Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.

Samenvatting

De in vitro expansie en differentiatie van menselijke hematopoietische voorlopers in megakaryocyten die in staat zijn om voorplaatjes te verlengen en bloedplaatjes vrij te geven, maakt een diepgaande studie mogelijk van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de biogenese van bloedplaatjes. Beschikbare kweekprotocollen zijn meestal gebaseerd op hematopoëtische voorlopercellen afgeleid van beenmerg- of navelstrengbloed die een aantal ethische, technische en economische zorgen oproepen. Als er al protocollen beschikbaar zijn voor het verkrijgen van CD34-cellen uit perifeer bloed, stelt dit manuscript een eenvoudig en geoptimaliseerd protocol voor voor het verkrijgen van CD34 + -cellen uit leukodepletiefilters die direct beschikbaar zijn in bloedcentra. Deze cellen worden geïsoleerd uit leukodepletiefilters die worden gebruikt bij de bereiding van bloedtransfusieproducten, wat overeenkomt met acht bloeddonaties. Deze filters zijn bedoeld om weggegooid te worden. Een gedetailleerde procedure om hematopoëtische voorlopercellen geïdentificeerd als CD34+ cellen uit deze filters te verzamelen, wordt beschreven. De methode om volwassen megakaryocyten te verkrijgen die proplatelets verlengen terwijl hun fenotypische evolutie wordt besproken, is ook gedetailleerd. Ten slotte presenteert het protocol een gekalibreerde pipetteermethode, om bloedplaatjes die morfologisch en functioneel vergelijkbaar zijn met inheemse bloedplaatjes efficiënt vrij te geven. Dit protocol kan dienen als basis voor het evalueren van farmacologische verbindingen die in verschillende stappen van het proces werken om de onderliggende mechanismen te ontleden en de in vivo bloedplaatjesopbrengsten te benaderen.

Inleiding

Bloedplaatjes zijn afkomstig van gespecialiseerde grote polyploïde cellen, de megakaryocyten (MK), die afkomstig zijn van een constant en nauwkeurig afgestemd productieproces dat bekend staat als megakaryopoiese (MKP). Aan de top van dit proces bevinden zich hematopoëtische stamcellen die, in contact met de beenmergomgeving (cytokines, transcriptiefactoren, hematopoietische niche), in staat zullen zijn om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren in hematopoëtische voorlopers (HP) die zich kunnen committeren aan de megakaryocytische route, wat aanleiding geeft tot onrijpe MKs¹. Onder invloed van verschillende cytokines, en in het bijzonder trombopoietine (TPO), het belangrijkste cytokine van MKP; de MK zal dan twee belangrijke stadia van rijping ondergaan: endomitose en de ontwikkeling van demarcatiemembranen (DMS). Deze volledig volwassen MK verschijnt dan dicht bij een sinusoïde vat waarin het cytoplasmatische extensies kan uitzenden, de proplatelets, die onder de bloedstroom worden vrijgegeven en vervolgens worden omgevormd tot functionele bloedplaatjes². Het klonen van TPO in 1994³ gaf een impuls aan de studie van MKP door de ontwikkeling van in vitro kweektechnieken te versnellen die HP-differentiatie en MK-rijping mogelijk maakten.

Er zijn veel pathologieën die bloedplaatjes beïnvloeden, zowel in termen van bloedplaatjesaantal (toename of afname) als functie^4,5. In staat zijn om MKP in vitro van menselijke HP samen te vatten, zou het begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces en uiteindelijk het therapeutisch beheer van patiënten kunnen verbeteren.

