Kleuring van de Cytoplasmatische Ca2+ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Samenvatting

Geïsoleerde protoplasten van appelpulpcellen werden geladen met een calciumconsprecerend reagens om cytoplasmatische Ca²⁺ concentratie te detecteren.

Samenvatting

Cytosolic Ca²⁺ speelt een sleutelrol in de ontwikkeling van planten. Calciumbeeldvorming is de meest veelzijdige methode om dynamische veranderingen in Ca²⁺ in het cytoplasma te detecteren. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten van pulpcellen door enzymatische hydrolyse. Geïsoleerde protoplasten werden geïncubeerd met het fluorescerende reagens met kleine moleculen (Fluo-4/AM) gedurende 30 minuten bij 37 °C. De fluorescerende sondes vlekten met succes cytosolische Ca²⁺ maar hoopten zich niet op in vacuolen. La^3+,een Ca²⁺ kanaalblokker, verminderde de cytoplasmatische fluorescentie-intensiteit. Deze resultaten suggereren dat Fluo-4/AM kan worden gebruikt om veranderingen in cytosolische Ca²⁺ in het vruchtvlees te detecteren. Samenvattend presenteren we een methode om protoplasten effectief te isoleren uit vleescellen van de vrucht en Ca²⁺ te detecteren door een klein molecuul calcium fluorescerend reagens in het cytoplasma van pulpcellen te laden.

Inleiding

Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij de transductie en stofwisseling van^{plantensignalen 1,2.} Verder reguleert het de eigenschappen van de fruitkwaliteit^3,4,waaronder hardheid, suikergehalte en gevoeligheid voor fysiologische stoornissen tijdens opslag^5,6. Cytoplasmatisch Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie en reguleert de groei en ontwikkeling van planten⁷. Verstoring van cellulaire calciumhomeostase kan bittere pit in appels^{veroorzaken 8,}bruine vlekkenziekte in peren⁹en navelstrengrot in tomaten^10,waardoor de fruitkwaliteit wordt aangetast en ernstige economische verliezen worden veroorzaakt^3,11. Calciumbeeldvorming heeft voldoende ruimtelijke en temporele resolutie en is een belangrijke methode voor het observeren van Ca²⁺ dynamiek in levende cellen^12,13.

Op dit moment zijn er twee hoofdmethoden voor intracellulaire calciumbeeldvorming in levende cellen: de ene maakt gebruik van chemische kleinmoleculaire fluorescerende sondes¹⁴en de andere is de gencoderingssensor (GECI)^15,16. Gezien de moeilijkheid om een stabiel transgeen systeem in fruitbomen en een langere vruchtontwikkeling tot stand te brengen, is GECI_S ongeschikt voor beeldvorming van fruit Ca²⁺ fluorescentie.

Fluorescentiesondes met kleine moleculen zoals Fluo-4 / AM hebben een bijzonder voordeel: hun AM-estervorm (celdoorlatend acetoxymethylesterderivaat) kan gemakkelijk in bulk in levende cellen worden geladen zonder de noodzaak van transfectie, waardoor het flexibel, snel en niet-cytotoxisch^{is 17}. Fluo-4/AM kon met succes worden geladen in de stuifmeelbuis van Pyrus pyrifolia¹⁸ en Petunia,^19, evenals in wachtcellen²⁰ en wortelhaar van Arabidopsis²¹.

Op dit moment zijn er weinig rapporten over de calciumfluorescentiekleuring van pulpcellen²². Als belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol bij de groei en kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appels. Appelbomen worden wereldwijd erkend als een belangrijke economische soort en appels worden beschouwd als een gezond voedsel²³. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten uit appelvruchtpulp door middel van enzymatische hydrolyse en laadden vervolgens fluorescerende reagentia met kleine moleculen in het cytoplasma om Ca^{2 +}te detecteren.

Protocol

1. Protoplast extractie

1. Bereid de basisoplossing: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur en 0,4 M D-sorbitol.
   OPMERKING: De pH van de basisoplossing werd aangepast naar 5,8 met 0,1 M Tris-buffer, gefilterd door 0,22 μm in water oplosbare filters en bewaard bij 4 °C.
2. Bereid de enzymatische oplossing voor: Meng 0,3% (w / v) MacerozymE R-10 en 0,5% (w / v) cellulase R-10 met de basisoplossing.
3. Voeg 0,5 ml enzymatische oplossing toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml. Kies een gezonde en rijpe appel. Snijd vervolgens de pulp in 10 x 5 x 1 mm³ formaat (Figuur 1A-1C).
4. Plaats de stukjes appelvruchtpulp in een centrifugebuis van 1,5 ml met enzymatische oplossing en sluit vervolgens de buis(figuur 1D).
5. Incubeer de buis bij 28 °C gedurende 1 uur en schud bij 70 rpm/min in een shaker in het donker.
6. Was de pulpstukjes. Aspirateer alle enzymatische oplossing en voeg vervolgens 0,5 ml van de basisoplossing toe.
7. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
8. Om een protoplast suspensie te verkrijgen, zuigt u de oplossing op vanaf de bodem van de centrifugebuis (figuur 1E).

