Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62515

⸱

28 juli 2021

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

Samenvatting

Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten, gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De mogelijkheid om megakaryocyten in realtime en hun oorspronkelijke omgeving in beeld te brengen, werd meer dan 10 jaar geleden beschreven en werpt nieuw licht op het proces van bloedplaatjesvorming. Megakaryocyten strekken langwerpige uitsteeksels, proplatelets genoemd, uit door de endotheelbekleding van sinusoïde bloedvaten. Dit artikel presenteert een protocol om gelijktijdig in real time fluorescerend gelabelde megakaryocyten in het beenmerg en sinusvormige bloedvaten van de schedel in beeld te geven. Deze techniek is gebaseerd op een kleine operatie die de schedel intact houdt om ontstekingsreacties te beperken. De muizenkop wordt geïmmobiliseerd met een ring die op de schedel is gelijmd om te voorkomen dat bewegingen ademen.

Met behulp van twee-fotonenmicroscopie kunnen megakaryocyten tot een paar uur worden gevisualiseerd, waardoor celuitsteeksels en proplatelets kunnen worden geobserveerd tijdens het proces van verlenging in sinusoïde vaten. Dit maakt de kwantificering mogelijk van verschillende parameters met betrekking tot de morfologie van de uitsteeksels (breedte, lengte, aanwezigheid van vernauwingsgebieden) en hun rekgedrag (snelheid, regelmaat of aanwezigheid van pauzes of retractiefasen). Deze techniek maakt ook gelijktijdige registratie van circulerende bloedplaatjes in sinusoïde vaten mogelijk om de snelheid van de bloedplaatjes en de richting van de bloedstroom te bepalen. Deze methode is bijzonder nuttig om de rol van genen van belang bij de vorming van bloedplaatjes met behulp van genetisch gemodificeerde muizen te bestuderen en is ook vatbaar voor farmacologische tests (bestudeer de mechanismen, evalueer geneesmiddelen bij de behandeling van bloedplaatjesproductiestoornissen). Het is een waardevol hulpmiddel geworden, vooral als aanvulling op in vitro studies, omdat het nu bekend is dat in vivo en in vitro proplateletvorming afhankelijk zijn van verschillende mechanismen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat in vitro microtubuli nodig zijn voor proplatelet elongatie op zich. In vivodienen ze echter eerder als een steiger, waarbij de verlenging voornamelijk wordt bevorderd door bloedstroomkrachten.

Inleiding

Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten-gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De precieze manier waarop megakaryocyten bloedplaatjes in de bloedsomloop afgeven, is lang onduidelijk gebleven vanwege de technische uitdaging bij het observeren van real-time gebeurtenissen door het bot. Twee-fotonenmicroscopie heeft geholpen deze uitdaging te overwinnen en heeft geleid tot grote vooruitgang in het begrijpen van het proces van de vorming van bloedplaatjes. De eerste in vivo megakaryocytenwaarnemingen werden gedaan door von Andrian en collega's in 2007, met de visualisatie van fluorescerende megakaryocyten door de schedel1. Dit was mogelijk omdat de botlaag in de frontoparietale schedel van jongvolwassen muizen een dikte heeft van enkele tientallen micron en voldoende transparant is om visualisatie van fluorescerende cellen in het onderliggende beenmerg mogelijk te maken2.

De daaropvolgende studies pasten deze procedure toe om de vorming van proplaatjes onder verschillende omstandigheden te evalueren en de onderliggende mechanismen3,4,5,6te ontcijferen. Deze studies leverden definitief bewijs dat megakaryocyten dynamisch uitsteeksels, proplatelets genaamd, verlengen door de endotheelbarrière van de sinusoïde vaten(figuur 1). Deze proplatelets komen vervolgens vrij als lange fragmenten die enkele honderden bloedplaatjes in volume vertegenwoordigen. De bloedplaatjes zullen worden gevormd na de remodellering van de proplatelets in de microcirculatie van stroomafwaartse organen, met name in de longen7. Tot op heden blijven het precieze proces en de moleculaire mechanismen echter onderwerp van discussie. De voorgestelde rol van de cytoskeletale eiwitten in de verlenging van proplatelets verschilt bijvoorbeeld tussen in vitro en in vivo omstandigheden3, en verschillen in proplateletvorming zijn aangetoond onder inflammatoire omstandigheden6. Om de zaken nog ingewikkelder te maken, betwistte een recente studie het proplatelet-gedreven concept en stelde voor dat in vivo, bloedplaatjes in wezen worden gevormd door een membraan-ontluikend mechanisme op het megakaryocytenniveau8.

