Method Article

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

DOI:

10.3791/62539

⸱

June 15th, 2021

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd blijft bestaan als hart- en vaatziekten (CVD). Het modelleren van de fysiologische en biologische complexiteit van de hartspier, het myocardium, is echter notoir moeilijk in vitro te bereiken. Voornamelijk liggen obstakels in de behoefte aan menselijke cardiomyocyten (CMs) die volwassen zijn of volwassen fenotypen vertonen en met succes de cellulaire complexiteit en ingewikkelde 3D-architectuur van het myocardium kunnen repliceren. Helaas is de inkoop van levensvatbare menselijke CMs vanwege ethische zorgen en gebrek aan beschikbaar primair van de patiënt afgeleid menselijk hartweefsel, in combinatie met de minimale proliferatie van CMs, een beperkende stap geweest voor hartweefseltechnologie. Hiertoe is het meeste onderzoek overgegaan op cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) als de primaire bron van menselijke CMs, wat resulteert in de brede integratie van hiPSC-CMs in in vitro assays voor hartweefselmodellering.

Hier in dit werk demonstreren we een protocol voor het ontwikkelen van een 3D volwassen stamcel-afgeleid menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch apparaat. We leggen specifiek de productie uit en demonstreren visueel de productie van een 3D in vitro anisotropisch cardiale weefsel-op-een-chip model van hiPSC-afgeleide CMs. We beschrijven voornamelijk een zuiveringsprotocol om te selecteren voor CMs, de co-cultuur van cellen met een gedefinieerde verhouding via het mengen van CMs met menselijke CB's (hCFs) en suspensie van deze co-cultuur binnen de op collageen gebaseerde hydrogel. We demonstreren verder de injectie van de met cellen beladen hydrogel in ons goed gedefinieerde microfluïdische apparaat, ingebed met verspringende elliptische microposten die dienen als oppervlaktetopografie om een hoge mate van uitlijning van de omliggende cellen en de hydrogelmatrix te induceren, waarbij de architectuur van het inheemse myocardium wordt nagebootst. We stellen ons voor dat het voorgestelde 3D anisotrope cardiale weefsel-op-chip model geschikt is voor fundamentele biologiestudies, ziektemodellering en, door het gebruik ervan als screeningsinstrument, farmaceutische tests.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefseltechniekbenaderingen zijn de afgelopen jaren op grote schaal onderzocht om in vivo klinische bevindingen in regeneratieve geneeskunde enziektemodellering 1,2te begeleiden . Er is met name aanzienlijke nadruk gelegd op in vitro hartweefselmodellering vanwege de inherente moeilijkheden bij het verkrijgen van menselijk primair hartweefsel en het produceren van fysiologisch relevante in vitro surrogaten , waardoor het fundamentele begrip van de complexe mechanismen van hart- en vaatziekten (CVD 's)1,3wordtbeperkt . Traditionele modellen hebben vaak 2D monolayer cultuurtesten betrokken. Het belang van het cultiveren van hartcellen in een 3D-omgeving om zowel het inheemse landschap van het myocardium als complexe cellulaire interacties na te bootsen, is echter uitgebreid gekarakteriseerd4,5. Bovendien bevatten de meeste modellen die tot nu toe zijn geproduceerd een monocultuur van CMs die zich onderscheiden van stamcellen. Het hart bestaat echter uit meerdere celtypen6 binnen een complexe 3D-architectuur7, wat de kritieke noodzaak rechtvaardigt om de complexiteit van de weefselsamenstelling binnen 3D-in vitromodellen te verbeteren om cellulaire bestanddelen van het inheemse myocardium beter na te bootsen.

Tot op heden zijn veel verschillende benaderingen onderzocht om biomimetische 3D-modellen van myocardium8te produceren. Deze benaderingen variëren van experimentele opstellingen die de real-time berekening van gegenereerde kracht mogelijk maken, van monocultuur-CMs gezaaid op dunne films (veronderstelde spierdunne films (MTF's))9, tot co-kweek hartcellen in 3D-hydrogelmatrices die zijn opgehangen tussen vrijstaande cantilevers (verondersteld ontworpen hartweefsels (EHT's))10. Andere benaderingen waren gericht op het toepassen van micromoldingtechnieken om myocard anisotropie na te bootsen, van monocultuur-CMs in een 3D-hydrogel die tussen uitstekende microposten in een weefselpleister11hangt , tot monocultuur-CMs die tussen ingesprongen microgrooves12,13zijn gezaaid . Er zijn inherente voor- en nadelen aan elk van deze methoden, daarom is het relevant om de techniek te gebruiken die aansluit bij de beoogde toepassing en de bijbehorende biologische vraag.