2. Calciumionfluorescentiekleuring met kleine moleculen

1. Bereid de Fluo-4/AM-laadoplossing voor met 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 en 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS:80 mM Na₂HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄en 26 mM KCI) in een verhouding van 1:1:2.
2. Voeg 1 μL Fluo-4/AM-laadoplossing toe aan 99 μL van de protoplastsuspensie in de centrifugebuizen van 1,5 ml. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de fluorescerende kleurstof 5 μM is. Meng de oplossing en sluit vervolgens de buis.
3. La³⁺ behandeling: Bereid 100 μM La³⁺ oplossing met 98 μL van de protoplast suspensie, 1 μL van 10 mM La³⁺en 1 μL Fluo-4/AM laadoplossing. Meng de oplossing en sluit de buis.
4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker.
5. Was de protoplasten door centrifugeren op 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer 70 μL van de oplossing en voeg 70 μL van de basisoplossing toe.
6. Incubeer de protoplast suspensie bij 37 °C gedurende 30 minuten om volledig te de-estereren.
7. Aspirateer 15 μL van de protoplast suspensie en druppel op een dia.
8. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop (aanvullende figuur S1).
   OPMERKING: Gebruik een kleurencamera met een hoge gevoeligheid, d.w.z. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor met een pixelresolutie van 3,45 μm.
9. Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming (20x). Stel de helderheid in op 0,5.
   OPMERKING: Verlichting is led-lichtkubussen met instelbare intensiteit met een geïntegreerde filterset met harde coating. De excitatiegolflengte van Fluo-4/AM is 490 nm.

3. Protoplast levensvatbaarheidstest

1. Bereid de fluoresceïnediacetaat (FDA) stamoplossing voor: Los FDA op in aceton totdat de eindconcentratie 1 mg / ml is.
2. Bereid de FDA-werkoplossing voor met 1 μL van de stamoplossing en 99 μL aceton.
3. Voeg 1 μL FDA-werkoplossing toe aan 99 μL protoplastsuspensie. Meng de oplossing door op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de buis.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de FDA is 100 μg / L.
4. Vlek bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker.
5. Bereid de dia's voor en observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
6. Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming(figuur 1F).

4. Beeldanalyse

1. Analyseer de verkregen afbeeldingen met behulp van beeldanalyse- en spreadsheetsoftware (bijv. Image-Pro Plus en Excel 2010).
2. Selecteer twee verticale diameters uit de protoplasten om de fluorescentie-intensiteit te berekenen(aanvullende figuur S2). De fluorescentie-intensiteit van alle protoplasten onder verschillende behandelingen werd gemeten. Gebruik voor de uiteindelijke verwerking fotobewerkingssoftware.

5. Statistische analyse

1. Statistische analyse uitvoeren met behulp van statistische software(aanvullende figuur S3). De gegevens worden gepresenteerd in Gemiddelde ± SD. De t-toetsvan de student werd gebruikt om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren.

Resultaten

Volgens het hierboven beschreven protocol gebruikten we de enzymatische methode om levensvatbare protoplasten uit de pulp te verkrijgen(figuur 1). Sommige protoplasten hadden vacuolen, terwijl anderen dat niet deden. Terwijl de protoplasten geen fluorescentie vertoonden wanneer de Ca²⁺ fluorescerende indicator er niet in werd geladen. Toen Fluo-4/AM in de protoplasten werd geladen, werd het cytoplasma, maar niet de vacuole, fluorescerend (figuur 2). D...

Discussie

In deze studie werden levensvatbare protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. Merk op dat deze methode verse appels vereist. Het huidige protocol maakt de snelle isolatie van een groot aantal protoplasten uit vruchtenpulp mogelijk voor gebruik in onderzoeksstudies. De toepasbaarheid van deze methode is niet beperkt tot 'Fuji'; de protoplasten van de appelpulp van 'Dounan' en 'Honey Crisp' kunnen ook via hetzelfde protocol worden geëxtraheerd (aanvullende figuur S4). De protoplastoplossing na en...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (fosfaat gebufferde oplossing) is een fosfaatbufferoplossing, die een relatief stabiele ionische omgeving en pH-buffercapaciteit kan bieden. Het is een bufferzoutoplossing die vaak wordt gebruikt in de biologie voor moleculaire klonen en celcultuur. De pH is 7,4.
2-(N-morfolino)etaansulfonzuur	Solarbio	M8010	Biologische buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calciumchloride dihydraat is een witte of grijze chemische stof, meestal in korrelige vorm.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degraderen plantencellenwanden.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	Het heeft goede vochtinbrengende eigenschappen, voorkomt uitdrogen en voorkomt dat suiker, zout, enz. kristalliseren.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is een niet-ionische, oppervlakteactieve polyol (molecuulgewicht van ongeveer 12500 Dalton), waarvan is vastgesteld dat het gunstig is voor het bevorderen van de oplossing van wateronoplosbare kleurstoffen en andere materialen in fysiologische media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is een celdoordringbare esterase substraat die kan dienen als een levensvatbaarheidssonde die zowel de enzymatische activiteit meet, die vereist is om de fluorescentie te activeren, als de integriteit van het celmembraan, die vereist is voor intracellulaire retentie van hun fluorescente product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	De groen fluorescente calciumindicator Fluo-4/AM is een verbeterde versie van de calciumindicator Fluo-3/AM. De Fluo-4/AM laadt sneller en is helderder bij dezelfde concentratie. Het kan goed worden aangeslagen met een 488 nm argon ionenlaser.
Fluorescentiemicroscoop	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Bekijk het fluorescentiebeeld.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degraderen plantenweefsel om afzonderlijke cellen te scheiden.
Tris	Solarbio	T8060	Het wordt veel gebruikt bij de bereiding van buffers in biochemische en moleculaire biologie experimenten.