Dit artikel presenteert een protocol voor de observatie van megakaryocyten en proplatelets in het beenmerg uit het schedelbot bij levende muizen, met behulp van een minimaal invasieve procedure. Soortgelijke benaderingen zijn eerder beschreven om andere mergcellen te visualiseren, met name hematopoëtische stam- en voorlopercellen9. De focus ligt hier op de observatie van megakaryocyten en bloedplaatjes om enkele parameters te beschrijven die kunnen worden gemeten, met name proplatelet morfologieën en bloedplaatjessnelheid. Dit protocol presenteert hoe een katheter in de halsader kan worden ingebracht om fluorescerende tracers en geneesmiddelen te injecteren en door het schedelbot te observeren. Het calvariale bot wordt blootgesteld met behulp van een kleine operatie, zodat een ring aan het bot wordt gelijmd. Deze ring dient om het hoofd te immobiliseren en bewegingen als gevolg van ademhaling te voorkomen en een beker gevuld met zoutoplossing te vormen als het onderdompelingsmedium van de lens. Deze techniek is zeer geschikt om i) in realtime de sinusoïde geometrie en megakaryocyten te observeren die interageren met de vaatwand; ii) volg megakaryocyten in het proces van proplateletvorming, verlenging en afgifte; en iii) meet bloedplaatjesbewegingen om de complexe sinusoïde bloedstroom te controleren. Gegevens verkregen met behulp van dit protocol zijn onlangs gepubliceerd3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese normen 2010/63/EU en het CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments van de Universiteit van Straatsburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, projectovereenkomst N°: 2018061211274514).

1. Voorbereiding van muizen en inbrengen van een katheter in de halsader

OPMERKING: Hier werden mannelijke of vrouwelijke, 5-7 weken oude mTmG-reportermuizen gebruikt (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo10) gekruist met Pf4-cre muizen11, waardoor intense groene fluorescentie-etikettering in megakaryocyten en bloedplaatjes12mogelijk is . Voordat u met het experiment begint, verwarmt u de verwarmingskamer van de microscoop een paar uur voor.

