met behulp van een commercieel multi-foton beeldvormingssysteem. Het beschreven protocol is ontworpen voor snelle en geautomatiseerde fabricage van grote patronen. We hebben aangetoond dat deze patronen de celvorm efficiënt regelen door de geometrie van cel-ECM-adhesie te beperken. Ten slotte tonen we aan dat de beschreven patroontechniek de organisatie en dynamiek van het actinecytoskelet moduleert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coverslip voorbewerking

  1. Bereid piepende schone coverslips voor zoals beschreven in Waterman-Storer, 199825.
  2. Bereid 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) oplossing en incubeer de deklips in de oplossing gedurende 10 minuten met zachte agitatie. Zorg ervoor dat de afdeklips vrij in de oplossing bewegen.
  3. Was de afdeklips tweemaal met dH2O gedurende elk 5 min.
  4. Bereid 0,5% glutaraldehyde (GA) oplossing en incubeer de deklipjes in de oplossing gedurende 30 minuten op een shaker. Gebruik voor 25 afdeklips 50 ml glutaraldehyde-oplossing. Zorg ervoor dat de afdeklips vrij in de oplossing bewegen.
  5. Was de afdeklips drie keer met dH2O gedurende elk 10 minuten.
  6. Draai droge coverslips gedurende 30 s met behulp van een op maat gemaakte coverslip spinner. Een gedetailleerde beschrijving van de coverslip spinner is gepubliceerd26 en is online beschikbaar (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Geactiveerde coverslips kunnen tot een maand bij +4 °C worden bewaard in een doos met verdelers zodat ze van elkaar staan.

2. PVA-coating

  1. Meng PVA (98% gehydrolyseerde PVA, MW 98000) met dH2O om een 5,6% oplossing te maken.
  2. Solubiliseer het mengsel in een waterbad van 90 °C en filtreer onmiddellijk door een filter van 0,2 μm in een bioveiligheidskast terwijl het warm is. Filter de stamoplossing opnieuw als deze neerslaat. PVA-oplossing kan 3 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
  3. Voeg in een buis van 15 ml een deel HCl toe aan acht delen PVA. Draai de buis een paar keer voorzichtig om om te mengen.
  4. Giet 2 ml van de gemengde oplossing in een petrischaal van 35 mm en dompel een schone, voorbewerkte afdeklip in de vloeistof, waarbij u erop moet zorgen dat de afdeklips niet aan de bodem blijven plakken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een shaker.
  5. Verwijder voorzichtig de afdeklipjes van de oplossing. Gebruik de coverslip spinner om de vacht 40 s te draaien. Maak ondertussen het pincet schoon. Breng de afdeklip over in een doos en droog 's nachts bij +4 °C. PVA-gecoate afdeklips kunnen maximaal twee weken bij +4 °C worden bewaard.