Verschillende bronnen van menselijk HP zijn geschikt: navelstrengbloed, beenmerg en perifeer bloed^6,7,8. Het oogsten van HP uit perifeer bloed levert minder logistieke en ethische problemen op dan hun herstel uit navelstrengbloed of het beenmerg. HP kan worden hersteld van leukaferese of buffy coat, maar deze bronnen zijn duur en niet altijd beschikbaar in bloedcentra. Andere protocollen, minder duur en gemakkelijker uit te voeren, maken direct herstel van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) mogelijk zonder de noodzaak van voorafgaande CD34-gestuurde isolatie^4,8. De zuiverheid van megakaryocyten is echter niet bevredigend met deze methode en een selectie van CD34+ cellen uit PBMC wordt aanbevolen voor optimale differentiatie in MK. Dit bracht ons ertoe om een HP-zuivering van leukoreductiefilters (LRF) te implementeren, routinematig gebruikt in bloedbanken om witte bloedcellen te verwijderen en zo nadelige immunologische reacties te voorkomen⁹. Sinds 1998 zijn bloedplaatjesconcentraten in Frankrijk zelfs automatisch leukodeputten. Aan het einde van dit proces worden LRF weggegooid en worden alle cellen die in de LRF worden vastgehouden, vernietigd. Cellen in LRF's zijn daarom direct beschikbaar zonder extra kosten. LRF's hebben een cellulair gehalte dat dicht in de buurt komt van dat verkregen door leukaferese of in buffy coats, met name in hun samenstelling van CD34 + HP waardoor ze een opmerkelijk aantrekkelijke bron^{zijn 10}. Van LRF als menselijke HP-bron is al aangetoond dat het cellen voorziet van intacte functionele capaciteiten¹¹. Deze bron heeft het voordeel dat het overvloedig en betaalbaar is voor laboratoriumonderzoek. In dit verband beschrijft dit artikel achtereenvolgens: i) de extractie en selectie van CD34⁺ HP uit LPF's; ii) een tweefasige geoptimaliseerde cultuur, die de inzet van HP in de megakaryocytische route en de rijping van MK die proplatelets kan uitzenden, samenvat; iii) een methode voor het efficiënt vrijgeven van bloedplaatjes uit deze MK; en iv) een procedure voor fenotypering van MK en gekweekte bloedplaatjes.

Protocol

Controle menselijke monsters werden verkregen van volonteer bloeddonoren die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven gerekruteerd door het bloedtransfusiecentrum waar het onderzoek werd uitgevoerd (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Alle procedures werden geregistreerd en goedgekeurd door het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek en geregistreerd onder het nummer AC_2015_2371.De donoren gaven hun goedkeuring in het CODHECO-nummer AC- 2008 - 562 toestemmingsformulier, zodat de monsters voor onderzoeksdoeleinden konden worden gebruikt. Menselijke studies werden uitgevoerd volgens de verklaring van Helsinki.

1. Extractie en selectie van CD34+ cellen (HP) uit LRF

1. Bereiding van het reagens (voor één LRF)
   1. Bereid 25 ml gefilterde elutiebuffer voor: 21,25 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2,5 ml zuur-citraat-dextrose (ACD) en 1,25 ml gedecomplementeerd foetaal runderserum (FBS). Filter op 0,22 μm en plaats op 37 °C.
   2. Bereid 500 ml PBS met 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
   3. Gooi 25 ml dichtheidsgradiëntmedium (DGM) (1,077 g/ml) weg in twee buizen van 50 ml.
2. LRF-terugspoelingsmodaliteiten (Figuur 1)
   OPMERKING: Deze stap vereist een steriele buislasmachine, waardoor steriele verbinding van thermoplastische buizen mogelijk is.
   1. Sluit eerst de LRF aan op een lege transferzak van 600 ml en de LRF op een slangenset(figuur 1A). Injecteer onder de bioveiligheidskast het totale volume gefilterde en voorbereide elutiebuffer dat overeenkomt met het aantal behandelde LRF's (xLRF x 25 ml) in de lege zak. Gebruik vervolgens een spuit van 30 ml om de volledige inhoud van de zak voorzichtig door de LRF te zuigen, terugvloei en breng de cellen over in een nieuwe buis van 50 ml(figuur 1B).
   2. Voor de sedimentatie van rode bloedcellen, verdun de celsuspensie met de helft met Dextran 2% en meng goed om rode bloedcellen te aggregeren. Wacht 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).