Het vermogen om de rijping van stamcel-afgeleide CMs te verbeteren is essentieel voor de succesvolle in vitro engineering van volwassen myocardweefsel en de vertaling van latere bevindingen naar klinische interpretaties. Hiertoe zijn methoden voor volwassen CMs op grote schaal onderzocht, zowel in 2D als 3D14,15,16. Bijvoorbeeld, elektrische stimulatie opgenomen in EHT's, gedwongen uitlijning van CMs met oppervlaktetopografie, signaalsignalen, groeifactoren uit co-cultuur, en/of 3D-hydrogelcondities, enz., leiden allemaal tot een verandering ten gunste van CM-rijping in ten minste een van de volgende: celmorfologie, calciumbehandeling, sarctische structuur, genexpressie of contractiele kracht.

Van deze modellen behouden de benaderingen die microfluïdische platforms gebruiken bepaalde voordelen in de natuur, zoals controle van verlopen, beperkte celinvoer en minimaal noodzakelijke reagentia. Bovendien kunnen veel biologische duplo's tegelijk worden gegenereerd met behulp van microfluïdische platforms , wat dient om het biologische mechanisme van belang beter te ontleden en de experimentele steekproefgrootte te vergroten ten gunste van statistische macht17,18,19. Bovendien maakt het gebruik van fotolithografie in het fabricageproces van microfluïdische apparaten het mogelijk om nauwkeurige kenmerken (bijv. topografieën) op micro- en nanoniveau te creëren, die dienen als mesoscopische aanwijzingen om de omringende cellulaire structuur en weefselarchitectuur op macroniveau18,20, 21,22 te verbeteren voor verschillende toepassingen in weefselregeneratie en ziektemodellering.

We hebben eerder de ontwikkeling aangetoond van een nieuw 3D-hartweefsel on-chip model dat oppervlaktetopografie bevat, in de vorm van aangeboren elliptische microposten, om hydrogelgekapte co-gekweekte hartcellen uit te lijnen in een onderling verbonden, anisotropisch weefsel20. Na 14 dagen kweek zijn de weefsels gevormd in het microfluïdische apparaat volwassener in hun fenotype, genexpressieprofiel, calciumbehandelingskenmerken en farmaceutische respons in vergelijking met monolaag en 3D-isotrope controles23. Het hierin beschreven protocol beschrijft de methode voor het maken van dit 3D-co-gekweekte, uitgelijnde (d.w.z. anisotrope) menselijke hartweefsel in het microfluïdische apparaat met behulp van hiPSC-afgeleide CMs. Specifiek leggen we de methoden uit om hiPSC's te differentiëren en te zuiveren ten opzichte van CMs, suppletie van hCFs met CMs om een gevestigde co-cultuurpopulatie te produceren, invoeging van de celpopulatie ingekapseld in de collageenhydrogel in de microfluïdische apparaten. De resulterende 3D-gemanipuleerde microweefsels zijn geschikt voor verschillende toepassingen, waaronder fundamentele biologiestudies, CVD-modellering en farmaceutische tests.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voer alle celbehandeling en reagensvoorbereiding uit in een bioveiligheidskabinet. Zorg ervoor dat alle oppervlakken, materialen en apparatuur die in contact komen met cellen steriel zijn (d.w.z. afspuiten met 70% ethanol). Cellen moeten worden gekweekt in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2. Alle hiPSC-cultuur en differentiatie wordt uitgevoerd in 6-put platen.

