Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62519

⸱

11 mei 2021

 ,  ,  , 
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Samenvatting

Driedimensionaal (3D) bioprinten maakt gebruik van op hydrogel gebaseerde composieten (of biomateriaalinkten) die in een patroon worden afgezet en een substraat vormen waarop cellen worden afgezet. Omdat veel biomateriaalinkten potentieel cytotoxisch kunnen zijn voor primaire cellen, is het noodzakelijk om de biocompatibiliteit van deze hydrogelcomposieten te bepalen voordat ze worden gebruikt in kostbare 3D-weefselmanipulatieprocessen. Sommige 3D-kweekmethoden, waaronder bioprinting, vereisen dat cellen worden ingebed in een 3D-matrix, waardoor het moeilijk is om de cellen te extraheren en te analyseren op veranderingen in levensvatbaarheid en biomarkerexpressie zonder mechanische schade uit te lokken. Dit protocol beschrijft als proof of concept, een methode om de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) ingebed agarosecomposiet te beoordelen, vervaardigd in een 24-well kweeksysteem, met muisbeenmerg-afgeleide mestcellen (BMMCs) met behulp van flowcytometrische assays voor cel levensvatbaarheid en biomarkerexpressie.

Na 18 uur blootstelling aan de CNC/agarose/D-mannitol matrix was de levensvatbaarheid van bmmc ongewijzigd zoals gemeten door propidiumjodide (PI) permeabiliteit. BMMCs gekweekt op het CNC/agarose/D-mannitol substraat bleken echter hun expressie van de hoge-affiniteit IgE receptor (FcεRI) en de stamcelfactor receptor (Kit; CD117), hoewel dit niet afhankelijk lijkt te zijn van de hoeveelheid CNC in het bioinkcomposiet. De levensvatbaarheid van BMMCs werd ook beoordeeld na een tijdsbehandeling met hydrogelsteigers die werden vervaardigd uit een commerciële biomateriaalinkt bestaande uit fibrillaire nanocellulose (FNC) en natriumalginaat met behulp van een 3D-extrusiebioprinter. Gedurende een periode van 6-48 uur hadden de FNC/alginaatsubstraten geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van de BMMCs zoals bepaald door flowcytometrie en microtitertests (XTT en lactaatdehydrogenase). Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om snel de biochemische compatibiliteit van kandidaat-biomateriaalinkten te screenen op hun nut als 3D-steigers voor post-print zaaien met mestcellen.

Inleiding

De recente interesse in 3D-kweeksystemen en 3D-bioprinting heeft de aandacht gevestigd op hydrogels en hydrogelcomposieten. Deze composieten dienen als viskeuze maar poreuze biomimetica en kunnen worden samengesteld uit maximaal 99% watergehalte in gewicht, wat vergelijkbaar is met biologische weefsels1,2,3. Deze kenmerken van hydrogelcomposieten maken daardoor de groei van cellen mogelijk zonder hun levensvatbaarheid en functie te beïnvloeden. Een van die composieten is kristallijne nanocellulose (CNC), die is gebruikt als versterkend materiaal in hydrogelcomposieten, celsteigers bij de ontwikkeling van biomateriaalimplantaten en in tweedimensionale (2D) en 3D in vitro celcultuur4,5. Voor het grootste deel zijn matrices samengesteld uit CNC niet openlijk cytotoxisch voor menselijke cornea-epitheelcellen6, intestinale epitheelcellen7, van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen8 of neuronachtige cellen9. Metabole activiteit en proliferatie van van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen neemt echter af in correlatie met de verhoogde viscositeit van op hout gebaseerde nanocellulosecomposieten, wat suggereert dat de samenstelling van de matrix zorgvuldig moet worden getest op zijn schadelijke effecten op celfuncties8.

Evenzo kan CNC ontstekingsreacties in macrofagen induceren bij internalisatie, wat ernstige gevolgen kan hebben in 3D-immuuncelkweeksystemen10,11. In feite zijn er zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe CNC andere immuuncelreacties kan beïnvloeden, met name allergische ontstekingsreacties die worden geïnitieerd door mestcellen. Mestcellen zijn gegranuleerde leukocyten die de IgE-receptor met hoge affiniteit, FceRI, tot expressie brengen, verantwoordelijk voor het activeren van ontstekingsreacties op allergenen. Hun proliferatie en differentiatie zijn afhankelijk van stamcelfactor (SCF), die de tyrosinereceptor Kit bindt. Mestcellen zijn afgeleid van beenmergvoorlopercellen die de circulatie binnenkomen en vervolgens perifeer migreren om zich alomtegenwoordig te verspreiden in alle menselijke weefsels12. Omdat mestcellen functioneren in een 3D-weefselomgeving, zijn ze een ideale immuuncelkandidaat voor het bestuderen van immunologische processen in in vitro 3D-weefselmodellen. Tot op heden is er echter geen levensvatbaar in vitro 3D-weefselmodel dat mestcellen bevat.

Vanwege de zeer gevoelige aard van mestcellen en hun neiging om pro-inflammatoire reacties op externe stimuli uit te lokken, is een zorgvuldige overweging van de 3D-matrixbestanddelen en de bioprintmethode voor het introduceren van mestcellen in de 3D-steiger vereist, zoals verder besproken. Weefselconstructies kunnen worden gebiofabriceerd uit twee brede categorieën biomaterialen, d.w.z. bioinkten en biomateriaalinkten. Het onderscheid ligt in het feit dat bioinks celbeladen hydrogelcomposieten zijn, terwijl biomateriaalinkten hydrogelcomposieten zijn die verstoken zijn van cellen, zoals gedefinieerd door Groll et al.13,14. Vandaar dat 3D-constructies geprint met bioinks cellen bevatten die vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, terwijl 3D-constructies die zijn geprint met biomateriaalinkten moeten worden gezaaid met cellen na het printen. De biofabricage van kweeksteigers van op hydrogel gebaseerde bioinkten /biomateriaalinkten wordt meestal uitgevoerd met behulp van extrusie 3D-bioprinters, die de bioink / biomateriaalinkt onder druk extruderen door een mondstuk op microschaal via een pneumatisch of mechanisch aangedreven zuiger14. Extrusiebioprinters fabriceren 3D-steigers door de bioink af te zetten in 2D-dwarsdoorsnedepatronen die achtereenvolgens op elkaar worden gestapeld in een 'bottom-up' benadering.

