Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Samenvatting

Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.

Samenvatting

Hersenactiviteit, de elektrochemische signalen die tussen neuronen worden doorgegeven, wordt bepaald door de connectiviteitspatronen van neuronale netwerken en door de morfologie van processen en substructuren binnen deze neuronen. Als zodanig is veel van wat bekend is over de hersenfunctie ontstaan naast ontwikkelingen in beeldvormingstechnologieën die meer inzicht geven in hoe neuronen zijn georganiseerd en verbonden in de hersenen. Verbeteringen in het opruimen van weefsel hebben beeldvorming met hoge resolutie van dikke hersenplakken mogelijk gemaakt, waardoor morfologische reconstructie en analyses van neuronale substructuren, zoals dendritische priëlen en stekels, mogelijk zijn. Tegelijkertijd biedt de vooruitgang in beeldverwerkingssoftware methoden om snel grote beeldgegevenssets te analyseren. Dit werk presenteert een relatief snelle methode voor het verwerken, visualiseren en analyseren van dikke plakken gelabeld neuraal weefsel met hoge resolutie met behulp van CLARITY-weefselzuivering, confocale microscopie en beeldanalyse. Dit protocol zal inspanningen vergemakkelijken om de connectiviteitspatronen en neuronale morfologieën te begrijpen die gezonde hersenen kenmerken, en de veranderingen in deze kenmerken die zich voordoen in zieke hersentoestanden.

Inleiding

Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie, patronen van connectiviteit en morfologie van complexe driedimensionale biologische structuren is essentieel voor het afbakenen van de functies van specifieke cellen en weefsels. Dit geldt met name in de neurowetenschappen, waar enorme inspanningen zijn besteed aan het bouwen van neuroanatomische kaarten met hoge resolutie van het centrale zenuwstelsel^1,2. Nauwkeurig onderzoek van de neuronen waaruit deze kaarten bestaan, levert gevarieerde morfologieën op, met verbindingen en locaties die de functie van deze diverse sets neuronen weerspiegelen^3,4. Bovendien kan onderzoek van subcellulaire structuren, met name dendritische stekels, de volwassenheid van synapsen informeren, waardoor ontwikkelingsprocessen en neurologische ziektetoestanden worden weerspiegeld^5,6,7. Benaderingen die de beeldresolutie en doorvoer verbeteren, zijn dus essentieel voor een beter begrip van de hersenfunctie op alle schalen.

Recente ontwikkelingen hebben de moleculaire en genetische toolkit voor het markeren en manipuleren van populaties van neuronen uitgebreid. De ontwikkeling van nieuwe fluorescerende markers, gecombineerd met nieuwe methoden om deze markers in neuronen te introduceren, maakt differentiële labeling van populaties van interagerende neuronen binnen hetzelfde dier of hersenmonster^8,9,10,11mogelijk. Omdat licht wordt verstrooid door ondoorzichtige lipiden en gezien het hoge lipidengehalte van hersenweefsel, is het afbeelden van neuronale populaties voornamelijk beperkt tot dunne secties of heeft het vertrouwd op geavanceerde microscropy-technieken (bijv. Confocale, multi-foton en lichtbladmicroscopie) om diepe structuren in beeld te brengen. Deze inspanningen zijn echter sterk versterkt door de vooruitgang in weefselreinigingstechnieken. Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) is zo'n techniek, waarbij weefsels van belang worden doordrenkt met hydrogelmonomeren (acrylamide en bis-acrylamide) en vervolgens worden gewassen met detergentia¹². De hydrogelmonomeren hybridiseren om een stabiele 3D-hydrogelsteiger te creëren die optisch transparant is en doorlaatbaar voor macromolecuullabels. Nucleïnezuren en eiwitten worden binnen de gehybridiseerde matrix gehouden, terwijl lipiden worden verwijderd door de wasbeurten van het wasmiddel(figuur 1). Dit resulteert in een stabiel weefsel dat stijf genoeg is om de oorspronkelijke vorm en oriëntatie van cellen en niet-lipidemoleculen te behouden, terwijl het optisch transparant genoeg is om gemakkelijk diepe structuren met hoge resolutie in beeld te brengen. Dit behoud van weefselstructuur en oriëntatie maakt het mogelijk om dikke plakken af te beelden, waardoor cel-tot-celverbindingen en ruimtelijke relaties behouden blijven. Bovendien, omdat de locatie en beschikbaarheid van eiwitten en nucleïnezuren tijdens het clearingproces wordt gehandhaafd, kunnen geklaarde weefsels op expressie gebaseerde markers bevatten, evenals exogene labels. CLARITY leent zich dus als een krachtige methode voor het in beeld brengen van grote hoeveelheden diepe hersenstructuren en de verbindingen tussen deze structuren met hoge resolutie.