3. De multifotonmicroscoop configureren

OPMERKING: Het beschreven protocol is afgestemd om cellijmmicropatterns van de gewenste vorm en grootte te maken op rechtopstaande of omgekeerde multi-foton beeldvormingssystemen, vooral die welke niet zijn uitgerust met een hardware autofocus. Zo maakt het patroonscript voor elk gezichtsveld (FOV) een klein gebied in vuur en vlam om een fiduciaire marker op de coverslip te maken, gebruikt het een software autofocus om de microscoop op het coverslipoppervlak te richten en ontslaat het het gewenste patroon. Als u dit script in een lus uitvoert voor aangrenzende FOV's, wordt een grote reeks micropatterns (5 x 5 mm of groter) gemaakt die de celvorm beperken en de activiteit van intracellulaire biologische processen moduleren. Het beschreven protocol is ontwikkeld voor Nikon A1R MP+ beeldvormingssysteem aangestuurd door NIS-Elements software. Als een beeldvormingssysteem van een andere leverancier wordt gebruikt voor patroonvorming, moeten de optische configuraties en het patroonscript worden aangepast volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Zet de microscoopsoftware aan. Zorg ervoor dat het objectief "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" op de microscoop is gemonteerd.
    OPMERKING: Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd voor een 25x/1.1 NA wateronderdompelingsdoelstelling, maar andere doelstellingen kunnen ook worden gebruikt voor patronen. Lezers moeten zich ervan bewust zijn dat pattering met een hoge vergrotingsdoelstelling(bijv.40x en 60x) langer duurt omdat het het aantal patronen in elke FOV aanzienlijk vermindert. Lage vergrotingsdoelstellingen kunnen worden gebruikt voor patronen, zolang ze zorgen voor een uniforme verlichting over de FOV en laservermogen voldoende om de PVA-laag te ablaten.
  2. Stel in het A1plus MP GUI-venster de laserlijn in op 750 nm.
  3. De optische configuratie "Image" instellen
    OPMERKING: NIS-Elements biedt gebruikers verschillende tools (grafische interface, een acquisitieworkflowbouwer JOBS, optische configuraties en macro's) om de microscoophardware te bedienen. In dit protocol wordt het grootste deel van de hardwarebesturing bereikt door middel van verschillende optische configuraties, evenals ND Acquisition- en ND Stimulation-modules.
    1. Klik op het tabblad Kalibratie op Nieuwe optische configuratie. Noem de optische configuratie "Image". Dit is de optische basisconfiguratie die beeldvorming van de coverslip door reflectie mogelijk maakt. Laat alle andere opties standaard staan en selecteer de juiste doelstelling.
    2. Klik in het A1plus MP GUI-venster op de knop Instellingen om de hardware-instellingen onder deze optische configuratie te configureren. Stel de stimulatielaser in op IR-stim, plaats de beam splitter (BS 20/80) in het lichtpad, stel de scannereenheid in op Galvano en selecteer de juiste gescande detector.
    3. Selecteer in het A1plus Compact GUI-venster een scangrootte en verblijftijd die voldoende is om kleine functies op de coverslip vast te leggen (respectievelijk 1,1 ms en 1024 pixels op ons systeem). Klik op de knop Normaal zodat er geen lijnmiddeling of lijnintegratie wordt uitgevoerd. Zorg ervoor dat de optie IR-laser gebruiken is ingeschakeld. Stel unidirectioneel scannen in voor eenvoud.
      OPMERKING: Als de scansnelheid van belang is, kan bidirectioneel scannen worden gebruikt.
    4. Pas in hetzelfde venster het laservermogen en de detectorgevoeligheid aan om een helder maar niet verzadigd beeld van het afdeklipoppervlak te verkrijgen. Het instellen van het laservermogen op 3 - 5% van het maximale vermogen en de detectorgevoeligheid ("HV" schuifregelaar) op 15 V is een goed uitgangspunt.
    5. Stel in het venster A1plus Scangebied Zoom in op 1 om de hele FOV vast te leggen.
    6. Sla de optische configuratie op.
  4. De optische configuratie "Print_Fudiciary_Marker" instellen
    1. Dupliceer de optische configuratie "Image" en hernoem deze naar "Print_Fudiciary_Marker".
    2. Selecteer in het A1plus Compact GUI-venster de kleinste scangrootte en verblijftijd (respectievelijk 64 pixels en 80,2 ms op ons systeem).
    3. Aangezien er in deze stap geen beeldvorming nodig is, stelt u de detectorgevoeligheid in op 0 en verhoogt u het laservermogen tot 30%. Een hoger laservermogen verwijdert de PVA-laag op de afdeklip in de gewenste gebieden thermisch.
    4. Stel in het venster A1plus Scangebied Zoom in op maximaal (15,87 voor ons systeem) en plaats het scangebied in het midden van de FOV.
    5. Stel in het venster ND Acquisitie een Z-stack experiment in. Stel de beweging in de Z-positie in op Relatief en selecteer het juiste Z-apparaat. Stel de stapgrootte in op 2 μm en de stapeldiepte op 10 μm boven en onder om rekening te houden met eventuele oneffenheden in de microscoopfase of het PVA-oppervlak tussen aangrenzende FOV's.
  5. De optische configuratie "Autofocus" instellen
    1. Dupliceer de optische configuratie "Image" en hernoem deze naar "Autofocus".
    2. Verlaag in het venster A1plus Scangebied de zoomfactor, zodat de FOV iets groter is dan de fiduciaire markering. Dit zorgt ervoor dat andere kleine functies op de coverslip de autofocus niet verstoren.
    3. Selecteer Autofocus instellenin het menu Apparaten. Stel de scandikte in op die van de Z-stack in het Z-stack experiment (zie stap 3.5.5). De microscoop scant door dit bereik en vindt het beste brandpuntsvlak met behulp van de fiduciaire marker. Laat de stapgrootte standaard staan.
  6. De optische configuratie "Load_ROI" instellen
    1. Dupliceer de optische configuratie "Image" en hernoem deze naar "Load_ROI".
    2. Stel in het venster A1plus Compact GUI de scangrootte in die identiek is aan die van het ROI-masker. Deze optische configuratie wordt gebruikt om een afbeelding vast te leggen waarop het ROI-masker wordt geladen. We gebruikten 2048 pixels om een optimale balans te bereiken tussen resolutie en snelheid.
      OPMERKING: Het is essentieel dat deze vastgelegde afbeelding even groot is als het ROI-masker.
  7. Instellen van de optische configuratie "Micropattern"
    1. Dupliceer de optische configuratie "Print_Fiduciary_Marker" en hernoem deze naar "Micropattern".
    2. Stel de zoomfactor in op één.
    3. Verhoog in het A1plus MP GUI-venster het stimulatielaservermogen om PVA te ablate en selecteer een geschikte scansnelheid (respectievelijk 40% en 32 s / frame in onze experimenten).
    4. Stel in het venster ND-stimulatie een ND-stimulatie-experiment in. Voeg een paar fasen toe aan het tijdschema en stel elk in als Stimulatie. Zorg ervoor dat het stimulatiegebied en de duur correct zijn.
      OPMERKING: Het aantal fasen kan worden aangepast aan de dikte en gladheid van de PVA-laag en het laservermogen dat in deze optische configuratie wordt gebruikt.
    5. Schakel in hetzelfde venster de functie StgMoveMainZ(-1.000,1) in voor elke fase. Dit verklaart opnieuw eventuele afwijkingen in de Z-richting.
      OPMERKING: De afstand en richting waarin de objectieve bewegingen kunnen worden aangepast aan de dikte en gladheid van de PVA-laag.
  8. De optische configuratie "Label_Surface" instellen
    1. Dupliceer de optische configuratie "Print_Fudiciary_Marker" en hernoem deze naar "Label_Surface".
    2. Verhoog in het A1plus Compact GUI-venster het laservermogen aanzienlijk en stel Zoom in op één. Hoge laserkracht die hier wordt gebruikt, zal de glasbekleding fysiek beschadigen en een label produceren dat zichtbaar is voor het blote oog. Dit helpt bij het lokaliseren van de patronen in verdere experimenten.