Om compatibel te zijn met extrusiebioprinting, moet de op hydrogel gebaseerde bioink/biomateriaalinkt thixotrope (afschuifverdunning) eigenschappen bezitten, waarbij de samenstellende hydrogelpolymeren van de bioink/biomateriaalinkt als een vloeistof door een microkanaalmondstuk stromen wanneer ze worden blootgesteld aan schuifspanning, maar terugkeren naar een viskeuze, gelachtige toestand bij verwijdering van de schuifspanning15 . Vanwege hun hoge watergehalte moeten de polymeren van op hydrogel gebaseerde bioinks / biomateriaalinkten fysiek of covalent worden verknoopt om de architectuur en structurele integriteit van de 3D-biogeprinte structuur te behouden. In het geval van celbeladen bioinks worden de cellen direct blootgesteld aan chemische spanningen tijdens het crosslinking-proces. Het proces van het extruderen van cellen ingekapseld in de bioink hydrogel matrix onderwerpt de cellen ook aan schuifspanning, wat kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid en / of celdood. Zodra het 3D-weefselmodel is gebioprint, is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de niveaus van cytotoxiciteit die worden opgewekt door de hydrogelmatrix zelf en de extrusie- en crosslinkingprocessen, respectievelijk. Dit is met name een uitdaging in de context van 3D-steigers waar de cellen vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, waardoor het moeilijk wordt om de cellen te verwijderen voor latere analyses, wat schadelijk zou zijn voor de levensvatbaarheid van mestcellen.

Een zachtere benadering van het genereren van 3D-weefselconstructies die mestcellen bevatten, omvat het zaaien van de cellen in voorgedrukte, poreuze biomateriaalinkt 3D-steigers uit een celcultuursuspensie, die gebruik maakt van het aangeboren vermogen van mestcellen om van de circulatie naar perifere weefsels te migreren. De voordelen van deze celzaaibenadering zijn tweeledig: (i) de mestcellen worden niet onderworpen aan afschuiving en chemische spanningen van respectievelijk de extrusie- en crosslinkingprocessen, en (ii) de cellen kunnen gemakkelijk uit de 3D-steiger worden verwijderd na blootstelling door zacht wassen voor analyse zonder hun levensvatbaarheid nadelig te beïnvloeden. Het extra voordeel van het zaaien en analyseren van de levensvatbaarheid van cellen op 3D-biogeprinte, poreuze hydrogel-steigers in tegenstelling tot 2D-hydrogelschijven is dat de 3D-biogeprinte hydrogelsteigers de topografische kenmerken op microschaal van in vivo weefsels, die niet in bulk aanwezig zijn, 2D-planaire hydrogelschijven recapituleren. Deze aanpak is een geschikte, snelle en kosteneffectieve aanpak om de potentieel catastrofale cytotoxische effecten van kandidaat-bioink hydrogelmatrices op mestcellen en andere immunologische cellen te bepalen voorafgaand aan investeringen in dure 3D-weefselmanipulatie-experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol bestaat uit vijf secties: (1) isolatie van muisbeenmerg en differentiatie van van het beenmerg afgeleide mestcellen van muizen (BMMCs), (2) fabricage van CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substraten in een 24-well systeem en kweek van BMMCs op de substraten, (3) verwijdering van BMMCs uit de CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substraten en analyse van levensvatbaarheid en biomarker expressie met behulp van flowcytometrie, (4) 3D-bioprinting van hydrogelsteigers uit een in de handel verkrijgbare fibrillaire nanocellulose (FNC)/natriumalginaatcomposiet biomateriaalinkt, en (5) kweek van BMMCs op FNC/natriumalginaathydrogelsteigers en analyse van de levensvatbaarheid met behulp van flowcytometrie, XTT en lactaatdehydrogenase (LDH) microtitertests.

1. Generatie van de BMMC-cultuur

OPMERKING: Muizen werden geëuthanaseerd door CO2-verstikking na isofluraan-anesthesie. Het scheenbeen en het dijbeen werden geïsoleerd en het hele beenmerg werd geoogst. Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en het beleid van de Canadian Council on Animal Care met goedkeuring van de Health Science Animal Care and Use Committee voor de Universiteit van Alberta.