1. Microfluïdische apparaatcreatie (geschatte duur: 1 week)

  1. Fotolithografie
    OPMERKING: Het masker, ontworpen met behulp van het CAD-bestand (meegeleverd als aanvullend bestand 1),bevat het ontwerp van het microfluïdische kanaal. Druk het ontwerp af op een transparant masker. Voer vervolgens standaard fotolithografie uit met de negatieve fotoresist SU8 2075 op een 4-inch siliciumwafel in een cleanroom.
    1. Reinig een siliconenwafel met isopropylalcohol (IPA) en droog met stikstof. Bak 5 minuten op 200 °C voor uitdroging.
      OPMERKING: Behandel de wafer met een wafer pincet.
    2. Plaats de wafer in de spin-coater. Deponeer 3-4 ml SU8 in het midden van de wafer, draai vervolgens om een laag van 200 μm te vormen (d.w.z. verhoog 15 s tot 500 tpm, draai gedurende 10 s, verhoog 5 s tot 1.200 tpm en draai gedurende 30 s, dan downspin gedurende 15 s totdat het stopt).
    3. Verwijder de wafel en bak zachtjes gedurende 7 minuten bij 65 °C en vervolgens 45 minuten bij 95 °C.
    4. Verplaats de wafer naar een maskeruitlijner en plaats het transparante masker in de maskerhouder met een UV-filter. Stel de wafer bloot aan 2 cycli van 230 mJ/cm2, met 30 s vertraging, voor een totale blootstelling van 460 mJ/cm2.
    5. Voer 's nachts een baksel na blootstelling uit op het blootgestelde wafeltje in een oven van 50 °C.
    6. Zet de oven de volgende ochtend uit en nadat de wafel is afgekoeld tot kamertemperatuur, dompelt u deze onder in SU8-developer. Verwijder de wafer elke 5 minuten van de ontwikkelaar en was met IPA en plaats deze vervolgens terug in de ontwikkelaar.
    7. Droog na ongeveer 20 minuten, of wanneer de IPA helder is, de wafel met luchtstikstof en bak hard in een oven op 150 °C; zodra de oven 150 °C bereikt, zet u deze uit, maar gaat deze niet open. Laat het wafeltje in de oven staan tot het op kamertemperatuur is en verwijder het wafeltje.
    8. Bevestig de hoogte van SU8 met een profilometer en de optische kenmerken met een lichtmicroscoop. Eenmaal bevestigd, plakt u de wafel in een plastic petrischaal van 150 mm.
  2. Zachte lithografie
    OPMERKING: De wafer, geplakt op de Petrischaal, moet worden dichtgeslibd om te voorkomen dat het PDMS aan de SU8-functies wordt gehecht.
    1. Draai de wafel (getapt op een plastic petrischaal) om over een glazen petrischaal van dezelfde grootte met 0,4 ml methyltrichlorosilane (MTCS) en stel de wafel gedurende 4 minuten bloot aan de dampen. Draai het wafeltje rechtop en plaats het deksel op de Petrischaal.
    2. Meng 30 g siliconen elastomeerbasis met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1. Haal het deksel van de Petrischaal en giet het polydimethylsiloxaan (PDMS) op de wafel en degas vervolgens in een desiccator.
    3. Zodra alle bellen verdwenen zijn, plaatst u de wafer gedurende 1,5 uur op 80 °C om het PDMS uit te harden.
    4. Verwijder voorzichtig de PDMS en pons in- en uitgangen voor de weefselpoorten en mediakanalen met respectievelijk een biopsiestoot van 1 mm en 1,5 mm.
    5. Reinig de PDMS-kanalen met tape om stof te verwijderen. Week vervolgens de afdeklips (18 x 18 mm, nr. 1) gedurende ten minste 15 minuten in 70% ethanol. Droog deze vervolgens af met tissuedoekjes.
    6. Onderwerp zowel de afdeklips als de PDMS-kanalen (functiezijde blootgesteld) gedurende 1 minuut aan het plasma (instelling op hoog), hecht vervolgens snel aan elkaar en plaats 's nachts in een oven van 80 °C om de hechting vast te zetten.
      OPMERKING: Tijdens het verlijmen is het essentieel om lichte druk uit te oefenen op de randen van de PDMS-kanalen om een goede afdichting tussen het PDMS en glas te garanderen en tegelijkertijd het kanaal zelf te vermijden om kanaalinstorting te voorkomen.
  3. Voorbereiding van het apparaat
    1. Dompel de verlijmde PDMS-apparaten onder in gedeioneerd water (DI H2O) en autoclaaf met de vloeistofcyclus. Aspireer vervolgens de vloeistof uit de apparaten en autoclaaf opnieuw met de zwaartekrachtcyclus. Droog vervolgens de gesteriliseerde apparaten 's nachts uit bij 80 °C.