Het gebruik van CLARITY verbetert de benaderingen voor het in beeld brengen van neuronale populaties aanzienlijk. Deze techniek is vooral bedreven in het genereren van grote hoeveelheden beeldgegevens. CLARITY werkt goed met meerdere vormen van op eiwitten gebaseerde fluorescentie. Dit protocol maakt gebruik van een lentivirale benadering om cellen spaarzaam te labelen met EGFP en tdTomato; transgene reporter-allelen die tdTomato of EGFP tot expressie brengen om cellen voor reconstructie te labelen, zijn echter routinematig gebruikt. Het is belangrijk om een fluorofoor te kiezen die zowel fotostabiel als helder is (bijv. EGFP of tdTomato). Bovendien levert het gebruik van een sterke promotor om de fluorofoor uit te drukken een superieur contrast en beeldkwaliteit op. De nadelen van deze techniek ontstaan omdat het goed analyseren van deze grote hoeveelheid data zowel arbeids- als tijdsintensief kan zijn. Gespecialiseerde microscopen kunnen helpen de doorvoer te verbeteren en de werklast te verminderen. Het bouwen, bezitten en / of bedienen van geavanceerde microscopen is echter vaak onbetaalbaar voor veel laboratoria. Dit werk presenteert een hoge doorvoer, relatief snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden neuraal weefsel met hoge resolutie te visualiseren met behulp van CLARITY-weefselzuivering van grote secties, gecombineerd met standaard confocale microscopie. Dit protocol beschrijft deze aanpak door middel van de volgende stappen: 1) het ontleden en voorbereiden van het neurale weefsel, 2) het opruimen van het weefsel, 3) het monteren van het weefsel, 4) het in beeld brengen van de voorbereide plakjes en 5) het verwerken van volledige plakbeelden met behulp van microscopie visualisatiesoftware reconstructie en analyse(Figuur 2). Deze inspanningen resulteren in beelden met een hoge resolutie die kunnen worden gebruikt om populaties van neuronen, neuronale verbindingspatronen, 3D-dendritische morfologie, dendritische wervelkolomrijkdom en morfologie en moleculaire expressiepatronen in intact hersenweefsel te analyseren.

Protocol

Het volgende protocol volgt alle richtlijnen voor dierverzorging voor Baylor College of Medicine.

1. Dissectie en weefselpreparaat

1. Euthanaseer de muis met een overdosis isofluraan door de muis in een gesloten container te plaatsen met een handdoek gedrenkt in isofluraan (of op andere IUCAC-goedgekeurde middelen).
2. Perfuseer het dier transcardiaal met behulp van een naald van 25 G met 10 ml ijskoude PBS, gevolgd door 10 ml 4% PFA.
3. Ontleed het hersengebied (of weefsel) van belang.
4. Plaats het ontleedde weefsel 's nachts in 4% PFA bij 4 °C. Een goede fixatie is de sleutel voor dit protocol. Sla deze stap niet over of verkort deze niet.
5. Breng na fixatie in 4% PFA gedurende ten minste 12 uur het weefsel over in een 4% acrylamidehydrogelmengsel gedurende 24 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: Zorg er bij het ontdooien van de hydrogel voor dat deze niet gepolymeriseerd is, dit kan gebeuren als de hydrogel te warm wordt. Ontdooi op ijs om voortijdige polymerisatie te voorkomen.

