Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vanaf 2000 werd het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol voor de behandeling van diabetes mellitus type I nog steeds geconfronteerd met enkele obstakels. Deze omvatten het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren en het langdurig gebruik van immunosuppressiva. Mesenchymale stamcellen (MSC's) worden beschouwd als een potentiële kandidaat als een alternatieve bron van eilandjesachtige celgeneratie. Onze vorige rapporten hebben met succes de vaststelling van inductieprotocollen geïllustreerd voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) tot insulineproducerende cellen (IPC's). De inductie-efficiëntie varieerde echter sterk. In dit artikel demonstreren we de vergelijking van hDPSC's pancreasinductie-efficiëntie via integratieve (micro-environmentale en genetische manipulatie) en niet-integratieve (micro-environmentale manipulatie) inductieprotocollen voor het leveren van hDPSC-afgeleide IPCs (hDPSC-IPCs). De resultaten suggereren een duidelijke inductie-efficiëntie voor zowel de inductiebenaderingen in termen van 3-dimensionale koloniestructuur, opbrengst, pancreas mRNA-markers en functionele eigenschap bij multidoseringsglucose-uitdaging. Deze bevindingen zullen de toekomstige oprichting van een klinisch toepasbaar IPCs- en pancreaslijnproductieplatform ondersteunen.
Inleiding
Diabetes mellitus is een voortdurende wereldwijde zorg. Een rapport van de International Diabetes Federation (IDF) schatte dat de wereldwijde prevalentie van diabetes zou toenemen van 151 miljoen in 2000 tot 415 miljoen in 20151,2. De meest recente epidemiologische studie heeft voorspeld dat de geschatte wereldwijde prevalentie van diabetes zal toenemen van 451 miljoen in 2017 tot 693 miljoen in 20451. Het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol werd voor het eerst aangetoond in 2000, toen werd aangetoond dat het de endogene insulineproductie han....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee, Faculteit Tandheelkunde, Chulalongkorn University. Menselijke DPC's (hDPSCs) werden geïsoleerd uit menselijke tandpulpweefsels die werden geëxtraheerd uit zowel premolaren als kiezen als gevolg van problemen met verstandskiezen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten volgens een goedgekeurd protocol (HREC-DCU 2018/054).
1. Integratief inductieprotocol
- Voorbereiding van lentiviral vector die PDX1 draagt
- Gebruik humane embryonale nier (HEK) 293FT cellen voor virale v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit artikel werden de resultaten van beide inductieprotocollen vergeleken. De diagrammen van beide inductieprotocollen zijn geïllustreerd in figuur 2A,C. In beide protocollen werd de evaluatie uitgevoerd onder een lichtmicroscoop en werden beelden geanalyseerd met ImageJ. hDPSCs waren in staat om kolonie-achtige structuren te vormen vanaf de eerste dag van inductie in beide inductieprotocollen. De morfologie van de kolonie was rond en dicht, en alle kolonies dreven in de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het bereiken van een hogere IPC-productie van MSC's speelt een essentiële rol in diabetestherapie. De kritische stappen van het integratieve protocol zijn afhankelijk van de kwaliteit van cellen die moeten worden gebruikt voor de transductie en de kwaliteit van transducte cellen. Sommige celvereisten die moeten worden gecontroleerd op succesvolle transductie, zorgen voor celgezondheid, celbankbeheer en cellen bevinden zich in een mitotically actieve toestand. Verder speelt het monitoren van de levensvatbaarheid van trans.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
SK, WR en QDL werden ondersteund door de Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO en PP werden ondersteund door Chulalongkorn Academic Advancement in Its 2nd Century Project. CS werd ondersteund door een onderzoeksondersteunende subsidie van de Faculteit Diergeneeskunde, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University en Government Research Fund.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celcultuur | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-behandelde Cultuurschaal | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Fosfaat gebufferd zout (PBS) poeder, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Eén pak wordt gebruikt voor het bereiden van 1 L PBS oplossing met steriele DDI |
| Trypsine-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Dragend PDX1 Voorbereiding | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugaalfilter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmide | Addgene | 12256 | Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Spuitfiltereenheid, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmide | Addgene | 12259 | Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infectie/Transfectiereagens | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmide | Addgene | 12260 | Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Drie-stappen Inductie Protocol | |||
| Activine A Recombinant Humaan Eiwit | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovien serum albumine (BSA, Cohn fractie V, vetzuurvrij) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-achtig peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrine-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Niet-essentiële Aminozuren (NEAA's) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Niet-behandelde celcultuurschaal, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Natriumbutyraat | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referenties
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
