Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Summary

Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.

Abstract

Epigenomische regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA's met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT & Tag) is een enzym-tetheringmethode waarbij het specifieke chromatine-eiwit eerst wordt herkend aan zijn specifieke antilichaam en vervolgens het antilichaam een eiwit A-transposase (pA-Tn5) fusie-eiwit bindt, dat het beoogde chromatine in situ splitst door de activering van magnesiumionen. Hier bieden we ons eerder gepubliceerde CUT & Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allortetraploïde katoenbladeren met modificatie. Dit stapsgewijze protocol kan worden gebruikt voor epigenomisch onderzoek in planten. Daarnaast worden substantiële wijzigingen voor de isolatie van plantenkernen voorzien van kritische opmerkingen.

Introduction

Transcriptiefactorbindende DNA-sites en open chromatine geassocieerd met histonmodificatiemerken vervullen een cruciale functionele rol bij het reguleren van genexpressie en zijn de belangrijkste aandachtspunten van epigenetisch ^onderzoek1. Conventioneel is chromatine immunoprecipitatie assay (ChIP) in combinatie met diepe sequencing (ChIP-seq) gebruikt voor de genoombrede identificatie van specifieke chromatine histonmodificatie of DNA-doelen met specifieke eiwitten, en wordt op grote schaal toegepast op het gebied van ^epigenetica2. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) technologie werd oorspronkelijk ontwik....

Protocol

1. Bereid transposase- en voorraadoplossingen voor (dag 1)

OPMERKING: In dit deel worden de oligonucleotideadapters gecomplexeerd met Tn5-transposase om actief transposase te maken.

1. Verdun primers (primer A, primer B en primer C) tot een concentratie van 100 μM met behulp van de gloeibuffer (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (zie tabel 1 voor sequentie-informatie van primers en tabel 2 voor de recepten voor werkoplossingen). Bewaren bij -20 °C tot gebruik.
2. Stel de volgende twee reacties in PCR-buizen in: Reactie 1 (adapter AB), 10 μL van 100 μM primer A, 10 μL va....

Results

Figuur 1 toont de CUT&Tag workflow. Figuur 2 toont de DAPI-kleuring van de intacte kernen. Het doel van de "kernisolatie" stap was om de intacte kernen te verkrijgen in een voldoende hoeveelheid voor de daaropvolgende CUT & Tag-reactie. Figuur 3 toont de agarose gel elektroforese van PCR producten. De IgG-negatieve controle is parallel vereist bij het opzetten van het experiment. Vergeleken met de IgG-controlegroep varieerde het gro.......

Discussion

Hier hebben we CUT & Tag beschreven, een technologie voor het genereren van DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Ons succes met H3K4me3-profilering in katoenbladeren suggereert dat CUT & Tag, dat voor het eerst werd ontworpen voor dierlijke cellen, ook kan worden gebruikt voor plantencellen. Zowel het Tris-buffersysteem dat vaak wordt gebruikt voor ChIP.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W