  1. Bereid het volledige RPMI-1640 kweekmedium door de supplementen in tabel 1 toe te voegen aan de aangegeven eindconcentraties. Stel de pH van het medium in op 7,4-7,6 met NaOH, filtersteriliseer met behulp van een flestopfilter voor eenmalig gebruik (poriegrootte van 0,2 μm) en bewaar tot 2 maanden bij 4 °C in het donker.
  2. Verkrijg dijbenen van muizen in overeenstemming met de protocollen en procedures van de lokale University Animal Care Committee.
    OPMERKING: In deze studie werden dijbenen geïsoleerd uit C57BL/6-muizen, maar elke stam kan worden gebruikt als deze relevant is voor het onderzoek.
  3. Verwijder met een schaar huid en spieren van het heupgewricht en trek vervolgens voorzichtig het dijbeen door iets uit de heupkom te draaien (figuur 1). Pas op dat u de heupkop niet afbreekt. Knip het scheenbeen weg van het dijbeen bij de mediale fabella met een schaar. Verwijder de poot door net boven het calcaneum te snijden en weg te gooien.
  4. Gebruik een scalpel om huid en kraakbeen uit dijbeen- en scheenbeenstukken te verwijderen. Maak met een schaar een schone snede aan elk uiteinde van het dijbeen en scheenbeen, waardoor het rode beenmerg binnenin wordt blootgesteld. Verwijder indien nodig het kuitbeen op dit punt, maar merk op dat het kan helpen bij de manipulatie van het scheenbeen tijdens het spoelen van het beenmerg.
  5. Bereid een naald van 26 G voor met een luer-lock spuit van 5 ml en vul met ongeveer 5 ml volledige media die zijn bereid zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: Op dit punt kan onvolledige RPMI zonder de additieven ook worden gebruikt om reagentia te besparen.
  6. Houd het dijbeen of scheenbeen vast met een tang, steek de naald in het ene uiteinde van het bot en druk zachtjes op de spuit. Houd het bot boven een steriele conische buis van 50 ml en injecteer voorzichtig ongeveer 5 ml medium in het bot, waarbij u enige druk uitoefent. Observeer stukjes beenmerg vallen uit het andere uiteinde van het bot als dunne rode linten en in de conische buis.
  7. Draai de aspiraten naar beneden en resuspend in volledig medium, of breng rechtstreeks over in een steriele weefselkweekkolf van T175 cm2 met 50 ml volledig RPMI-1640-medium. Onderhoud de aspiraten in volledig RPMI-1640 medium met 30 ng/ml muis recombinant interleukine (IL)-3.
  8. Na 1 dag observeer je de culturen onder een lichtmicroscoop. De cultuur zal bestaan uit een heterogene populatie van cellen van verschillende vormen en groottes en nog grotere stukken beenmerg. Voer celculturen door elke 3-5 dagen 15 ml vers medium toe te voegen met behulp van het volledige RPMI-1640-medium zoals hierboven beschreven, en zorg ervoor dat de celdichtheid nooit hoger is dan 1 × 106 cellen / ml. Draai eenmaal per week de cellen af met 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, resuspend in vers volledig RPMI-1640 medium en splits 1:4 in 50 ml medium in verse T175-kolven.
  9. Bepaal na 4 weken de celzuiverheid door de oppervlakte-expressie van CD117 (Kit) en FceRI-receptoren te meten door middel van flowcytometrie zoals hieronder beschreven (rubriek 3.2).
    OPMERKING: Na 4 weken moet 99% van de cellen dubbelpositief zijn voor CD117 (Kit) en FcεRI.
  10. Onderhoud na 4 weken en later de BMMC's met 20 ng/ml IL-3 in volledig RPMI-1640 medium. Na ongeveer 6 weken zullen de cellen stoppen met delen en hoeft ze niet meer gesplitst te worden. Voer de culturen om de 3-5 dagen, pelleteer de cellen eenmaal per week door centrifugatie en resuspend in vers volledig RPMI-1640-medium.

2. Fabricage van de CNC / agarose / D-mannitol hydrogel substraten en BMMC cultuur

  1. Voeg in een glazen fles 0,2 g agarosepoeder toe aan fosfaatbuffered saline (PBS) (2% w/v) tot een eindvolume van 10 ml en kook gedurende 1 minuut bij 100 °C om op te lossen.
  2. Los 2,5 g CNC-poeder in PBS op tot een eindvolume van 10 ml om een mengsel van 25% met v te bereiden.
  3. Los 2 g CNC-poeder op in PBS tot een eindvolume van 10 ml om een mengsel van 20% w/v te bereiden en verdun het mengsel van 20% w/v serieel om 10, 5 en 2% w/v CNC-mengsels te bereiden.
  4. Verwarm de 25, 20, 10, 5 en 2% w/v CNC-mengsels gedurende 10 minuten tot 37 °C (figuur 2A).
  5. Voeg 0,46 g D-mannitol toe aan de hete agarose-oplossing (4,6% w/v) en los op.
  6. Meng de voorverwarmde 25, 20, 10, 5 en 2% w/v CNC-PBS mengsels met de hete agarose/D-mannitol oplossing in afzonderlijke conische buizen in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke CNC-concentraties van 12,5, 10, 5, 2,5 en 1% w/v in de hydrogelmengsels te verkrijgen.
  7. Voeg snel 500 μL/put van de bovenstaande oplossingen bereid in stap 2.6 in quadruplicaat toe aan een kweekplaat met 24 putten en laat 30 minuten bij kamertemperatuur staan om polymerisatie te vergemakkelijken (figuur 2B).
  8. Leg voorzichtig 1000 μL van de BMMC-suspensie met een dichtheid van 1,1 × 106 cellen / ml bovenop de hydrogelsubstraten met een micropipettor en vermijd het aanraken van de gel met de punt van de pipet, omdat dit het geloppervlak zal beschadigen en deeltjes zal genereren.
  9. Incubeer de BMMC's op de hydrogelsubstraten in een steriele incubator (5% CO2, bevochtigde atmosfeer) bij 37 °C gedurende 18 uur.