Figuur 1: LRF-terugspoelmodaliteiten. (A) Representatief schema van (i) de steriele aansluiting van de transferzak op de LRF en (ii) de slangenset op de LRF. B)Representatief schema voor de aansluiting van de spuiten voor celverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. PBMC collectie
   1. Na de sedimentatie van de rode bloedcellen, verwijdert en breng het supernatant over in een buis van 50 ml en vul het met PBS-EDTA 2 mM. Leg het supernatant voorzichtig over de hierboven voorbereide DGM. Laat het bovennatuurlijk zachtjes stromen zonder het oppervlaktevlak van de dichtheidsgradiënt te breken. Centrifugeer bij 400 x g bij RT gedurende 30 minuten in de brake off-modus.
   2. Verzamel de PBMC-laag met een wegwerptransferpipet. Breng de cellen van elke DGM-buis over in een nieuwe steriele buis van 50 ml. Vul elke buis met PBS-EDTA 2 mM en was tweemaal in 50 ml PBS-EDTA 2 mM bij 200 x g gedurende 10 minuten bij RT in brake on-modus.
   3. Pipetteer af en pool de celkorrel met 50 ml PBS-EDTA 2 mM.
      OPMERKING: Er is een mogelijkheid om de procedure te stoppen door de verzamelde cellen 's nachts op 4 °C te laten roeren. Filter vervolgens de suspensie met een celzeef van 40 μm om de gevormde aggregaten te verwijderen.
4. CD34+ cellen selectie
   1. Bepaal het celnummer en centrifugeer bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met de pauze aan.
   2. Adem het supernatant volledig op en resuspend in het juiste volume PBS-EDTA 2 mM, gedetailleerd door de fabrikant van de CD34-selectiekit (300 μL PBS-EDTA voor 10⁸ cellen). Voeg het FcR-blokkerende reagens en de CD34 Microbeads toe in de juiste concentratie (50 μL voor 10⁸ cellen).
   3. Was de celsuspensie na 30 minuten bij 4 °C en resuspendatie in het juiste volume PBS-EDTA 2 mM, zoals beschreven door de fabrikant van de CD34-selectiekit (500 μL per 10⁸ cellen).
      OPMERKING: De selectie wordt gemaakt op sorteerkolommen voor de passage van maximaal 2 x 10⁹ cellen per kolom.
   4. Geef het monster over de natte kolom van de magneet. Was tweemaal met 3 ml PBS-EDTA 2 mM en eluteer de cellen met 5 ml PBS-EDTA 2 mM. Een tweede run op een nieuwe kolom volgens dezelfde procedure is nodig om de zuiverheid van het monster te verbeteren.
      OPMERKING: Een verwacht aantal van 6,1 x 10⁵ cellen/LRF(figuur 2A). Voor hogere LRF-nummers, schaal reagentia en methoden dienovereenkomstig op.
5. Evaluatie van cd34+ celzuiverheid
   1. Voeg aan een aliquot van 100 μL suspensie verkregen na de CD34⁺ selectie, 2 μL humaan CD34-PE-antilichaam of 2 μL IgG - PE (controle) toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
   2. Was de cellen door 2 ml PBS toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Aspiraat supernatant volledig en resuspend in 200 μL PBS.
   3. Analyseer de zuiverheid door flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 2A en in de discussie.
      OPMERKING: Een zuiverheid van CD34+ cellen boven 90% wordt verwacht(Figuur 2Bii).
   4. Gebruik de CD34+ cellen direct of bevries voor verder gebruik.
6. CD34+ cellen bevriezen
   OPMERKING: CD34+ cellen bevriezen gebeurt bij een dichtheid van 10⁶ cellen per ml.
   1. Bereid na de bepaling van het CD34+ celgetal de volgende cryopreservatiemedia voor: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% DimethylSulfoxide (DMSO) en laat afkoeling toe bij 4 °C.
   2. Centrifugeer de CD34+ cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspend de pellet in koude oplossing 1 en voeg dan onmiddellijk toe aan de koude oplossing 2 (v/v).
   3. Plaats de cryobuizen onmiddellijk in een vriezer van -80 °C gedurende 24 uur en breng vervolgens cryobuizen over in de tank met vloeibare stikstof.