4. Het ROI-masker genereren en de macro instellen

  1. Het ROI-masker genereren
    1. Gebruik Adobe Photoshop of andere beschikbare software om een RGB-afbeelding van 2048 × 2048 te genereren. Het beeld komt overeen met een FOV onder de microscoop(d.w.z. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). De afbeelding moet een zwarte (0, 0, 0) achtergrond hebben.
      OPMERKING: Een aantal commerciële en gratis beeldedituren kunnen worden gebruikt om ROI-maskers te genereren voor laserondersteunde micropatterning. Hoewel we Adobe Photoshop gebruiken om de maskers te genereren, zijn GIMP en ImageJ / Fiji ook beschikbaar als alternatieve gratis opties.
    2. Teken 8 - 12 witte (255.255.255) patronen op de zwarte achtergrond. De grootte van het patroon is afhankelijk van het celtype (~ 200 pixels in diameter). Laat een leeg gebied van 500 × 500 leeg in het midden van de afbeelding voor autofocus. Laat voldoende ruimte tussen aangrenzende patronen (>200 pixels) en bij de boarder van de FOV voor optimale ablatie en celbevestiging. Patronen die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn beschikbaar op Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
  2. De macro instellen
    1. Klik op het menu Macro en selecteer Nieuwe macro.
    2. Importeer de "Pattern_Stimulation" code die beschikbaar is op Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) in het nieuwe macro venster. Sla dit stukje code op in een geschikte map.
    3. Open een ander nieuw macro venster en importeer de "Stage_Movement" code die beschikbaar is op Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Zorg ervoor dat de werkmap "Stage_Movement" in deze code identiek is aan die in stap 4.2.2. Sla de code "Stage_Movement" op in dezelfde map in stap 4.2.2.