3. Flowcytometrische analyses

  1. Flowcytometrische analyse van de levensvatbaarheid van BMMC's via PI-uitsluiting
    1. Verwijder voorzichtig het kweekmedium met BMMCs van de bovenkant van de CNC / agarose / D-mannitol, vermijd de gel en breng de cellen over in een microfugebuis van 1,5 ml.
    2. Was de BMMCs tweemaal met PBS (pH 7,4) met 0,5% w/v runderserumalbumine bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspend in 180 μL PBS-0,5% w/v BSA tot een uiteindelijke dichtheid van 1,5 × 106 cellen/ml. Breng de cellen over op een 96 put ronde bodemplaat.
      OPMERKING: Filter-steriliseer alle PBS-0,5% w/v BSA-oplossingen tweemaal met behulp van een spuitfilter ter grootte van een poriegrootte van 0,2 μm en bewaar bij 4 °C.
    3. Voeg 20 μL PBS-0,5% w/v BSA, of 10x PI (100 μg/ml) bereid in PBS-0,5% w/v BSA, toe aan de cellen tot een eindconcentratie van 10 μg/ml, en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C of 15 min bij kamertemperatuur in het donker. Verkrijg fluorescentiegegevens met behulp van een flowcytometer uitgerust met een Argon-ionlaser (488-514 nm) en bandpassfilter om detectie van fluorescentie-emissie bij 578 nm mogelijk te maken. Verkrijg 20.000 gebeurtenissen per monster bij een stroomsnelheid van 30 μL/min bij kamertemperatuur. Analyseer de gegevens zoals hieronder beschreven (secties 3.2.7-3.2.10).
  2. Flowcytometrische analyse van BMMCs voor Kit (CD117) en FcεRI oppervlaktereceptorexpressie
    1. Verwijder voorzichtig het kweekmedium met BMMCs van de bovenkant van de CNC / agarose / D-mannitol, vermijd de gel en breng de cellen over in een microfugebuis van 1,5 ml.
    2. Was BMMCs tweemaal met gefilterde PBS-0,5% BSA bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspend in 180 μL PBS met 0,5% w/v BSA (1,5 × 106 cellen/ml). Breng de geresuspendeerde cellen over naar een 96-wells ronde bodemplaat.
    3. Voeg 20 μL 10x antilichaamwerkoplossingen toe aan de cellen om een eindconcentratie van respectievelijk 0,06 μg/ml CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) en 0,06 μg/ml FcεRIα-allophycocyanine (APC) te bereiken.
      OPMERKING: De 10x antilichaam werkende oplossingen moeten worden bereid in filter-gesteriliseerde PBS-0,5% w / v BSA.
    4. Voeg 20 μL 10x isotypecontrolewerkoplossingen die rat IgG2b κ isotype control-PE of Armeense hamster IgG isotype control-APC bevatten, toe aan afzonderlijke putjes met cellen die niet zijn gekleurd met een van de antilichaam-fluorofoorconjugaten in stap 3.2.3.
      OPMERKING: De isotypecontroles, rat IgG2b κ isotype control-PE en Armeense hamster IgG isotype control-APC dienen om te controleren op niet-specifieke hechting van antilichamen aan de BMMC. Omdat BMMCs geen hoge niveaus van FcR uitdrukken, wordt er zelden hoge achtergrondfluorescentie gedetecteerd met isotypecontroleantistoffen. Bereid de 10x isotype controle werkoplossingen voor in filter-gesteriliseerde PBS-0,5% w/v BSA.
    5. Incubeer de 96-well ronde bodemplaat gedurende 1 uur bij 4 °C in het donker.
    6. Was de cellen door 200 μL verse PBS-0,5% w/v BSA-buffer aan elke put toe te voegen en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap nogmaals. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de celkorrel aan te raken; laat wat bovennatuurlijk achter om ervoor te zorgen dat de celkorrel ongestoord blijft.
    7. Resuspend cellen na het wassen in 100 μL van 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v natriumazide in PBS (pH 7,4) dat tweemaal steriel is gefilterd met een spuitfilter ter grootte van een poriegrootte van 0,2 μm. Verkrijg fluorescentiegegevens in de PE- en APC-detectorkanalen met behulp van een flowcytometer, zoals hierboven beschreven in stap 3.1.3.
    8. Analyseer gegevens met behulp van software die in staat is om flowcytometrische gegevensbestanden met de extensie ".fcs" te bekijken en te analyseren.
    9. Begin de analyse door voorwaartse spreiding (FSC) langs de x-as en zijverstrooiing (SSC) langs de y-as uit te zetten, en poort voor de geconserveerde celpopulatie met een FSC-bereik van log10 1,5-5,0 en een SSC-bereik van log10 0,75-3,25 in de onbehandelde en onbevlekte cellen zoals weergegeven in figuur 3A (i), (ii).
      OPMERKING: Dit dient om ervoor te zorgen dat celresten met lage FSC- en SSC-waarden uit de analyse worden verwijderd. Mestcellen zijn normaal gesproken zeer korrelige (hoge SSC) cellen en grote (hoge FSC) in vergelijking met andere immunologische celtypen, zoals monocyten en lymfocyten.
    10. Genereer vervolgens FSC vs. SSC-puntplots en histogramprofielen van onbehandelde monsters die zijn gekleurd met de kleurstof, antilichamen of isotypecontroles en verkrijg de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) in de PE- of APC-kanalen volgens het emissiespectrum van het specifieke antilichaam-fluorofoorconjugaat of de gebruikte kleurstof. Pas dezelfde set poorten en parameters toe op alle BMMC-monsters die zijn geïncubeerd met verschillende CNC / agarose / D-mannitol-substraten en gekleurd met de bijbehorende isotypecontroles, antilichamen of kleurstof; MFI's verkrijgen.
      OPMERKING: In wezen moeten de FSC vs SSC-puntplots van de onbehandelde gekleurde monsters niet te onderscheiden zijn van onbehandelde / onbevlekte monsters, verkregen in stap 3.2.9, om ervoor te zorgen dat de kleuringsprocedure de celgrootte (gemeten door FSC) of granulariteit (gemeten door SSC) niet verandert (figuur 3A (i), (ii)).
    11. Bereken gemiddelde MFI's en standaard fout van gemiddelde (SEM) voor elk monster uit 4 onafhankelijke experimenten gevolgd door het genereren van grafieken met behulp van een statistisch analysesoftwarepakket.
    12. Bereid histogramoverlays voor in de flowcytometrische data-analysesoftware (figuur 3B, 4A (ii), B (ii)).

4.3D Bioprinting van FNC/natriumalginaat hydrogel substraten

OPMERKING: De 3D-bioprinter die in deze studie wordt gebruikt, is een pneumatisch extrusiesysteem dat is uitgerust met twee onafhankelijke, temperatuurgecontroleerde printkoppen. De biomateriaalinkt die wordt gebruikt om de hydrogelsteigers te 3D-bioprinten, is geformuleerd uit (a) sterk gehydrateerde fibrillaire nanocellulose (FNC), die morfologisch vergelijkbaar is met collageen, (b) natriumalginaat en (c) D-mannitol. Het wordt geleverd als een steriele hydrogel-suspensie in patronen van 3 ml waaraan steriele luer-lock conische bioprintmondstukken (22, 25 of 27 G) kunnen worden bevestigd.