2. Kweek en differentiatie van CD34+ cellen om volwassen proplatelet-dragende megakaryocyten te produceren

OPMERKING: Celkweekprotocol (Figuur 3A), representatief schema van de celkweekprocedure worden in deze sectie beschreven.

1. CD34+ cellen ontdooien (indien nodig)
   1. Bereid de ontdooioplossing voor: 13 ml PBS-20% FBS en plaats deze gedurende 15 minuten op 37 °C. Breng de cryobuizen snel over in een waterbad van 37 °C tot slechts één klein ijskristal. Pipetteer onder de biologische kweekkast de hele inhoud en breng langzaam over in 13 ml voorgewarmde ontdooioplossing.
   2. Bepaal het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel.
2. Cultuurprotocol, stap 1: van dag 0 tot dag 7
   OPMERKING: Gewoonlijk worden culturen gemaakt in 24-well platen met 1 ml medium per put met een dichtheid van 40.000 levensvatbare cellen / ml, wat overeenkomt met 20.000 levensvatbare cellen / cm². Het is cruciaal om deze dichtheid te respecteren als er een opschalings gepland is.
   1. Groeimediumpreparaat : Voeg in serumvrije hematopoëtische celexpansiemedia (eerder verwarmd tot 37 °C) penicilline-streptomycine-glutamine (PSG) 1x, humaan lipoproteïne met lage dichtheid (hLDL) toe bij 20 μg / ml, cytokinecocktail van megakaryocytenexpansie 1x en stemregenine 1 (SR1) bij 1 μM.
   2. Cell seeding : Centrifugeer de ontdooide CD34+ cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant grondig en resuspend de celkorrel in 1 ml kweekmedia en voer een celnumeratie en levensvatbaarheid uit om het juiste volume te bepalen om de cellen te zaaien.
   3. Centrifugeer de cellen 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspend de pellet in het juiste volume van het warme groeimedium. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 7 dagen.
3. Cultuurprotocol, stap 2: van dag 7 tot dag 13 (Figuur 3B, representatieve beelden op dag 13)
   OPMERKING: Gewoonlijk worden culturen gemaakt in 24-well platen met 1 ml medium per put met een dichtheid van 50.000 levensvatbare cellen / ml, wat overeenkomt met 25.000 levensvatbare cellen / cm². Het is cruciaal om deze dichtheid te respecteren als er een opschalings gepland is.
   1. Rijpingsmediumpreparaat: Voeg in serumvrije hematopoëtische celexpansiemedia (eerder verwarmd tot 37 °C) PSG 1x, hLDL bij 20 μg/ml, TPO bij 50 ng/ml en SR1 bij 1 μM toe.
   2. Onderzoek de cellen onder de microscoop. Op dag 7 vertonen cellen een rond en homogeen uiterlijk door de putten of de kolven te vullen zonder te confluent te zijn.
   3. Breng onder een bioveiligheidskast de cellen voorzichtig over in een buis van 15 ml. Was putten met PBS. Bepaal vervolgens het aantal cellen en hun levensvatbaarheid om het juiste volume te berekenen om de cellen te zaaien.
   4. Centrifugeer de cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in het juiste volume warme media dat in de vorige stap is berekend. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 6 dagen.
4. Gekweekte bloedplaatjesafgifte op dag 13
   1. Voeg 0,5 μM prostaglandine I₂ (BGA₂₎ en 0,02 U/ml apyrase toe aan de kweek en pipetteren vijf keer met een pipet van 1 ml.
      OPMERKING: Bloedplaatjes worden nu vrijgegeven in het medium.