2. Stamcelkweek (geschatte duur: 1-2 maanden)

  1. hiPSC cultuur en onderhoud
    OPMERKING: De hiPSC's moeten gedurende drie opeenvolgende passages worden gekweekt na het ontdooien in vitro vóór cryopreservatie of differentiatie. hiPSC's worden gekweekt in E8- of mTeSR1-medium, afhankelijk van de cellijn, op de matrixgecoate platen van het keldermembraan24.
    1. Om platen te coaten met hESC-kwaliteit keldermembraanmatrix, ontdooit u één aliquot van het matrixmedium (partijafhankelijk volume, over het algemeen 200-300 μL; opgeslagen bij -80 °C) door het toe te voegen aan 25 ml DMEM/F-12K op ijs. Verdeel 1 ml van deze ophanging in elke put van een 6-put plaat. Laat de plaat minstens 1 uur in de incubator bij 37 °C staan.
    2. Wijzig bij het ontdooien de E8-media voor hiPSC-cultuur door 5 μM Y-2763225 (E8+RI) toe te voegen. Gebruik dit medium daarna 24 uur en verander het medium vervolgens in vers E8.
      OPMERKING: Voor routinematige mediawijzigingen worden ongewijzigde E8-media gebruikt voor hiPSC-cultuur. Voor regelmatig onderhoud moeten E8-media elke dag worden vervangen, ongeveer 24 uur na de vorige mediawijziging.
    3. Passagecellen op dag 3 of dag 4, aspiratiemedia, was vervolgens elke put met 1 ml 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde oplossing (DPBS).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen ongeveer 70% samenvloeien. Laat ze niet verder groeien dan 70% samenvloeiing.
    4. Aspireer de DPBS, voeg vervolgens 1 ml 0,5 mM EDTA toe aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 6-7 minuten.
    5. Aspireer voorzichtig EDTA, voeg 1 ml E8 + RI toe aan elke put en knal tegen het oppervlak met een pipet van 1 ml (~ 5-10 keer om alle cellen te verzamelen). Verzamel de celsuspensie in een microcentrifugebuis van 15 ml.
    6. Tel de celsuspensie en passage bij de gewenste celdichtheid (d.w.z. ~200 K per put) in E8+RI.
    7. Verander de media 24 uur later in E8 (zonder RI). Laat de cellen niet langer dan 24 uur met RI staan.
      OPMERKING: E8 mag niet worden verwarmd tot 37 °C. Laat het altijd op kamertemperatuur voor opwarming voor celkweek.
  2. Cardiomyocyt (CM) gerichte differentiatie
    OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat het bestaan van heterogeniteit tussen verschillende lijnen van de hiPSC's26,27, dus de volgende stappen moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor elke cellijn. Volg de onderstaande stappen voor CM-differentiatie.
    1. Bereid RPMI + B27 - insuline voor door 10 ml B27 minus insuline en 5 ml penicilline/streptomycine (pen/streptomycine) toe te voegen aan 500 ml RPMI 1640.
    2. Bereid RPMI + B27 + insuline voor door 10 ml B27 en 5 ml pen/streptokokken toe te voegen aan 500 ml RPMI 1640.
    3. Bereid RPMI minus glucose + B27 + insuline voor door 10 ml B27, 5 ml pen/streptokokken en 4 ml natriumlactaat toe te voegen aan 500 ml RPMI 1640 zonder glucose.