2. Weefsel opruimen

1. Plaats het hersenweefsel (nog ondergedompeld in hydrogel) gedurende 3 uur bij 37 °C in een vacuümincubator met een vacuüm van -90 kPa. Laat de bovenkant van de buis losgeschroefd zodat het vacuüm zich goed kan vormen.
2. Was het weefsel met PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (25 °C) met zacht schudden.
3. Plaats het gepolymeriseerde weefselmonster in de elektroforesekamer en noteer de oriëntatie van het weefsel in de kamer.
4. Vul de kamer en het reservoir met de meegeleverde elektroforese SDS-buffer.
5. Voer het monster uit bij 70 V, 1 A en 35 C, met constante stroom gedurende ongeveer 2 uur / mm weefsel.
   1. Controleer het monster periodiek; het kan meer tijd in de kamer vergen om goed te klaren. Een goed uitgangspunt voor het opruimen is 1-2 uur per mm hersenweefsel. Een heel muizenbrein heeft 8-10 uur nodig voor voldoende opruimen. Onthoud de oriëntatie van het monster voordat u het uit de kamer verwijdert en zorg ervoor dat u het in dezelfde richting terug in de kamer vervangt.
      OPMERKING: Figuur 3A laat zien hoe een volledig leeg brein eruit zal zien. De hersenen zullen er in dit stadium ondoorzichtig en niet helder uitzien vanwege de aanwezigheid van opgeloste SDS, maar er zou weinig tot geen gele weefselkleurige tint moeten zijn na lipide-extractie.

3. Voorbereiden en monteren van het opgeruimde weefsel

1. Nadat het monster is opgeruimd en er voldoende helder uitziet, wast u pbs 's nachts op kamertemperatuur. Vervang de PBS zo vaak mogelijk door verse PBS. Deze stap is van cruciaal belang om resterende SDS te verwijderen die in latere stappen neerslag kan vormen.
2. Na de laatste wasbeurt in PBS, was het weefsel gedurende 5 minuten drie keer in gedeïoniseerd water op kamertemperatuur. Het weefsel wordt bij deze stap ondoorzichtig en kan uitzetten.
3. Incubeer het weefsel in de refractieve index matching oplossing (zie tabel 1) gedurende ten minste 4 uur bij kamertemperatuur. Figuur 3B toont een stuk geklaard weefsel na incubatie in refractieve index matching oplossing.
4. Bouw tijdens de incubatie van weefsel in refractieve index matching oplossing een geschikte behuizingskamer om het monster indien nodig in beeld te brengen.
5. Het bouwen van een beeldvormingskamer voor kleine weefselmonsters/plakjes
   1. Gebruik een glazen schuif als basis voor montage, leg rubberen of plastic afstandhouders neer en zet vast met superlijm. Als er geen vooraf gemaakte afstandhouders beschikbaar zijn, gebruik dan plastic ringen gemaakt van conische buisdoorsneden.
   2. Zorg ervoor dat u deze stukken zonder gaten aan de glasplaat bevestigt(figuur 3C).
   3. Plaats het opgeruimde weefsel in de montagekamer die is voorgevuld met een oplossing voor het matchen van brekingsindexen.
   4. Monteer het weefsel stevig door er een glazen afdekplaat op te leggen en deze af te dichten met nagellak.
   5. Stel dit weefsel voor door een druppel brekingsindex die overeenkomt met de montageoplossing direct op het glas toe te voegen.
6. Grote weefselbeeldvormingskamer
   1. Bouw deze kamer als het weefsel groter is dan 5 mm dik (geschikt voor hele hersenen of hemisferen).
   2. Gebruik een glazen schaal van 10 cm met een hoge wand en plaats een conische buis van 50 ml in het midden en zorg ervoor dat de diameter conisch groot genoeg is om de loop van de gebruikte objectieflens te accepteren.
   3. Maak 3% agarose in water en giet het in de ruimte tussen de glazen schaal en de conische buis, laat 1 uurafkoelen (Figuur 3D). Dit vormt een ring van vaste agarose(figuur 3E).
   4. Hecht het weefsel stevig aan de onderkant van de kamer met behulp van superlijm en vul de kamer met een oplossing voor het matchen van brekingsindexen. Breng lijm aan om het weefsel te hechten op een gebied dat niet wordt afgebeeld om terugwinning van het weefsel uit de schaal mogelijk te maken zonder de interessegebieden te beschadigen.
      OPMERKING: Dit preparaat is tijdgevoelig, omdat de brekingsindexmedia kunnen gaan polymeriseren, tenzij ze uit de lucht worden bewaard en bij 4 °C worden bewaard.