  1. Transporteer de muis naar de beeldvormingsruimte en ga verder met anesthesie.
    1. Anesthetiseer de muis door intraperitoneale (i.p.) injectie van een oplossing van ketamine (ketamine (100 μg/g) en xylazine (10 μg/g) (5 μL/g).
      OPMERKING: Herhaalde toediening van ketamine /xylazine wordt hier gebruikt en werkt goed, maar vereist de onderbreking van de opname voor regelmatige herinjectie. Als alternatief, als een anesthesieapparaat beschikbaar is, kan de inductie van anesthesie worden uitgevoerd met ketamine / xylazine en vervolgens worden gehandhaafd bij inademing van gassen (mengsel van isofluraan, lucht en zuurstof).
    2. Vervang het dier in zijn kooi totdat het diepe anesthesie bereikt. Plaats de muis op een verwarmde plaat die is opgewarmd bij 37 °C voor alle volgende manipulaties.
      OPMERKING: Terwijl het dier diepe anesthesie bereikt, schakelt u de microscoop en alle apparatuur in (zie rubriek 4.1) en stelt u de verschillende parameters in die nodig zijn (zie rubriek 4.2) om het experiment te starten zodra de operatie is voltooid. Hier duurt de procedure slechts 3 uur en is deze terminaal. De muis wordt na het experiment geëuthanaseerd zonder wakker te worden. Daarom is ethanoldesinfectie voor huid en instrumenten voldoende. Afhankelijk van de institutionele richtlijnen of als de procedure langer zou duren, moeten echter completere desinfectiemethoden worden gebruikt, zoals drie afwisselende scrubs met betadine/povidon en alcohol.
  2. Installeer een katheter in de halsader.
    OPMERKING: Het is belangrijk om microbiële besmetting tijdens de operatie zoveel mogelijk te voorkomen. Zorg ervoor dat u de huid zorgvuldig desinfecteert met 70% ethanol (EtOH) voordat u doorgaat met de operatie. Gebruik altijd een gesteriliseerde schaar en pincet en spoel ze regelmatig af in 70% EtOH. Werk op een schone plek en draag een mondkapje. Een 22 G "over-de naald" katheter, bestaande uit een naald in een plastic buis, wordt gebruikt voor intraveneuze injectie (zie de tabel met materialen).
    1. Plaats de muis op zijn rug en bevestig de voorste benen met chirurgische tape om de keel te strekken(figuur 2A). Desinfecteer de keel met 70% ethanol.
      OPMERKING: Voor het gemak kan de keel vóór de operatie worden geschoren. Als de procedure langer duurt, moet zorgvuldig worden geschoren voor de juiste aseptische techniek.
    2. Maak een incisie van 0,7-1 cm over de rechter- of linker halsader met behulp van een steriele schaar. Rek het aangrenzende bindweefsel uit om de uitwendige halsader en de bovenkant van de borstspier bloot te leggen(figuur 2A).
    3. Vul de katheter met warme, steriele fysiologische zoutoplossing. Breng de katheter in de ader in na het penetreren door de borstspier(figuur 2B).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u luchtbellen in de katheter vermijdt. Het is belangrijk om de katheter door de spier in te brengen om bloedingen te voorkomen, omdat de spier een compressiepunt zal vormen. Zelfs muizen met hemostasedefecten, zoals Itgb3-/- muizen, bloeden niet bij het inbrengen van een katheter met deze aanpak.
    4. Verwijder de naald voorzichtig en beweeg de katheter indien nodig voorzichtig dieper in de ader. Sluit de spuit aan en stabiliseer de katheter door een druppel chirurgische lijm toe te voegen(Tabel met materialen).
      OPMERKING: Het is mogelijk om een katheter in de staartader in te brengen, hoewel dit enige oefening vereist omdat de ader een kleiner kaliber heeft. Dit is vooral moeilijk bij het gebruik van muizen met donker haar, waarvan de staartader nauwelijks zichtbaar is. Vanwege het grotere kaliber kan het plaatsen van de katheter in de halsader het mogelijk maken om grotere volumes of herhaalde behandelingen betrouwbaarder te injecteren. Houd er rekening mee dat de spuit de eerste keer wordt gevuld met warme zoutoplossing en vergeet niet om het dode volume te injecteren voordat u de medicijnoplossing injecteert.
    5. Breng de muis voorzichtig terug naar een liggende positie(figuur 2C). Breng gel(Table of Materials) aanop de ogen om uitdroging te voorkomen.

2. Chirurgie en installatie van de schedelring

OPMERKING: De volledige ondersteuning voor muisinstallatie bestaat uit 4 stuks, een blok en een plaat, de ring om de muiskop vast te houden en een schroef om de ring aan het blok te bevestigen(figuur 3A). Alle elementen van de ondersteuning zijn verkregen uit i.materialise.com door 3D-printen. De plaat is gemaakt van acrylonitrilbutadieen styreen (ABS) polymeer, het blok en de schroef van roestvrij staal, en de ring van hoogwaardig roestvrij staal (zeer gedetailleerd roestvrij staal) (zie aanvullende figuur S1 voor afmetingen en aanvullende materialen voor de 3D-printbestanden). Het blok wordt permanent aan de steun bevestigd, geschroefd of verlijmd. Zodra de ring op de schedel van de muis is bevestigd, moet deze op de blokhouder worden geschroefd(figuur 3A).