  1. Gebruik dit protocol met de printkoppen en printbed bij kamertemperatuur, waarbij de kamertemperatuur 20-25 °C is.
  2. Bewaar de biomateriaal inktcartridges bij 4 °C om de stabiliteit van het hydrogelcomposiet te behouden. Voordat u begint met 3D-bioprinten, verwijdert u een patroon (3 ml) uit de koelkast en laat u deze op kamertemperatuur balanceren.
  3. Installatie van een Bioink cartridge op de INKREDIBLE+ 3D Bioprinter
    1. Verwijder de blauwe eindkappen van de 3 ml biomateriaalinktpatroon (figuur 5B(i)) en bevestig een steriel 22 G (blauw) conisch bioprintmondstuk op het luer-lock uiteinde van de Bioink cartridge.
      OPMERKING: Het is essentieel om het gewenste conische bioprintmondstuk op de bioinkcartridge aan te brengen voordat u de cartridge installeert en de daaropvolgende kalibratiestappen uitvoert, omdat dit niet zal resulteren in een onjuiste kalibratie van de z-as van de 3D-bioprinter.
    2. Sluit de luchtdruktoevoerslang voor printkop 1 (PH1, links) aan op het andere uiteinde van de cartridge en steek de cartridge met het aangesloten conische bioprintmondstuk in de verticale sleuf van PH1 (figuur 5A(ii)).
    3. Plaats de cartridge stevig in PH1 met het conische bioprintmondstuk dat zich uitstrekt tot onder de printkop. Draai de schroef op PH1 met de klok mee vast totdat deze vingerdicht is om de Bioink-cartridge op zijn plaats te vergrendelen. Merk op dat 3D-bioprinting kan worden uitgevoerd met PH2 leeg gelaten.
  4. Kalibreren van de x-y-z assen van de 3D bioprinter
    1. Schakel de 3D-bioprinter in en start de bioprintersoftware op een pc die via een USB 2.0-kabel op de 3D-bioprinter is aangesloten.
    2. Klik in de software op de knop VERBINDEN om de software te synchroniseren met de 3D-bioprinter.
      OPMERKING: De synchronisatie is geslaagd wanneer de ultraviolet lichtgevende diodelampen van de printkop aan en uit gaan en de HEPA-filterventilator weer in- en uitschakelt. De software moet worden gesynchroniseerd met de 3D-bioprinter voordat de bioprinterassen en de kalibratie van het startpunt worden geplaatst, zoals beschreven in de volgende stappen.
    3. Let op vier opties in het hoofdbedieningsmenu van de 3D-bioprinter: (i) BIOPRINT VOORBEREIDEN, (ii) BIOPRINT, (iii) MENU HULPPROGRAMMA'S en (iv) STATUSSCHERM. Selecteer de optie BIOPRINT VOORBEREIDEN , scrol omlaag naar en selecteer de optie HOME AXES .
      OPMERKING: De 3D-bioprinter beweegt vervolgens de printkop naar achteren en naar links om respectievelijk de y- en x-as te kalibreren. Daarna, met de printkoppen gepauzeerd in de uiterst linkse positie, zal de bioprinter het printbed optillen totdat de z-as kalibratieschakelaar (gelegen op het printbed) contact maakt met de conische bioprinting nozzle geïnstalleerd op printkop 1
    4. Na een succesvolle kalibratie van de x-y-z-assen , let op de lichte verlaging van het printbed en de verplaatsing van de printkoppen tot boven het middelpunt van het printbed (Figuur 5A(i)).
  5. Uitgangspunt kalibratie van de bioprinter voor bioprinting in 24-well platen
    1. Verwijder een steriele kweekplaat met 24 putten uit de verzegelde plastic verpakking en markeer een stip van in het middenpunt van put D1 aan de onderkant van de plaat met een permanente marker. Verwijder het plaatdeksel en plaats de 24-well cultuurplaat op het printbed met put D1 in de linkervoorhoek van het printbed.
    2. Selecteer in het hoofdmenu van het besturingselement DE OPTIE HULPPROGRAMMA'S MENU en selecteer vervolgens AS VERPLAATSEN. Beweeg de printkoppen in stappen van 1 mm langs de x- en y-as totdat het conische bioprintmondstuk van PH1 direct over de stip onder put D1 is gemarkeerd. Verfijn indien nodig de positie van het conische bioprintmondstuk over de punt door de printkoppen in stappen van 0,1 mm te bewegen.
    3. Noteer de x- en y-coördinaten van het conische bioprintmondstuk direct boven het midden van put D1, zoals aangegeven op het bedieningspaneelscherm van de 3D-bioprinter.
      OPMERKING: In het geval van de HIER gebruikte INKREDIBLE+ 3D-bioprinter zijn de x- en y-coördinaten als volgt: x : -46,5 en y : -27,5. Deze coördinaten dienen als uitgangspunt in het midden van put D1 voor bioprinting in een 24-well plaat.
    4. Til vervolgens het printbed in stappen van 1 mm op totdat de bodem van put D1 bijna het conische bioprintmondstuk raakt dat in printkop 1 is geïnstalleerd. Verfijn de beweging van het printbed indien nodig in stappen van 0,1 mm (figuur 5A(ii)). Selecteer vervolgens in het MENU HULPPROGRAMMA'S de optie Z-AXIS KALIBRATIE en selecteer en bevestig verder de optie STORE Z-KALIBRATIE .
    5. Ga terug naar het hoofdmenu en selecteer de optie BIOPRINT VOORBEREIDEN . Scrol omlaag naar en selecteer de optie Z KALIBREREN .
      OPMERKING: De 3D-bioprinter verlaagt nu het printbed na het succesvol uitvoeren van de z-askalibratie (figuur 5A(iii)).