5. Micropatterns genereren met behulp van fotoablatie

  1. Zet de microscoop en de bijbehorende accessoires aan. Zorg ervoor dat de IR-laser hiervoor voldoende is opgewarmd.
  2. Breng de PVA-gecoate afdeklip over op een houder. Voor een rechtopstaande microscoop moet u ervoor zorgen dat het PVA-oppervlak naar beneden wordt gezwakt.
  3. Voeg water toe aan de hoeken om de afdeklip te stabiliseren en monteer de houder op het microscoopstadium.
  4. Laat het doel zakken en voeg water toe aan de afdeklip.
    OPMERKING: Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd voor een 25x/1.1 NA wateronderdompelingsdoelstelling. Als een droge of olie-onderdompelingsdoelstelling wordt gebruikt, moet water worden vervangen door een geschikt onderdompelingsmedium. Wanneer een wateronderdompelingsdoelstelling wordt gebruikt om een grote micropattern-array te genereren, kan verdamping een probleem worden. Als dit het geval is, moet water worden vervangen door GenTeal, een over-the-counter oogsmeermiddel dat verkrijgbaar is bij apotheken.
  5. Schakel in de microscoopsoftware de IR-lasersluiter in het A1plus MP GUI-venster in. Klik op de knop Automatisch uitlijnen om de laser uit te lijnen voorafgaand aan de patrooning.
    OPMERKING: Het is cruciaal om laserautoalignment uit te voeren aan het begin van elke patroonsessie, omdat kleine afwijkingen in het laserpad de kwaliteit van de patronen aanzienlijk zullen beïnvloeden.
  6. Schakel over naar de optische configuratie "Image". Klik in het venster A1plus Compact GUI op Scannen om de FOV te scannen terwijl u het doel langzaam dichter bij de coverslip beweegt.
  7. Controleer het beeld zorgvuldig. In het begin zal het beeld extreem zwak lijken. Plaats het objectief dichter bij de coverslip totdat de helderheid van het beeld toeneemt. Dit is het afdeklipoppervlak dat naar het doel is gericht. Blijf het doel verplaatsen totdat de helderheid afneemt en weer toeneemt. Dit is het PVA-oppervlak dat moet worden gemodelteerd. Focus op elk klein kenmerk (coverslip imperfecties, stof, enz.)op dit oppervlak en stel nul in op de Z-schijf. Stel altijd nul in na het scherpstellen.
    OPMERKING: Hoewel beide oppervlakken van de afdeklip zijn bedekt met PVA, worden de optische eigenschappen van glas niet significant gewijzigd door PVA-coating. We beeldden dergelijke coverslips routinematig af met droge, water- en olie-immersiedoelstellingen en vonden het niet-gevormde PVA-oppervlak niet om de beeldvorming te verstoren.
  8. Schakel over naar de optische configuratie "Label_Surface". Klik op Vastleggen. Ga terug naar de optische configuratie en scan van "imaging". Het glasoppervlak moet beschadigd zijn en amorf lijken. Het beschadigde gebied is zichtbaar voor het blote oog, wat de locatie van patronen in verdere experimenten aangeeft.
    OPMERKING: Herhaal stap 5.8 in meerdere aangrenzende FOV's om de grootte van het zichtbare label te vergroten.
  9. Controleer nogmaals of het objectief zich ongeveer in het midden van de afdeklip bevindt. Zorg voor voldoende water tussen het objectief en de afdeklip. Verplaats het podium met 1 tot 2 FOV's om glasdeeltjes te voorkomen en scan om te bevestigen.
  10. Open in het menu Apparaten de macro Stage_Movement. Controleer of de Pattern_Stimulation werkmap correct is; zo niet, dan zal er geen stimulatie optreden. Stel de variabelen "PatternLength" en "PatternHeight" in op het gewenste aantal FOV's dat wordt gemodelleerd. Sla de macro op en voer deze uit.
  11. Nadat de patroonvorming is voltooid, schakelt u over naar de optische configuratie "Imaging". Controleer nogmaals of de IR-lasersluiter open is in het A1plus MP GUI-venster.
  12. Verplaats het werkgebied om de patronen weer te geven. Scan door de patronen om hun kwaliteit te controleren.
  13. Breng de coverslip over naar de rasterdoos, met patronen naar boven gericht.
  14. Bewaar de afdeklips met patroon bij +4 °C tot een week voor gebruik.