  1. Bevochtig het haar op de hoofdhuid met een papieren handdoek nat met 70% ethanol voor desinfectie. Verwijder al het losse haar met een natte papieren handdoek.
    OPMERKING: Voor het gemak kan de hoofdhuid vóór de operatie worden geschoren.
  2. Insnijs de hoofdhuid door een T te vormen op de middellijn tot 1 cm en tussen de oren om het calvarium bloot te leggen met behulp van een steriele fijne schaar en pincet.
    OPMERKING: De ring wordt gepositioneerd om de frontale en pariëtale botten te overlappen(figuur 3B).
  3. Gebruik een steriel pincet om de schedel bloot te leggen. Verwijder het periosteum voorzichtig met een schaar en pincet. Gebruik een steriel wattenstaafje gedrenkt in fysiologische zoutoplossing om al het periosteum en eventuele vuil of haar te verwijderen, wat de beeldvorming kan veranderen.
    OPMERKING: Om ontstekingsreacties te beperken, moet u er goed op letten dat u het bot niet beschadigt.
  4. Verwijder eventuele bloedsporen door te spoelen met zoutoplossing en droog het bot snel af met een droog wattenstaafje. Breng de lijmgel aan op de ring, plaats deze op het blootgestelde bot en houd deze een paar seconden vast zodat de ring stevig aan de schedel is bevestigd.
    OPMERKING: Er mag geen lijm in het observatieveld komen, omdat dit kan leiden tot ongewenste autofluorescentie.
  5. Bevochtig de schedel licht met een wattenstaafje ondergedompeld in fysiologische zoutoplossing.
  6. Bereid de siliconen tandpasta door zorgvuldig 1:1 blauwe en gele componenten te mengen. Breng tandpasta rondom de ring aan voor afdichting om lekkage tijdens het beeldvormen te voorkomen. Verwijder voorzichtig alle tandpasta of lijm die mogelijk in de ring is gekomen.
  7. Vul de ring met zoutoplossing en controleer op lekkage.
    OPMERKING: De zoutoplossing dient als het onderdompelingsmedium voor het microscoopobject objectief. Bloedingen kunnen kritischer zijn bij het gebruik van muizen met hemostase-gerelateerde defecten. Het is essentieel om te voorkomen dat bloed de ring binnendringt, omdat dit verdere beeldvorming kan vervagen.
  8. Plaats de muis op de steun en schroef de ring op de blokhouder(figuur 3C). Plaats gevouwen kompressen onder het hoofd van het dier om het hoofd op te tillen en loslating van de ring van de schedel te voorkomen.
    OPMERKING: Het hoofd is direct gefixeerd, zodat het beeldbewegingen als gevolg van ademhaling voorkomt.
  9. Plaats de ondersteuning en muisassemblage in de verwarmde microscoopkamer(figuur 3D).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de ingebrachte katheter op geen enkel moment losraakt.

3. Follow-up van de verdoofde muizen tot het einde van het experiment

OPMERKING: Anesthesie wordt elke 35 minuten opnieuw geïnduceerd door afwisselend subcutane (s.c.) injecties van ketamine (25 μg / g) in een volume van 5 μL / g lichaamsgewicht en een mengsel van ketamine (50 μg / g) en xylazine (5 μg / g) (1,2 μL / g). Omdat het niet mogelijk is om de verwarmde microscoopkamer tijdens de acquisitie te openen, wordt anesthesiebewaking uitgevoerd voor en na het opnieuw toedienen van het verdovingsmiddel door teen knijpen. Op dezelfde manier wordt teen knijpen uitgevoerd voordat elke nieuwe video-opname wordt begonnen.