4. Beeldvorming van vrijgegeven weefselmonsters

1. Verkrijg het beeld met behulp van een confocale microscoop met een 25x/0.95 NA objectief met een werkafstand van 4 mm.
2. Schakel alle relevante beeldapparatuur in. Plaats het monster op het podium en plaats een druppel brekingsindex-matchingoplossing op de bovenkant van de montagekamer.
3. Benader de onderdompelingsmedia zorgvuldig met het doel en vorm een continue kolom van media.
4. Zoek met behulp van epifluorescentie een geschikt beeldvormingsveld.
5. Begin de procedure voor het verkrijgen van afbeeldingen door de juiste instellingen te testen.
   1. Begin met het instellen van de instellingen voor resolutie en scansnelheid met Figuur 4A als leidraad. Als u met een confocale microscoop wordt gefotograafd, sluit u het gaatje volledig om het kleinste optische gedeelte en dus de beste z-resolutie te verkrijgen.
   2. Verhoog geleidelijk het laservermogen/sensorversterkte totdat een geschikt beeld wordt verkregen met een hoge signaal-ruisverhouding.
   3. Als u standaard EGFP/tdTomato tweekleurenbeeld gebruikt, stelt u de instellingen voor lichtverzameling in met figuur 4B als leidraad.
   4. Stel de z-stack parameters in op basis van het waargenomen begin- en eindpunt van het weefsel. Stel de stapgrootte in op basis van de gewenste z-resolutie met figuur 4C als leidraad.
      OPMERKING: Kleinere stapgroottes zullen een grotere z-resolutie opleveren, maar zullen ook meer laserbewoningtijd introduceren, wat mogelijk leidt tot het bleken van monsters.
   5. Wanneer u tevreden bent met de instellingen voor beeldacquisitie, verwerft u de afbeelding.
   6. Zorg ervoor dat het beeld een hoge signaal-ruisverhouding heeft en duidelijke grenzen van structuren vertoont(figuur 4D).

5. Beeldverwerking en 3D-kwantificering met behulp van microscopie-analysesoftware

OPMERKING: Microscopische beeldanalysesoftwarepakketten zijn krachtige hulpmiddelen voor driedimensionale beeldvisualisatie en -verwerking. Veel van deze programma's zijn perfect geschikt voor de verwerking van grote datasets die worden gegenereerd op basis van beeldvorming van gewiste weefselmonsters. De volgende stappen en bijbehorende cijfers komen overeen met de Imaris-softwareworkflow.