    4. Zodra de hiPSC's 85% confluency bereiken, begint u met differentiëren (dag 0) door het oude medium te vervangen door 4 ml rpmi + B27 - insulinemedium met 10 μM CHIR99021 aan elke put van een 6-putplaat (d.w.z. voeg 25 μL van 10 mM CHIR99021 toe aan 25 ml RPMI + B27 - insuline).
      OPMERKING: CHIR99021 is een GSK-remmer en leidt tot Wnt-activering. De optimale concentratie VAN CHIR99021 en de initiële samenvloeiing varieert per cellijn28. Controleer altijd een concentratiegradiënt van 6-12 μM CHIR99021 en een reeks zaaidichtheden vóór het eigenlijke experiment om optimale omstandigheden voor het initiëren van differentiatie te bepalen.
    5. Precies 24 uur later (dag 1), aspireer het medium en vervang door 5 ml voorverwarmde RPMI + B27 - insuline voor elke put.
    6. Precies 72 uur na chir99021 toevoeging (dag 3), verzamelen 2,5 ml van het verbruikte medium uit elke put van de 6-put plaat, in totaal 15 ml van het verbruikte medium in een buis.
    7. Voeg hier 15 ml verse RPMI + B27 - insulinemedium aan toe. Voeg IWP2 toe aan een concentratie van 5 μM aan de gecombineerde mediumbuis (d.w.z. 1 μL IWP2 bij 5 mM per 1 ml gecombineerd medium of 30 μL IWP2 in 30 totale ml media).
    8. Verwijder ~1,5 ml van het resterende medium per put van de plaat, zodat er 1 ml van het medium overblijft. Wervel de plaat krachtig om een adequate verwijdering van celresten te garanderen. Aspireer vervolgens de rest van het oude medium en voeg 5 ml van het gecombineerde medium met IWP2 per put van de plaat toe.
      OPMERKING: De toevoeging van IWP2 aan de cellen leidt tot Wnt-remming.
    9. Op dag 5 aspireert u het medium uit elke put en vervangt u het door 5 ml voorverwarmde RPMI + B27 - insuline.
    10. CM-rijping: Op dag 7, dag 9 en dag 11 moet u het medium uit elke put aspireren en vervangen door 5 ml voorverwarmde RPMI + B27 + insuline. Spontane mishandeling moet rond deze dagen worden waargenomen.
    11. CM-zuivering: Begin op dag 13 en dag 16 met glucosehonger door het medium uit elke put te aspireren, elke put te wassen met 1 ml 1x DPBS en vervolgens 5 ml voorverwarmde RPMI minus glucose + B27 + insuline toe te voegen, aangevuld met 4 mM natriumlactaat.
    12. Op dag 19 aspireert u het verbruikte medium en vervangt u het door 5 ml voorverwarmde RPMI + B27 + insuline naar elke put om celherstel na zuivering mogelijk te maken.
    13. Op dag 21 worden cellen opnieuw geplaatt volgens het hieronder beschreven CM-dissociatieprotocol (stap 3.3). Probeer 1,5-2 x 106 cellen per put in een 6-put plaat te borderen. Als het bijvoorbeeld een zeer efficiënte differentiatie is, is het over het algemeen goed om de 6 putten uit te breiden tot 9 putten.
    14. Vanaf dag 21, aspireer het medium uit elke put en vervang het door 4 ml RPMI + B27 + insuline om de 2-3 dagen.
      OPMERKING: De hiPSC-CMs zijn klaar voor experimenteel gebruik na dag 23.