  1. Stop indien nodig de acquisitie en induceer opnieuw anesthesie door s.c. injectie.
    1. Wees voorzichtig om de muiskop niet te bewegen, knijp de huid van de rug tussen de duim en wijsvinger van de linkerhand. Injecteer het verdovingsmiddel subcutaan in de plooi van de achterhuid met de rechterhand (of omgekeerd voor linkshandigen).
  2. Controleer op de aanwezigheid van zoutoplossing in de ring en vul indien nodig met verse zoutoplossing. Ga door met opnemen voor de volgende 35 minuten en ga op dezelfde manier verder voor de opnameduur.
  3. Aan het einde van het experiment euthanaseer je de muis door cervicale dislocatie voordat hij wakker wordt.
    OPMERKING: De muis wordt verdoofd gehouden voor een maximale duur van 3 uur, in overeenstemming met de lokale ethische en dierenwelzijnscommissie.

4. Beeldvorming met twee fotonen

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de microscoop en gerelateerde apparatuur. Beelden werden opgenomen met een resonerende scanner (12 of 8 kHz). De bidirectionele modus is ingesteld om de snelheidsacquisitie te verhogen, omdat pixels in beide richtingen worden geregistreerd; daarom moet elke mismatch in de fase worden gecorrigeerd met het bedieningspaneel "fasecorrectie". Ten slotte werd een aangepaste middeling opgezet als compromis tussen de snelheid van acquisitie en de signaal-ruisverhouding.