1. Open de afbeeldingsstapel en importeer deze in de geselecteerde analysesoftware.
2. Bekijk de afbeelding in een driedimensionale ruimte en breng de gewenste wijzigingen aan in de opzoektabellen met behulp van de weergave-aanpassing om de afbeelding beter te visualiseren.
   OPMERKING: Figuur 5A toont de mogelijke extreme beelddiepte die toegankelijk is via 2-fotonenmicroscopie in combinatie met CLARITY-weefselverwijdering. Figuur 5B toont verschillende dendrietprocessen en duidelijk zichtbare rugmorfologieën van de z-stack in figuur 5A.
3. Als u een consistente achtergrond wilt filteren, klikt u op de knop Beeldverwerking en selecteert u het achtergrondaftrekkenfilter.
   OPMERKING: Figuur 5C toont het beeld met een consistent wazig achtergrondsignaal vóór verwerking. Figuur 5D toont de afbeelding nadat het achtergrondaftrekkende filter is toegepast.
4. Observeer het 3D-beeld en raak ermee vertrouwd door het vanuit meerdere hoeken en zoomniveaus te bekijken.
5. Start de dendriettracering door eerst het gereedschap Filamenttracer te selecteren.
6. Klik op Bewerk het filament handmatig, sla automatische creatie over.
7. Stel de modus in op automatisch pad en controleer Auto-center en Auto-diameter correcties.
8. Shift + klik met de rechtermuisknop op het cellichaam om een startpunt in te stellen.
9. Traceer het neuron over de gehele lengte van de dendriet; klik met de linkermu kracht op het einde van de dendriet om het eindpunt in te stellen, zodat de software automatisch het pad tussen het begin- en eindpunt kan berekenen.
10. Herhaal deze stap voor alle dendrieten en traceer de celstructuur volledig.
11. Visualiseer de getraceerde cel en bevestig de nauwkeurigheid ervan. Breng indien nodig handmatige aanpassingen aan.
12. Selecteer het tabblad Maken.
13. Selecteer de optie Dendrietdiameter opnieuwcomputeren.
14. Volg de wizard tot voltooiing voor een nauwkeuriger getraceerd dendriet.
15. Selecteer het tabblad Tekenen.
16. Klik op het keuzerondje Wervelkolom om te beginnen met het tekenen van stekels.
17. Stel indien nodig de geschatte rugdiameter in en gebruik het meetinstrument om een nauwkeurige weergave van de wervelkolomdiameters te krijgen.
18. Klik op het midden van de wervelkolomkoppen om een nieuwe wervelkolom toe te voegen.
19. Herhaal dit voor alle stekels op de dendriet.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de dendriet vanuit alle mogelijke hoeken te observeren bij het handmatig toevoegen van stekels.
20. Controleer de nieuw toegevoegde stekels op nauwkeurigheid en breng indien nodig wijzigingen aan.
21. Selecteer het tabblad Maken.
22. Selecteer de optie Spine Diameter opnieuw incomputeren om de software in staat te stellen de juiste hoofd- en nekdiameters te bepalen, die cruciaal zijn voor downstream data-analyse.
23. Volg de wizard voor het maken van de rugdiameter tot voltooiing.
24. Observeer het resultaat van de berekening en breng indien nodig handmatige aanpassingen aan. Figuur 5E toont een volledig getraceerd neuron compleet met stekels.
25. Als u een geclassificeerde lijst met stekels wilt maken, selecteert u het tabblad Gereedschappen.
    OPMERKING: De MATLAB-extensie moet worden geïnstalleerd om dit te laten werken.
    1. Als u de MATLAB-extensie wilt installeren, opent u het voorkeurenvenster.
    2. Selecteer de optie Aangepaste gereedschappen.
    3. Voeg de juiste MATLAB runtime MCR toe.
26. Klik op Wervelkolom classificeren.
27. Bewerk de gewenste parameters voor wervelkolomclassificatie.
28. Klik op Spines classificeren op de MATLAB-extensie. Figuur 5F toont de dendriet bedekt met kleurgecodeerde geclassificeerde stekels.
29. Selecteer het tabblad Statistieken.
30. Configureer de gewenste statistieken om de gegevens te kwantificeren door op de knop Configureren in de linkerbenedenhoek van dit tabblad te klikken.
31. Zodra de methode voor de weergave van statistieken is gekozen, exporteert u de gegevens met behulp van de knop Statistieken op tabblad weergeven naar bestand exporteren in de rechterbenedenhoek van dit venster.
32. Maak een grafiek van de statistieken met behulp van een voorkeursgrafiekmethode.

Resultaten

Na beeldacquisitie werd de representatieve celmorfologie geanalyseerd met behulp van ingebedde statistieken en het classificeren van scripts binnen de analysesoftware. De verzamelde gegevens (Figuur 6A) geven aan dat neuron 2 een grotere dendritische structuur heeft met een hogere dichtheid van stekels. Als geheel suggereren de gegevens dat neuron 2 een complexere dendritische structuur heeft in vergelijking met neuron 1. Om dit resultaat te onderbouwen, werd standaard Sholl-analyse uitgevoe...

Discussie

Vóór de komst van hedendaagse weefselzuiveringstechnieken bestond het bestuderen van neuronale morfologie uit tijdsintensieve secties, beeldvorming en reconstructie van aangrenzende zeer dunne secties. Het gebruik van elektroforetische weefselverwijdering in combinatie met confocale beeldvorming biedt een onbelemmerd beeld van de volledige neuronale morfologie. Van intacte dendritische bomen tot de kleinste synaptische bouton, beeldvorming en kwantificering van neuronale morfologie is nog nooit zo haalbaar geweest.

<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Needle	BD	305127
30% Acrylamide (No-Bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339653
Electrophoretic Tissue Clearing Solution	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Hydrogel Solution Kit	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyde 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY Polymerization System	Logos	C20001
X-CLARITY Tissue Clearing System II	Logos	C30001