3. Creatie van 3D-hartweefsel in het microfluïdische apparaat: (Geschatte duur: 2-3 uur)

  1. hCF-cultuur
    1. Kweek menselijke ventriculaire cardiale fibroblasten (hCFs; commercieel verkregen uit Lonza) in T75 kolven (bij 250K cellen per kolf) in Fibroblast Growth Media-3 (VGV3). Verander de media om de andere dag, en passage wanneer op 70% samenvloeien. Gebruik de hCFs vóór passage 10, omdat ze kunnen beginnen te differentiëren naar myofibroblasten bij hoge passages29.
  2. hCF-dissociatie
    1. Om de hCF's te scheiden, haalt u eerst de kolf uit de incubator. Plaats de kolf in de bioveiligheidskast en begin met het aspireren van de verbruikte media uit de kolf. Was vervolgens de T75 kolf met 3 ml 1x DPBS. Sluit de dop en wervel de kolf.
    2. Aspireer de DPBS. Neem 3 ml voorverwarmde 1x Trypsin-EDTA (0,05%) en voeg het toe aan de kolf. Kantel de kolf en wervel om de bodem te coaten. Laat het 4-6 minuten in een incubator van 37 °C liggen en controleer de kolf onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen losraken, zoals blijkt uit de ronde celvorm en drijvende cellen. Zo niet, plaats de kolf dan nog een minuut terug in de incubator.
    3. Neutraliseer de trypsinewerking door 3 ml voorverwarmde VGV3 aan de kolf toe te voegen. Pipetteer vervolgens de oplossing op en neer tegen de bodem van de kolf om de CB's los te maken.
    4. Verzamel de celsuspensie in een microcentrifugebuis van 15 ml. Neem 10 μL van de celsuspensie en doseer deze in een hemocytometer om de cellen met een microscoop te tellen.
    5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 4 min op 200 x g. Aspireer de supernatant en zorg ervoor dat de celkorrel niet wordt verstoord.
    6. Resuspendeer de pellet in verse VGV3, om een gewenste 75 x 106 cellen/ ml te maken. Ofwel een portie passeren (250K cellen per T75 kolf) of het onderstaande protocol volgen om 3D-hartweefsel te genereren.
  3. CM-dissociatie
    OPMERKING: Bereid de CMs na differentiatie en zuivering voor op gebruik in de injectie in microfluïdische apparaten.
    1. Haal de plaat cd's uit de incubator en aspireer de media. Was vervolgens de putten met 1 ml 1x DPBS per put van een 6-put plaat. Neem 6 ml DPBS en pipet 1 ml per put.
    2. Aspireer de DPBS en zorg ervoor dat de cellen die aan de plaat zijn bevestigd, niet worden verstoord. Pipet 6 ml warme celloslatingsoplossing (bijv. TrypLE express) en voeg 1 ml per put toe. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in een incubator van 37 °C.
    3. Neutraliseer het enzym met een gelijk volume RPMI + B27+ insuline (d.w.z. 1 ml per put) en dissocieer de cellen mechanisch door met een pipet van 1 ml op en neer te gaan tegen het kweekvat.
    4. Verzamel de CMs in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 min.
    5. Aspireer de supernatant. Resuspendeer de celkorrel in 5 ml RPMI + B27 + insuline. Pipet de oplossing op en neer met een pipet van 1 ml om een goede menging te garanderen. Neem 10 μL van de celsuspensie en doseer deze in een hemocytometer om het totale celnummer te bepalen.
    6. Centrifugeer de cellen opnieuw op 300 x g gedurende 3 minuten (om volledige verwijdering van TrypLE te garanderen) en aspireer het supernatant. Voeg vervolgens een geschikt volume RPMI + B27 + insuline toe om 75 x 106 cellen/ml te bereiken.
      OPMERKING: Als hartdifferentiatie/-selectie niet resulteert in een hoge CM% (d.w.z. >80%), zoals blijkt uit immunostaining of flowcytometrie voor CM-specifieke eiwitten zoals cTnT, beschouw cellen dan niet als geschikt voor de weefselvorming. Het differentiatieproces moet worden geoptimaliseerd wanneer dit gebeurt door aanpassing van chir99021-concentraties en initiële startdichtheid. Als cm-zuivering moet worden verbeterd, kunnen andere methoden worden gebruikt, zoals sorteren op CMs met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) of magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)30,31,32.
  4. Collageenpreparaat
    OPMERKING: Bereid collageen uit de hoge concentratie collageenbouillon (variërend van 8-11 mg/ml). Het collageen dat wordt gebruikt om de cel te maken: hydrogelmengsel is 6 mg / ml en de uiteindelijke concentratie is 2 mg / ml. Afhankelijk van het aantal te injecteren apparaten moet het volume collageenoplossing dat moet worden gemaakt, worden terugge berekend.
    1. Bewaar alle benodigde reagentia op ijs in een bioveiligheidskap.
      OPMERKING: Collageen is een thermoresponsieve hydrogel. Daarom moet de temperatuur laag blijven om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
    2. Neem 75 μL collageen (8 mg/ml) en verdeel het in een microcentrifugebuisje op ijs. Collageenoplossing is erg stroperig, dus aspireer het langzaam met een pipet.