  1. Schakel de microscoop met twee fotonen in, inclusief de laser- en resonantiescanner (uitvoerlaservermogen meestal ~ 1,8-2,5 W, afhankelijk van de laser).
  2. Stel de juiste lasergolflengte in voor de gekozen fluoroforen. Stel de juiste golflengte in voor het herstel van uitgezonden licht.
    OPMERKING: Hier werden een golflengte van 913 nm en hybride detectoren (500-550 nm en 575-625 nm) gebruikt om alexafluor-488 en Qtracker-655 gelijktijdig te prikkelen en te detecteren.
  3. Injecteer met behulp van de intrajugulaire katheter de fluorescerende tracer om de vasculatuur te labelen (Qtracker-655; Tabel met materialen). Injecteer 50 μL/muis van een oplossing bij 0,2 μM, eenmaal per uur vernieuwd voor maximaal 150 μL/experiment.
    OPMERKING: Andere tracers kunnen worden gebruikt, zoals dextran met een hoog molecuulgewicht1. Bedenk in dat geval dat de viscositeit van het bloed kan worden gewijzigd door dextran en sommige hemorheologische parameters kan wijzigen.
  4. Plaats het microscoopstadium met de steun en muis onder het objectief van de microscoop. Controleer of de ring altijd gevuld is met zoutoplossing en dompel het doel onder. Gebruik epifluorescentie om de beenmergvaten (rood) en de aanwezigheid van megakaryocyten (groen) uitgelijnd langs sinusoïde vaten te lokaliseren.
    OPMERKING: Het schedelbot heeft een dikte lager dan 100 μm2. Het merg bevindt zich onder het bot en is gemakkelijk te herkennen aan de fluorescerende groene megakaryocyten en de dichte rode anastomosed sinusoïde vaten gelabeld door Qtracker-655.
  5. Lange overnames (megakaryocyten, proplatelets)
    1. Zoek naar de regio van belang. Pas beeldacquisitieparameters toe zoals hierboven vermeld.
    2. Voor lange acquisities (bijv. visualisatie van proplateletvorming of rek), verwerf z-stack-afbeeldingen met geoptimaliseerde intervallen (meestal tussen 0,85 en 1,34 μm) met behulp van een 8 kHz resonantiescanner.
      OPMERKING: Een 12 kHz resonantiescanner kan de acquisitiesnelheid verhogen.
    3. Verkrijg afbeeldingen van 384 x 384 pixels om de hele megakaryocyt en het vat te visualiseren. Gebruik lijnmiddeling, naar wens, voor snelle acquisitie met een goede resolutie. Bepaal het tijdsinterval van de acquisitie van de afbeeldingsstapel, meestal 10 s of 30 s voor proplateletvisualisatie.
      OPMERKING: Hier werd een lijngemiddelde van 8 gebruikt om een hogere signaal-ruisverhouding te verkrijgen, waardoor 1 beeld/10 s kon worden verkregen met een 8 kHz resonantiescanner. Zorg ervoor dat lijnmiddeling tijdens live acquisitie is toegestaan.
  6. Korte en snelle acquisitie (bloedplaatjes)
    OPMERKING: Voor kortere acquisitie van snelle gebeurtenissen, zoals de snelheid van bloedplaatjes, is het essentieel om de frameacquisitiesnelheid te maximaliseren. Het selecteren van het juiste acquisitietype optimaliseert de frame-acquisitiesnelheid (d.w.z. een ruimte-tijd acquisitietype "xyt").
    1. Minimaliseer (bijvoorbeeld 256 x 90 pixels) en pas de afbeeldingsgrootte aan het vat aan door het beeldveld indien nodig te roteren.
    2. Gebruik de hoogst beschikbare scansnelheid.
    3. Gebruik bidirectioneel scannen.
      OPMERKING: Voor bidirectioneel scannen moet u ervoor zorgen dat de fase goed is afgesteld.
    4. Minimaliseer lijngemiddelden om het optimale compromis te vinden tussen beelddefinitie en snelheid van acquisitie.
      OPMERKING: Voor bloedplaatjessnelheidsmetingen kan een gepixeld beeld voldoende zijn als het helpt de snelheid van acquisitie te vergroten.
    5. Minimaliseer z-stack om de acquisitiesnelheid te vergroten. Het verkrijgen van slechts 1 z-stack is voldoende om de snelheid van de bloedplaatjes te kwantificeren. Verkrijg voor 10-20 s om de snelheid van bloedplaatjes te meten.
      OPMERKING: Met deze voorwaarden kan een maximum van 133 frames/s worden verkregen met een 12 kHz resonantiescanner. De parameters moeten worden aangepast aan de omstandigheden. In sommige vaten is de bloedplaatjessnelheid echter te hoog om de bloedplaatjessnelheid met deze instellingen betrouwbaar te kwantificeren.
  7. Proplatelet breedte- en lengtemeting
    OPMERKING: Om LIF-bestanden verkregen op Leica software met ImageJ te laden, download en installeer eerst de LOCI plug-in op ImageJ om de Bio-Formats Importer te gebruiken.
    1. Proplatelet breedte
      1. Open de film met ImageJ. Als u een breedtemeting wilt uitvoeren, gebruikt u alleen de film van de proplatelets zonder het vat. Om de verschillende kanalen te scheiden, klikt u op Afbeelding| Kleur en selecteer Gesplitste kanalen.
      2. Maak voor een z-stack film een gemiddelde z-projectie voor elk tijdspunt door op Afbeelding te klikken| Stapelt en selecteerT Z-project. Voer bij Projectietype de gemiddelde intensiteit in.