  6. 24-well plate G-code bestand bijwerken met correcte beginpuntcoördinaten
    1. Open het meegeleverde 24-well plate geometric code (G-code) bestand in de bioprinter software (Supplemental File 1).
      OPMERKING: Dit 24-well G-code bestand codeert het afdrukken van 2-laagse 5 x 5 x 1 mm rechtlijnige constructies in elke put (Figuur 5C(i),(iii)). De meegeleverde G-code bestanden kunnen worden gebruikt met elke 3D bioprinting software.
    2. Merk op dat regel 1 van het G-code bestand luidt G0 X-50.0 Y-33.5 ; Middenpositie van D1 goed. Werk de x- en y-coördinaten op regel 1 bij met de waarden die zijn verkregen in stap 4.5.3, d.w.z. regel 1 moet nu G0 X-46.5 Y-27.5 lezen; Middenpositie van D1 goed. Sla het bestand op onder een nieuwe naam.
      OPMERKING: Deze procedure dient om het G-codebestand te kalibreren, zodat het afdrukken begint in het midden van put D1 op basis van de x,y-coördinaten van de specifieke 3D-bioprinter die wordt gebruikt. Deze aanpak kan worden gebruikt om het 24-well plaat G-code bestand te kalibreren voor het printen met elke extrusie 3D bioprinter. Voor het doel van deze studie werd alleen de linkerhelft van de 24-putplaat, d.w.z. putten A1-3, B1-3, C1-3 en D1-3, afgedrukt. Een apart G-code bestand dat het afdrukken van 2-laagse 5 x 5 x 1 mm rechtlijnige constructies in een 3 x 4 raster codeert, is ook aanwezig (Aanvullend bestand 2, Figuur 5C (ii)).
  7. Aanpassing van de extrusiedruk voor printkop 1 (PH1)
    1. Zorg ervoor dat de pneumatische pomp goed is aangesloten op de achterste luchtinlaatpoort van de INKREDIBLE+ 3D-bioprinter en schakel de pneumatische pomp in.
    2. Trek de voorwaartse bedieningsknop aan de rechterkant van de INKREDIBLE+ 3D-bioprinter uit.
      OPMERKING: De voorwaartse bedieningsknop past de druk voor PH1 aan, terwijl de achterste bedieningsknop de druk voor PH2 aanpast.
    3. Let op de digitale manometers voor PH1 en PH2 aan de voorkant van de bioprinter die elk dicht bij 0 kPa lezen. Draai de voorwaartse bedieningsknop langzaam met de klok mee totdat de druk die op de linkermeter voor PH1 is aangegeven, 12 kPa bereikt (figuur 5A(iii)).
    4. Plaats een gevouwen tissuepapier of een stuk waterdichte, afdichtingsfolie onder het printmondstuk van de geïnstalleerde cartridge, waarbij u voorzichtig bent dat u het afdrukmondstuk niet aanraakt.
    5. Selecteer in het hoofdbedieningsmenu van de 3D-bioprinter de optie BIOPRINT VOORBEREIDEN.
    6. Navigeer naar en selecteer PH1 INSCHAKELEN. Merk op dat de biomateriaalinkt uit het printmondstuk begint te extruderen. Verhoog indien nodig de extrusiedruk door de bedieningsknop met de klok mee te draaien totdat de biomateriaalinkt in een continu filament is geëxtrudeerd en noteer de nieuwe drukinstelling. Werk snel om verspilling van biomateriaalinkt te voorkomen.
    7. Selecteer PH1 UITSCHAKELEN om extrusie van de biomateriaalinkt te stoppen, verwijder het tissuepapier of de film met de geëxtrudeerde biomateriaalinkt van het printbed en sluit de bioprinterdeur.
      OPMERKING: De 3D-bioprinter schakelt automatisch de luchtdruktoevoer naar PH1 in tijdens het afdrukken volgens de instructies van het G-codebestand.
  8. 3D bioprinten van rechtlijnige hydrogel substraten in een 24-well plaatformaat
    1. Selecteer in het hoofdbedieningsmenu van de 3D-bioprinter de optie MENU HULPPROGRAMMA'S. Navigeer naar en selecteer SD PRINT UITSCHAKELEN, waarmee de bioprintersoftware G-codebestanden naar de 3D-bioprinter kan verzenden om te printen.
    2. Klik op de knop LADEN in de bioprintersoftware en selecteer het bijgewerkte G-codebestand met 24 putten dat is opgeslagen in stap 4.6.2.
    3. Selecteer in het rechter bedieningspaneel in de software het tabblad PRINT PREVIEW en klik op de knop PRINT om te beginnen met bioprinten in put D1.
      OPMERKING: Als u het 3 x 4 rasterputplaat G-codebestand gebruikt, eindigt de bioprinting in put A3 van de 24-putplaat (figuur 5C (ii), D), in tegenstelling tot put A6 als een volledige 24-putplaat wordt afgedrukt.
    4. Na voltooiing van de bioprinting van de rechtlijnige constructies, bedek de 24-putplaat met het deksel en verplaats deze naar een klasse II bioveiligheidskast.
    5. Dompel elk rechtlijnig construct onder in twee druppels steriele CaCl2-oplossing van 50 mM (figuur 5B(ii)) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Dit dient om de alginaatpolymeerketens ionisch te verknopen met de Ca2 + -ionen en de rechtlijnige constructies in staat te stellen hun structurele integriteit te behouden.
    6. Zuig de CaCl2-oplossing voorzichtig uit elk construct en spoel eenmaal in 1 ml van 1x PBS (pH 7,4) om overtollige CaCl2 te verwijderen (figuur 5D).
    7. Om uitdroging van de biogeprinte hydrogelconstructies te voorkomen, onderhoudt u de 3D-biogeprinte rechtlijnige constructies in verse 1x PBS totdat de BMMCs klaar zijn om op de constructen te worden gezaaid (figuur 5D).