    3. Neem 13,85 μL media (d.w.z. RPMI + B27 + insuline) en doseer het in dezelfde tube.
    4. Neem vervolgens 10 μL fenolrood en voeg toe aan het mengsel en resuspend.
    5. Neem ten slotte 1,15 μL 1N NaOH en voeg toe aan de suspensie.
    6. Gebruik een pipetpunt van 200 μL en resuspend de suspensie.
      OPMERKING: Het stamcollageen heeft een zure pH, waardoor de toevoeging van NaOH nodig is om te neutraliseren voordat het wordt gebruikt om de hartcellen in te kapselen. Fenolrood fungeert als een pH-indicator; voeg dit daarom toe vóór de NaOH-toevoeging. Op dit punt zal de collageenoplossing geel zijn, wat de zuurgraad aangeeft. Na de toevoeging van NaOH moet de oplossing oranje tot lichtroze worden, wat de neutralisatie aangeeft.
  5. Hydrogelmengsel en celbereiding
    OPMERKING: In deze stap wordt de inkapseling van de cellen in de hydrogel op basis van collageen gedaan. De cellen, evenals alle hydrogelprecursoren, moeten tijdens de volgende stappen op ijs worden geplaatst.
    1. Op dit punt, als de CB's nog niet zijn uitgepoging, slaat u de CM-suspensie op in een centrifugebuis van 15 ml, waarbij het deksel wordt losgeschroefd om gasstroom mogelijk te maken, binnen een incubator van 37 °C. Dissocieer tegelijkertijd de CB's en verzamel bij een dichtheid van 75 x 106 cellen/ml voor het laden van apparaten.
    2. Meng de opgeschorte CB's met CB's in een verhouding van 4:1. Neem een aliquot van 8 μL CMs en voeg toe aan een verse centrifugebuis op ijs. Neem vervolgens 2 μL CB's en voeg toe aan de celsuspensie in de centrifugebuis.
    3. Resuspend de celsuspensie, pak 5,6 μL van de celsuspensie en doe deze in een verse microcentrifugebuis.
    4. Neem 4 μL van het collageen net bereid in de bovenstaande stappen en voeg toe aan een 4:1 CM:CF mengsel. Voeg 2,4 μL Growth Factor Reduced (GFR) keldermembraanmatrix toe, waardoor de uiteindelijke celdichtheid 35 x 106 cellen/ml is voor de injectie van het apparaat. Pipetteer het mengsel op en neer om ervoor te zorgen dat de celsuspensie homogeen is.
  6. Apparaat invoegen
    OPMERKING: Zodra het cel:hydrogelmengsel is bereid, moet het in de apparaten worden geplaatst.
    1. Haal autoclaaf microfluïdische apparaten uit de oven van 80 °C en plaats ze ten minste 1 uur in de bioveiligheidskast voordat de celophanging wordt ingebracht, zodat de apparaten kunnen afkoelen tot kamertemperatuur met behoud van steriliteit.
    2. Plaats de apparaten in petrischalen van 60 x 15 mm, op 3-4 apparaten per schaal. Vul een Petrischaal van 150 x 15 mm met een dunne laag DI H2O om 3 van de 60 x 15 mm Petrischalen vast te houden. Deze stap creëert een bevochtigde omgeving rond de microfluïdische apparaten.
    3. Gebruik een nieuwe tip en resuspend de cel: hydrogel mengsel grondig door pipetting de suspensie terwijl de buis blijft op ijs.
    4. Steek de tip in de injectiepoort van het apparaat en injecteer langzaam en gestaag 3 μL van de cel: hydrogelsuspensie in de weefselgebiedinlaat van een microfluïdisch apparaat met behulp van een pipetpunt van 20 μL. Zodra de poort is gevuld, stopt u de injectie en verwijdert u de punt. Herhaal dit voor alle apparaten of de volledige voorbereide hydrogelsuspensie.
      OPMERKING: Het kleine volume van de cel: hydrogel suspensie warmt zeer snel op / koelt af, dus het is relevant om de suspensie zo lang mogelijk op ijs te houden. Pipet bij het inbrengen de oplossing van het ijs en plaats deze zo snel mogelijk in apparaten, omdat de hydrogel in de pipetpunt kan gaan polymeriseren. Het is belangrijk om kleine volumes van de cel te maken: hydrogel-suspensie tegelijk, dus als veel apparaten moeten worden geïnjecteerd, moet de cel: hydrogel-suspensie vers worden gemaakt voor elke set van 4 apparaten.
    5. Draai de apparaten in hun Petri-schalen met een pincet en plaats ze in de grote Petrischaal met water. Incubeer gedurende 9 minuten in een incubator van 37 °C voor hydrogelpolymerisatie.
    6. Haal de apparaten uit de incubator, draai de apparaten rechtop en incubeer gedurende 9 minuten bij 37 °C om hydrogelpolymerisatie te voltooien.
    7. Injecteer RPMI + B27 + insuline in de flankerende mediakanalen (~20 μL per apparaat). Plaats de apparaten terug in de incubator bij 37 °C. Verander de media binnen de mediakanalen elke dag met verse RPMI + B27 + insuline. Het is aangetoond dat de apparaten van 14-21 dagen20worden gekweekt.
      OPMERKING: Vanwege het kleine volume media per chip, om verdamping van media te voorkomen, is het belangrijk om de apparaten te onderhouden in een grote Petrischaal gevuld met DI H2O, die dient als bevochtigde kamer. Bovendien kunnen kleine druppeltjes overtollige RPMI + B27 + insuline tijdens routinematige mediaveranderingen op de bovenkant van de kanaalinlaten/-uitgangen worden gepijpt.