      3. Behandel de afbeelding om de ruis te verwijderen. Trek de achtergrond af door op Verwerken te klikken| Trek achtergrond af en pas de straal van de rollende kogel toe: 50,0 pixels. Maak de afbeelding glad door te klikken op Proces en Vloeiend.
      4. Traceer een lijn dicht bij de basis van het proplatelet (in de buurt van de megakaryocyt, vermijd elk ander object).
        OPMERKING: Vergeet niet om de schaal van de afbeelding in te stellen om de waarde in de gewenste eenheid te verkrijgen door op Analyseren en schaal instellente klikken . Standaard is de eenheid van de afbeelding in pixels.
      5. Plot het intensiteitsprofiel, pas een gaussiaanse curve aan en bereken de volledige breedte bij half maximum (FWHM). Schrijf daarvoor het volgende script in een macro door op Plugins te klikken| Nieuw en selecteer Macro en voer het uit door op Macro te klikken| Macro uitvoeren:y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussisch",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; afdrukken (FWHM).
        OPMERKING: Zorg ervoor dat er slechts één piek in de lijnscan is, die overeenkomt met de intensiteit van het proplatelet.
      6. Voer de acties uit die worden beschreven in stap 4.7.5 op 1 segment of herhaald in de loop van de tijd om de gemiddelde breedte van het proplatelet te krijgen
    2. Proplatelet lengte
      1. Volg een lijn langs het proplatelet, van de basis dicht bij de megakaryocyt naar de bovenkant. Gebruik een gesegmenteerde lijn om de vorm van het proplaatplaatje te volgen. Herhaal het voor elk tijdstip.
      2. Vergeet niet om elke regel op te slaan met behulp van de ROI Manager: klik op | analyseren Tools en selecteer ROI Manager. Klik op Toevoegen in het venster ROI Manager om elke regel toe te voegen aan de manager zoals deze is geselecteerd. Als u alle regels in een map wilt opslaan, klikt u in de ROI Manager op Deselecteer | Meer en klik op Opslaan. Haal uit de ROI Manager de lengtewaarde van elke regel(Meten)uit de resultatentabel.
        OPMERKING: Vergeet niet om de schaal van de afbeelding in te stellen om de waarde in de gewenste eenheden te verkrijgen door op Analyseren en schaal instellente klikken . Standaard is de eenheid van de afbeelding in pixels.
  8. Meting van de snelheid van de bloedplaatjes
    OPMERKING: De snelheid van de bloedplaatjes wordt berekend op basis van de video-opname van fluorescerende bloedplaatjes die in het vat stromen over 10-20 s. Een eerste beeldbehandeling wordt uitgevoerd om cyclisch herhaalde lijnscangegevens te verkrijgen. Beweging leidt tot strepen waarvan de hoek afhankelijk is van de snelheid, waardoor de berekening ervan mogelijk is. Hier werd de snelheid berekend met een methode die de Radontransformatie gebruikt, die robuuster is dan de klassieke Singular Value Decomposition (SVD) -methode15.
    1. Beeldbehandeling met ImageJ
      1. Open de film met ImageJ. Pas een Gaussiaanse vervagingsfilter toe door te klikken op Proces | Filters, selecteer Gaussiaanse vervagingen pas Sigma (Radius) toe: 2.00. Kies een klein gebied om de stroom te meten en traceer 3 aangrenzende lijnen die de stroomrichting volgen.
        OPMERKING: Vergeet niet om elke regel op te slaan met behulp van de ROI Manager door te klikken op | analyseren Hulpmiddelen | ROI-manager. Klik op Toevoegen in het ROI Manager-venster om elke regel toe te voegen en op te slaan; klik eerst op Deselecteer | Meer en klik vervolgens op Opslaan.
      2. Gebruik ImageJ line-scan software, bouw een kymograaf voor elke regel door te klikken op Image | Stapels; selecteer Reslice en pas de volgende parameters toe: Uitvoerafstand (micron): 1.000 / Aantal segmenten: 1 / Interpolatie vermijden. Sla de resulterende ruimte-tijdafbeeldingen op.
        OPMERKING: De resulterende afbeelding toont strepen die overeenkomen met de lineaire beweging van de bloedplaatjes in de bloedstroom in de loop van de tijd. De hoek van een streep is een functie van de snelheid.
    2. Snelheidsmeting met Matlab- of GNU Octave-software
      OPMERKING: De snelheid van de bloedplaatjes in de bloedstroom wordt geschat op basis van de ruimte-tijdbeelden met behulp van een computationele analysemethode op basis van de Radontransformatie beschreven door Drew en medewerkers15. De beschrijving van deze wiskundige methode valt buiten het bestek van deze recensie en de lezer wordt verwezen naar de publicatie van Drew et al. voor details over de berekening15. Zowel de Matlab-code als meer informatie zijn beschikbaar op hun website https://www.drew-lab.org/code.
      1. Open de code met matlab- of GNU Octave-software.
        OPMERKING: De code kan aanpassing vereisen volgens het gewenste onderzoek.