6. Fibronectine adsorptie

  1. Maak verse 1 M NaBH4 in 1 M NaOH oplossing. Voeg bij een verhouding van 1:100 toe aan pH 8,0 fosfaatbuffer met 0,2 M ethanolamine.
  2. Breng de afdeklips met patroon over naar een 35 mm weefselkweekschaal. Incubeer elke afdeklip met 1 ml van de bovenstaande oplossing gedurende 8 minuten om autofluorescentie te doven en spoel vervolgens 3 keer met PBS.
  3. Verdun fibronectine (FN) in PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/ml. Incubeer de afdeklip in FN gedurende 1 uur bij +37 °C.
    OPMERKING: Als een substantiële niet-specifieke binding van ECM-eiwit aan het substraat wordt waargenomen, kan FN worden verdund in PBS met 0,1% Pluronic F-12724.
  4. Was de afdeklip 2 keer met PBS. Indien niet onmiddellijk gebruikt, 's nachts bewaren in PBS bij +4 °C.

7. Celbijlage

OPMERKING: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor primaire menselijke gingivale fibroblasten.

  1. Kweek een schaal van 10 cm cellen tot 70% samenvloeiing.
  2. Warm celkweekmedia, PBS en 0,05% trypsine op in een waterbad van +37 °C.
    OPMERKING: Voor cellen die zich zwak aan het substraat hechten, kan niet-proteolytische dissociatie met versene (0,48 mM EDTA) of een gepatenteerde enzymvrije buffer de celaanhechting aan de patronen vergroten en moet worden overwogen.
  3. Voordat u cellen zaait, verplaatst u de patroonafdekkingslip naar een schone 35 mm weefselkweekschaal met 1 ml warme PBS.
  4. Aspireer de celkweekmedia uit de 10 cm weefselkweekschaal en was eenmaal met PBS.
  5. Voeg 700 μL 0,05% trypsine/EDTA toe aan de schaal en incubeer cellen in een +37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 1 min.
  6. In de tussentijd, aspireren de PBS die de patroon coverslip en voeg 1 ml cel cultuur media.
  7. Controleer of de cellen zijn losgekoppeld. Resuspend vervolgens de trypsinized cellen met 10 ml celkweekmedia en voeg 1 ml toe aan de patroondeksellip.
  8. Kweekcellen in de incubator gedurende 2 - 3 uur en controleer of er voldoende cellen aan de patronen zijn gehecht. Als dat het heten, moet u de media één keer wijzigen om niet-gekoppelde cellen te verwijderen. Dit minimaliseert de kans dat meerdere cellen op hetzelfde patroon landen.
    OPMERKING: De hechtingstijd kan variëren, afhankelijk van het celtype.
  9. Na nog eens 3-4 uur, of wanneer een voldoende aantal cellen zich op patronen heeft verspreid, zijn cellen klaar voor verdere experimenten. Wacht niet te lang om celdeling te voorkomen.

8. Gegevensverwerving

  1. Fix cellen met 4% PFA in cytoskeletbuffer27 gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  2. Volg immunofluorescentieprotocollen die zijn opgesteld voor de eiwitten van belang. PVA-gecoate coverslips werken goed met elk immunofluorescentieprotocol.
  3. Verkrijg beelden van cellen met behulp van een geschikte microscoop. Afhankelijk van het doel van het experiment, afbeelding een of meerdere cellen per FOV.

9. Beeldanalyse

OPMERKING: Met het volgende protocol kunnen gebruikers het gemiddelde fluorescentiesignaal van het eiwit van belang verkrijgen over een groot aantal cellen uit Z-stapels microscoopbeelden.