5. Incubatie van BMMCs op 3D biogeprinte rechtlijnige steigers en levensvatbaarheidstests

  1. Incubatie van BMMCs op 3D biogeprinte rechtlijnige hydrogel steigers
    1. Zaad aliquots van BMMCs op de 3D biogeprinte rechtlijnige steigers in drievoud voor vier verschillende duur, bijvoorbeeld 6, 18, 24 en 48 uur, zodat alle behandelingen tegelijkertijd eindigen. Gebruik BCMC's die in drievoud in lege putten zijn gezaaid voor dezelfde duur als onbehandelde controles.
    2. Breng BMMCs aseptisch over van een T175 cm2 kweekkolf naar een steriele conische buis van 50 ml en pelleteer de BMMCs met 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Resuspend de pellet in 50 ml vers volledig RPMI-medium met 20 ng / ml IL-3 en bereken de levende celdichtheid door een aliquot van trypan blauwgekleurde BMMCs te tellen met behulp van een hemacytometer.
    4. Bereid op basis van de celdichtheid berekend in stap 5.1.3 een aliquot van 6 ml van de BMMC-suspensie bij een uiteindelijke dichtheid van 1 × 106 cellen /ml.
    5. Voor de 48-uurs incubatie-opstelling, aspirateer PBS uit putten A1-3 met de 3D-biogeprinte rechtlijnige hydrogelsteigers en pipetteer 1 ml BMMC (1 × 106 cellen / ml) suspensie in elke put. Pipetteer ook 1 ml BMMC (1 × 106 cellen / ml) suspensie in putten A4-6 zonder biogeprinte constructies om te dienen als de onbehandelde controle. Incubeer de resterende putten met biobedrukte steigers (B1-3, C1-3, D1-3) in RPMI zonder additieven om uitdroging te voorkomen totdat het juiste tijdstip is bereikt voor het zaaien met BMMC voor de behandelingsduur van 24, 18 en 6 uur. Vul de putten zonder gebioprinte steigers (B4-6, C4-6, D4-6) met 1 ml PBS totdat het juiste tijdstip is bereikt voor het zaaien met de BMMCs voor de tijdspunten van 24, 18 en 6 uur.
    6. Incubeer de 24-well plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer.
    7. Voor de 24-uurs incubatie-opstelling, aspirateer reeds bestaand kweekmedium / buffer uit putten B1-6 en zaad 1 ml BMMC (1 × 106 cellen / ml) suspensie in deze putten. Breng de plaat terug naar de couveuse.
    8. Voor de incubatie-opstelling van 18 uur, aspirateer reeds bestaand kweekmedium / buffer uit putten C1-6 en zaad 1 ml BMMC (1 × 106 cellen / ml) suspensie in deze putten. Breng de plaat terug naar de couveuse.
    9. Voor de 6 uur incubatie-opstelling, aspirateer reeds bestaand kweekmedium / buffer uit putten D1-6 en zaad 1 ml BMMC (1 × 106 cellen / ml) suspensie in deze putten. Breng de plaat terug naar de couveuse.
    10. Voor incubatiebeëindiging, doseer monsters uit elke put van de 24-putplaat voor (i) PI-kleuring en analyse door flowcytometrie, (ii) XTT-cel levensvatbaarheidstest en (iii) LDH-afgiftetest. Zorg er daarom voor dat een 96-well-plaat met ronde bodem en de benodigde 1,5 ml microfugebuizen ruim voor het eindpunt van de incubatie worden gelabeld.
  2. Celbemonstering voor XTT metabole assay
    1. Resuspend de BMMCs grondig in het kweekmedium in elke put, waarbij u ervoor moet zorgen dat de 3D-biogeprinte hydrogelsteigers niet worden beschadigd en gefragmenteerd.
    2. Breng aseptisch 40 μL van de homogene BMMC-suspensie van elke put over naar steriele microfugebuizen van 1,5 ml met 760 μL vers volledig RPMI-medium (eindvolume = 800 μL) en vortex kort om te mengen.
    3. Doseer 100 μL van de verdunde BMMC-suspensies in drievoud in een vlakke bodem 96-well microtiterplaat die geschikt is voor het registreren van absorptiemetingen (zie de tabel met materialen) op een microplaatspectrofotometer.
    4. Doseer 50 μL XTT-werkoplossing aan elke put met de BMMC-celsuspensie met behulp van een meerkanaals micropipette.
      OPMERKING: Bereid de XTT-werkoplossing door 5 ml XTT-reagens te mengen met 100 μL elektronenkoppelingsreagens. Ontdooi deze componenten van -20 °C in een waterbad van 37 °C vlak voor gebruik.
    5. Incubeer de 96-well plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer gedurende 24 uur.
    6. Verwijder aan het einde van de incubatie de 96-well plaat uit de incubator en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Registreer absorptiewaarden op een microplaatspectrofotometer bij 450 nm met achtergrondaftrek bij 650 nm.
  3. Supernatant bemonstering voor lactaatdehydrogenase (LDH) assay
    1. Breng de resterende BMMC-suspensies (960 μL) uit elke put van de 24-putplaat over naar microfugebuizen en pelleteer de cellen met 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Pipetteer drie aliquots van 100 μL van het celkweeksupernatant uit elke microfugebuis in een 96-well microtiter vlakke bodemplaat. Gooi de overgebleven supernatanten uit elke microfugebuis weg en bewaar de BMMC-pellets voor verdere kleuring met PI in de rubrieken 5.4.1 tot en met 5.4.8.
    3. Pipetteer 50 μL van de LDH-werkoplossing in elke 100 μL aliquot supernatant.
      OPMERKING: Raadpleeg aanvullend dossier 3 voor de bereiding van LDH-testreagentia.
    4. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
    5. Pipetteer 50 μL van 1 M azijnzuur naar elke put om de reactie te stoppen.
    6. Registreer absorptiewaarden op een microplaatspectrofotometer bij 490 nm met achtergrondaftrek bij 680 nm.
  4. Flowcytometrische analyse van de levensvatbaarheid van BMMC via uitsluiting van propidiumjodide (PI)
    1. Resuspend de BMMC-pellets in flow wash buffer (PBS [pH 7.4] met 0,5% w/v BSA) en pellet de cellen met 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Herhaal de wasstap met flow wash buffer nogmaals.
    3. Resuspend elke BMMC-pellet in 400 μL flowwashbuffer.
      OPMERKING: Er zullen in totaal 24 geresuspendeerde BMMC-monsters zijn: 12 BMMC-monsters geïncubeerd op biogeprinte hydrogelsubstraten (4 tijdstippen in drievoud) en 12 BMMC-monsters geïncubeerd in putten zonder biogeprinte constructies (4 tijdstippen in drievoud).
    4. Pipetteer in een microtiterplaat met een ronde bodem van 96 putten 20 μL flowwashbuffer in de putten A1-12 en B1-12. Pipetteer in dezelfde microtiterplaat 20 μL 10x PI-kleuringsoplossing (100 μg / ml PI in flowwashbuffer) in putten C1-12 en D1-12.
    5. Doseer 180 μL van de 12 BMMC-monsters geïncubeerd op biogeprinte hydrogelsubstraten in putten A1-12 (één monster per put). Doseer 180 μL van de 12 BMMC-monsters geïncubeerd zonder biogeprinte hydrogelsubstraten in putjes B1-12 (één monster per put). Gebruik de BMMC-monsters die in de putten A1-12 en B1-12 zijn afgegeven als niet-bevlekte controles voor elke behandelingsconditie (24 controles in totaal).
    6. Doseer 180 μL van de 12 BMMC-monsters geïncubeerd op biogeprinte constructies in putjes C1-12 (één monster per put). Doseer 180 μL van de 12 BMMC-monsters geïncubeerd zonder biogeprinte constructies in putjes D1-12 (één monster per put).
      OPMERKING: De BMMC-monsters in de putten C1-12 en D1-12 worden gekleurd met een uiteindelijke effectieve PI-concentratie van 10 μg / ml (24 gekleurde monsters in totaal).
    7. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 4 °C of 15 min bij kamertemperatuur in het donker.
    8. Analyseer aan het einde van de incubatietijd de monsters rechtstreeks van de microtiterplaat op een flowcytometer zoals eerder beschreven in punt 3.1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een van de meest cruciale kenmerken van een succesvolle biomateriaalinkt of kweeksubstraat is die van biocompatibiliteit. In de eerste plaats mag het substraat geen celdood veroorzaken. Er zijn verschillende microtiter-gebaseerde en flow cytometrische methoden voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van cellen en necrose; deze methoden zijn echter niet vatbaar voor het analyseren van cellen die zijn ingebed in een hydrogelmatrix. In dit protocol wordt de bovengenoemde beperking omzeild door de BMMCs op het hydrog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De fabricage van 3D-biomimetische weefsels vereist de succesvolle samensmelting van de bioink, die componenten van de extracellulaire matrix nabootst, met de cellulaire component (en) om fysiologische analogen van in vivo weefsels te creëren. Dit vereist het gebruik van primaire cellen, en niet getransformeerde cellen, bij het fabriceren van fysiologische biomimetische weefsels. Primaire immunologische cellen, zoals mestcellen, zijn echter bijzonder gevoelig voor cytotoxische effecten en fenotypische verandering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dit werk werd ondersteund door de National Research Council Canada en Alberta Innovates.