3. Flowcytometrie-analyse (MK-fenotypering en aantal gekweekte bloedplaatjes)

OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op de fenotypering van de cellen op de geselecteerde kweekdagen. Het maakt het ook mogelijk om het aantal gekweekte bloedplaatjesafgifte te bepalen (Figuur 4A,B).

1. Voorbereiding op MK-analyse
   1. Label vier sets microcentrifugebuizen als volgt: Ongelabelde cellen als controle, cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellen + 5 μL CD34 - PECy7, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Gebruik minimaal 1,10⁵ cellen per buis, niet meer dan 1,10⁶ cellen per buis. Voeg toe aan 100 μL celsuspensie per cytometriebuis en de verschillende antilichamen. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   2. Voeg vervolgens 2 ml PBS-EDTA 2 mM per buis toe en centrifugeer 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens het centrifugeren een oplossing van PBS-EDTA 2 mM + 7-aminoactinomycine-D (7AAD) (1/100), zorg voor 300 μL-oplossing per buis.
   3. Verwijder het supernatant en neem de pellet op in 300 μL PBS-EDTA 2 mM met 7AAD. Voer monsters binnen 30 minuten door de flowcytometer.
      OPMERKING: Analysestrategie voor flowcytometrie wordt weergegeven in figuur 3C en in de discussie.
2. Buisvoorbereiding voor gekweekte bloedplaatjesanalyse
   1. Label vier sets microcentrifugebuizen als volgt: Ongelabelde cellen als controle, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellen + 20 μL CD42a - PE, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Na vijf opeenvolgende pipetteringen in de kweekput, breng 300 μL van de suspensie in buis over voor cytometrie met een gekalibreerd aantal fluorescerende kralen.
   2. Voeg antilichamen toe en incubeer in het donker bij RT gedurende 30 minuten.
   3. Voer de monsters binnen 30 minuten door de flowcytometer en stel de acquisitie in voor de passage van 5.000 kralen.
      OPMERKING: Analysestrategie voor flowcytometrie wordt weergegeven in figuur 4B en in de discussie.

Resultaten

Extractie en selectie van CD34+ cellen uit LRF's
Hier beschrijft de methode, afgeleid van Peytour et al.⁹, de extractie en selectie van CD34⁺ cellen uit afgedankte LRF's die beschikbaar zijn in bloedbanken na verwijdering van leukocyten. Na de backflush-procedure worden gewoonlijk 1,03 x 10⁹ ± 2,45 x^{10 8} cellen/LRF (Mean±SEM; n = 155) teruggevonden met een levensvatbaarheid van 94,88 ± 0,10% (figuur 2A i

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van MK die in staat is om proplatelets uit bloedafname HP uit te zenden en bloedplaatjes uit het kweekmedium vrij te geven. HP worden verkregen uit LRF, een bijproduct van de bloedbanken, gebruikt om besmettelijk leukocyten uit cellulaire bloedproducten te verwijderen en bijwerkingen te voorkomen. Hoewel deze methode relatief eenvoudig is, verdienen een paar punten speciale aandacht.

De afzetting van de celsuspensie op het medium met dich...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Of gelijkwaardig materiaal
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Of gelijkwaardig materiaal
Cryotubes	Dutscher	55002	Of gelijkwaardig materiaal
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Of gelijkwaardig materiaal
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Of gelijkwaardig materiaal
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Of gelijkwaardig materiaal
Laminar flow hood	Holten	NA	Gearchiveerd product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Of gelijkwaardig materiaal
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Of gelijkwaardig materiaal
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Of gelijkwaardig materiaal
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Of gelijkwaardig materiaal
Tubulures	B Braun	4055137	Of gelijkwaardig materiaal