  1. Open de verworven afbeeldingen in NIS Elements en snijd de afbeeldingen bij. Zorg ervoor dat elke afbeelding slechts één goed gespreide cel bevat. Gedetailleerde instructies over beeldverwerking zijn te vinden in het onderstaande script.
  2. Installeer Anaconda en lanceer Spyder via Anaconda Navigator.
    OPMERKING: De .py scripts kunnen worden uitgevoerd in elke omgeving met de juiste pakketten die zijn geïdentificeerd in de vereisten.txt. We raden Anaconda aan omdat het de meeste vereiste pakketten voor de onderstaande codes bevat.
  3. Download het script van Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) en open in Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" of "Pattern_Averaging_4Channels.py" voor afbeeldingen met respectievelijk 3 kanalen of 4 kanalen).
  4. Stel parameters in op basis van de verkregen afbeeldingen. Zie het script voor gedetailleerde beschrijvingen.
  5. Druk op F5 om het script uit te voeren. De voortgang kan worden bijgehouden in het deelvenster Console.
  6. Haal de uitvoerbestanden op die in dezelfde map zijn opgeslagen. De uitvoerafbeeldingen zijn het gemiddelde van elk kanaal voor alle monsters. Het Excel-blad toont de gemiddelde intensiteit van elk kanaal in een monstercel, wat verdere kwantitatieve analyse mogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwaliteit van de experimentele gegevens verkregen door micropatterning is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de patronen. Om de kwaliteit van patronen te bepalen die met de bovenstaande methode zijn gegenereerd, hebben we eerst reflectiemicroscopie gebruikt om de vorm en grootte van de foto-ablated gebieden van de coverslip te beoordelen. We ontdekten dat elk individueel patroon erg leek op het ablatiemasker en duidelijke boarders en een oppervlak weergeeft dat het licht gelijkmatig weerkaatst (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bovenstaande resultaten tonen aan dat het beschreven IR-laserondersteunde micropatterning (microfotopatterning) protocol reproduceerbare aanhangpatronen van verschillende vormen biedt die de manipulatie van celvorm en cytoskeletarchitectuur mogelijk maken. Hoewel er zowel voor als na het debuut van microphotopatterning tal van micropatterningmethoden zijn ontwikkeld, heeft deze methode verschillende voordelen. Ten eerste vereist het geen gespecialiseerde apparatuur en cleanrooms die meestal alleen binnen engineeringaf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs onthullen geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Connaught Fund New Investigator Award aan S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subsidies RGPIN-2015-05114 en RGPIN-2020-05881), University of Manchester en University of Toronto Joint Research Fund en University of Toronto XSeed Program. C.T. werd ondersteund door NSERC USRA fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(3-Aminopropyl)trimethoxysilaanAldrich281778
10 cm celkwekbakjeVWR10062-880Polystereen, TC behandeld, geventileerd
25X Apo LWD Water Dipping ObjectiefNikonMRD77225
3.5 cm celkwekbakjeVWR10861-586Polystereen, TC behandeld, geventileerd
4'6-Diamidino-2-fenylindole (DAPI)Thermo622481mg/mL dihydrochloride oplossing
Bovin serine albumineBioShopALB005
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossingWisent311-425-CL
EthanolamineSigma-AldrichE9508
FibronectineSigma-AldrichFC0101mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectine AntilichaamBD610077Muis
FijiImageJVersie 1.53c
Fluorescerende PhalloidinInvitrogenA12380568nm
Glazen dekselVWR16004-30222 × 22 mm
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences1622025% waterige oplossing
ZoutzuurCaledon6025-1-2937% waterige oplossing
IR LaserCoherentChameleon Vision
Minimale essentiële medium αGibco12561-056
MontagemiddelSigmaF4680
Muis secundair antilichaamCell Signaling Technology4408SGeit, 488nm
Multi-foton microscoopNikonA1R MP+
Myosine lichte keten antilichaamCell Signaling Technology3672SKonijn
NIS ElementsNikonVersie 5.21.03
SalpeterzuurCaledon7525-1-2970% waterige oplossing
PhotoshopAdobeVersie 21.2.1
Pluronic F-127SigmaP2443Poeder
Poly(vinylalcohol)Aldrich341584MW 89000-98000, 98% gehydrolyseerd
Konijn secundair antilichaamCell Signaling Technology4412SGeit, 488nm
SchudkastVWR10127-876Ook bekend als analoge slinger
NatriumborohydrideAldrich452882Poeder
NatriumhydroxideSigma-AldrichS8045
Natriumfosfaat dibasischSigmaS5136Poeder
Natriumfosfaat monobasischSigmaS5011Poeder
SpyderAnaconda4.1.4
TrypsineWisent325-042-CL0,05% waterige oplossing met 0,53mM EDTA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
  3. Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
  4. Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
  5. Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
  6. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
  9. Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
  10. Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  11. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  12. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  13. Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
  14. Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
  15. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  16. Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
  17. Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
  18. Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
  19. Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
  20. Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
  21. Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217(2020).
  22. Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
  23. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  24. Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
  25. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
  26. Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
  27. Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
  28. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  29. Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491(2017).
  30. Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Infrared Laser MicropatterningCell Geometry ControlMicropatterning TechniquePolyvinyl Alcohol CoverslipsMultiphoton ImagingAutomated Pattern FabricationCell Morphology AnalysisHigh Resolution ImagingActin Stress FibersImmunofluorescence Imaging

Gerelateerde artikelen