Dankbetuigingen

We bedanken Alberta Innovates voor het leveren van de CNC en Ken Harris en Jae-Young Cho voor hun technisch advies bij het voorbereiden van de CNC / agarose / D-mannitol matrix. We bedanken ook Ben Hoffman, Heather Winchell en Nicole Diamantides voor hun technisch advies en ondersteuning bij de installatie en kalibratie van de INKREDIBLE+ 3D bioprinter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A
Azijnzuur (glashelder)Sigma AldrichAX0074-6
Agarose (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-MercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide natriumzout (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)BD309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 inBD305111
BioLite 24 Well MultidishThermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Well MultidishThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 cm2 Flask VentedThermo Fisher Scientific130-191
Biosafety Cabinet Class IIMicrozone Corp., CanadaBK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
C
C57BL/6 muizenThe Jackson Laboratory000664
CD117 (c-Kit) Monoclonaal Antilichaam, PE (Clone: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)CELLINK LLCIK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mLCELLINK LLCCL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc met End en Tip CapsCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare for PCCELLINK LLCVersion 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTERCELLINK LLCS-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22GCELLINK LLCNZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25GCELLINK LLCNZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27GCELLINK LLCNZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)Sigma Aldrich11465015001
Centrifuge (Benchtop)Eppendorf5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS MicroplateSigma AldrichCLS3370
CO2 IncubatorBinder GmbH, Germany9040-0113
CytoFLEX Flow CytometerBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), gekwalificeerd, hitte-geïnactiveerdThermo Fisher Scientific12484028
FlowJo SoftwareBecton Dickinson & Co. USAVersion 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)VWR15170-208
HEPES NatriumzoutFisher ScientificBP410-500
I
Iodonitrotetrazoliumchloride (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
Lithium L-lactaatSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfaat (MPMS)Sigma AldrichM8640
Microtubes (1,7 mL helder)AxygenMCT-175-C
Microtubes (2,0 mL helder)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (voor het produceren van MilliQ ultrapuur water)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0,2 mm Pore grootte, 500 mL)Thermo Fisher Scientific566-0020
Nalgene Syringe filter (0,2 mm PES, 25 mm)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Penicilline Streptomycine 100 mL (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7,4, zonder Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Propidium jodide, 1,0 mg/mL (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12

Referenties

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57(2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D bioprintenbeenmergmastcellenhydrogel steigerflowcytometriecellevensvatbaarheidsassaybiomarker expressieXTT assayLDH vrijgave
Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.