      2. Haal de waarde uit de 3 ruimte-tijdafbeeldingen, die overeenkomen met de aangrenzende lijnen die in hetzelfde vatgedeelte zijn getekend. Bereken de gemiddelde waarde van de bloedplaatjesstroomsnelheid voor dit deel van het vat.
        OPMERKING: Vergeet niet om het resultaat om te zetten in de juiste maateenheid (bijv. μm/s).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol werd de fluorescerende tracer, Qtracker-655, intraveneus toegediend om anastomosed merg sinusoïde vaten in het schedelbeenmerg en de stroomrichting zoals weergegeven door de pijlen in beeld te brengen(Figuur 4A, links). Met behulp van mTmG-muizen werden eGFP-fluorescerende bloedplaatjes geregistreerd over 20 s in elke vaattak, en hun snelheid werd gemeten met behulp van ImageJ en GNU Octave software(Figuur 4A,rechts). Let op de hetero...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De mechanismen van bloedplaatjesvorming zijn sterk afhankelijk van de beenmergomgeving. Vandaar dat intravitale microscopie een belangrijk hulpmiddel in het veld is geworden om het proces in realtime te visualiseren. Muizen met fluorescerende megakaryocyten kunnen worden verkregen door muizen die de Cre-recombinase in megakaryocyten tot expressie brengen, te kruisen met floxed reportermuizen die een voorwaardelijke fluorescerende genexpressiecassette bevatten. Hier werden mTmG reporter muizen gebruikt (B6.129(Cg)-Gt(...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Oostenrijk) bedanken voor zijn deskundige advies over twee-fotonmicroscopie-experimenten op het moment dat we de techniek in het laboratorium vestigden, en Yves Lutz van het Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrijk) voor zijn expertise en hulp met de twee-fotonenmicroscoop. We danken ook Jean-Yves Rinkel voor zijn technische hulp en Ines Guinard voor de tekening van het schema in figuur 1. Wij danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) voor haar steun bij de aankoop van de twee-fotonenmicroscoop. AB werd ondersteund door postdoctorale beurzen van Etablissement Français du Sang (APR2016) en van Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GNU Octave softwareGNU Projecthttps://www.gnu.org/software/octave/
 Histoacryl 5 x 0, 5 mLBraun1050052injectable oplossing van chirurgische lijm
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunesLeica Microsystems
ImageJGNU projectMinimale vereiste versie
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mLBoehring03661103003199oogbescherming
Leica SP8 MP DIVE microscoop uitgerust met een 25x waterobjectief, numerieke opening van 0,95Leica Microsystemsgelijktijdige excitatie van AlexaFluor-488 en Qtracker-655
MatlabMathWorkshttps://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 gLaboratoires T.V.M.03700454505621Blauwe en gele siliconen tandpasta
Picodent twinsin speedRotec13001002
Qtracker 655 vasculair labelInvitrogenQ21021MPinjecteerbare oplossing
Resonant scanner, 8 of 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mLBayer04007221032311
Superglue gelom de ring aan het bot te lijmen
Surflo IV katheter - Blauw 22 GTerumoSR-OX2225C1
Ti:Saph pulserende laser (Coherent) (femtoseconde)Coherent

Referenties

  1. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  2. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
  3. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
  4. Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
  5. Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
  6. Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
  7. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  8. Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).
  9. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  11. Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
  12. Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
  13. Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361(2012).
  14. Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127(2017).
  15. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  16. Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
  17. Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
  18. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
  19. Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
  20. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).
  21. Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).
  22. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12(2018).
  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Beeldvorming van megakaryocytenproplateletvormingsinusoïdale vatenplaatjessnelheidin vivo microscopiefluorescente tracerschirurgische ingrepen in het beenmergbloedstroomkrachten
In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.