4. Weefselanalyse

  1. Live beeldvorming
    OPMERKING: Alle live beeldvorming moet worden uitgevoerd met een stadium incubator om 37 °C en 5% CO2te behouden.
    1. Plaats apparaten in een milieuvriendelijke fase-incubator. Neem 30 s-video's op van meerdere plekken in elk apparaat met de maximale framesnelheid.
    2. Om de contractiliteit van het weefsel na het extraheren van de klopsignalen te beoordelen, gebruikt u de aanvullende op maat geschreven MATLAB-code om pieken te extraheren (Aanvullend bestand 2) voor het berekenen van de variabiliteit van het interval tussen de kloppen.
    3. Verander media in apparaten in de celkweekkap en plaats ze vervolgens terug in de celkweek-incubator.
  2. Immunofluorescente kleuring
    1. PBS-Glycine bereiden: Los 100 mM glycine op in PBS en voeg 0,02% NaN3 toe voor langdurige opslag. Stel de pH in op 7,4.
    2. PBS-Tween-20 voorbereiden: Voeg 0,05% Tween-20 toe aan PBS en voeg 0,02% NaN3 toe voor langdurige opslag. Stel de pH in op 7,4.
    3. If-buffer voorbereiden: Voeg 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA en 0,05% Tween-20 toe aan PBS en voeg 0,02% NaN3 toe voor langdurige opslag. Stel de pH in op 7,4.
    4. Bereid 10% Geitenserum: Resuspendeer het gevlyofilieerde geitenserum in 2 ml PBS om 100% geitenserum te maken. Verdun vervolgens de 2 ml met 18 ml PBS om 10% geitenserum te maken.
    5. Bevestig de monsters door 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan de weefselkanalen en gedurende 20 minuten bij 37 °C te broeden.
    6. Was de cellen door PBS-Glycine 2x toe te voegen aan de weefselkanalen gedurende 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
    7. Was de cellen door PBS -Tween-20 toe te voegen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
    8. Permeabiliseer de cellen door IF-buffer toe te voegen aan de weefselkanalen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Blokkeer de cellen door 10% geitenserumoplossing toe te voegen aan de weefselkanalen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    10. Verdun de niet-geconjugeerde primaire antilichamen in 10% geitenserum in de gewenste concentraties (zie aanvullend dossier 3),voeg toe aan de weefselkanalen en incubeer de monsters 's nachts bij 4 °C.
    11. Was de volgende dag de monsters door PBS-Tween-20 toe te voegen aan weefselkanalen 3x gedurende 20 minuten elk bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Voer vanaf stap 4.2.12 alle taken in het donker uit, zodat de monsters tegen licht worden beschermd.
    12. Verdun de secundaire antilichamen in PBS-Tween-20 in de gewenste concentraties, centrifugeer gedurende 10 minuten op 10.000 x g om eventuele neerslag te verzamelen en voeg vervolgens toe aan de weefselkanalen.
    13. Was de monsters na 30 min-1 uur met PBS-Tween-20 3x gedurende elk 10 min op kamertemperatuur.
    14. Voeg anti-fade of gewenst montagemedium toe aan de weefselkanalen. Vervolgens kunnen de monsters worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie of met een confocale microscoop, als een hogere vergroting gewenst is. Om het hele 3D-weefsel te visualiseren, kunnen afbeeldingen op verschillende z-vlakken worden gestapeld en gereconstrueerd om representatieve 3D-beelden te vormen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een sterk gezuiverde populatie CMs van hiPSC's te verkrijgen, wordt een aangepaste versie gebruikt met een combinatie van het Lian differentiatieprotocol33 en Tohyama zuiveringsstappen34 (zie figuur 1A voor experimentele tijdlijn). De hiPSC's moeten kolonieachtig zijn, ~85% samenvloeiend en zich 3-4 dagen na passage gelijkmatig over de cultuur verspreiden, bij het begin van CM-differentiatie (Figuur 1B). Specifi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorming van een in vitro menselijk hartweefselmodel met verbeterde celcelinteracties en biomimetische 3D-structuur is noodzakelijk voor fundamenteel cardiovasculair onderzoek en overeenkomstige klinische toepassingen1. Dit geschetste protocol verklaart de ontwikkeling van 3D humaan anisotroop hartweefsel in een microfluïdisch apparaat, met behulp van co-cultuur van stamcel-afgeleide CMs met bindweefsel CB's ingekapseld in een collageenhydrogel, die dienen om de complexe celsamenstellin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) en de Flinn Foundation Award bedanken voor het verstrekken van financieringsbronnen voor dit project. De hiPSC-lijn, SCVI20, werd verkregen van Joseph C. Wu, MD, PhD aan het Stanford Cardiovascular Institute gefinancierd door NIH R24 HL117756. De hiPSC-lijn, IMR90-4, werd verkregen van WiCell Research Institute55,56.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308De coverslips moeten No.1 zijn, om hoge vergrotingsbeeldvorming mogelijk te maken
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001kan ook in huis worden gemaakt
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147(2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033(2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29(2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397(2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105(2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883(2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741(2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195(2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810(2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809(2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657(2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133(2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Cardiac TissueMicrofluidic PlatformCardiac Tissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsCardiomyocyte DifferentiationCardiac Tissue On ChipCollagen Hydrogel EncapsulationCell AlignmentCardiac Fibroblast Co CultureTissue Polymerization

Related Articles