Dit protocol beschrijft de bereiding van organotypische plakculturen (OTSC's). Deze techniek vergemakkelijkt de ex vivo kweek van intact meercellig weefsel. OTSC's kunnen onmiddellijk worden gebruikt om te testen op hun respectieve respons op geneesmiddelen in een meercellige omgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Organotypische plakculturen als preklinische modellen van tumormicro-omgeving bij primaire alvleesklierkanker en metastase
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Realistische preklinische modellen van primaire alvleesklierkanker en metastase zijn dringend nodig om de therapierespons ex vivo te testen en een gepersonaliseerde behandeling van de patiënt mogelijk te maken. De afwezigheid van tumorspecifieke micro-omgeving in de momenteel gebruikte modellen, bijvoorbeeld patiënt-afgeleide cellijnen en xenotransplantaten, maakt echter slechts beperkte voorspellende inzichten mogelijk. Organotypische plakculturen (OTSC's) bestaan uit intact meercellig weefsel, dat snel kan worden gebruikt voor het testen van de ruimtelijk opgeloste geneesmiddelrespons.
Dit protocol beschrijft het genereren en kweken van levensvatbare tumorplakjes van alvleesklierkanker en de metastase ervan. In het kort wordt weefsel gegoten in agarose met een laag smeltpunt en opgeslagen in een koude isotone buffer. Vervolgens worden weefselplakjes van 300 μm dikte gegenereerd met een vibratoom. Na de bereiding worden de plakjes gekweekt op een lucht-vloeistofinterface met behulp van celcultuurinzetstukken en een geschikt kweekmedium. Tijdens de teelt kunnen veranderingen in celdifferentiatie en levensvatbaarheid worden gevolgd. Bovendien maakt deze techniek het mogelijk om de behandeling ex vivo toe te passen op levensvatbaar menselijk tumorweefsel en daaropvolgende stroomafwaartse analyses, zoals transcriptoom- en proteoomprofilering.
OTSC's bieden een unieke mogelijkheid om de individuele behandelingsrespons ex vivo te testen en individuele transcriptomische en proteomische profielen te identificeren die verband houden met de respectieve respons van afzonderlijke plakjes van een tumor. OTSC's kunnen verder worden onderzocht om therapeutische strategieën te identificeren om de behandeling van primaire alvleesklierkanker en metastase te personaliseren.
Inleiding
Bestaande preklinische modellen van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en de respectieve metastasen zijn slechte voorspellers van de respons op de behandeling bij patiënten, wat een groot nadeel is bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en de identificatie van voorspellendebiomarkers. Hoewel modellen zoals van patiënten afgeleide organoïden en van patiënten afgeleide xenotransplantaten veelbelovend zijn, blijft het gebruik ervan beperkt2. Belangrijke beperkingen van deze in vitro modellen zijn het ontbreken van de tumormicro-omgeving en xenotransplantatie bij niet-menselijke immuungecompromitteerde soorten. Vooral op het gebied van PDAC en zijn metastasen heeft de micro-omgeving van de tumor de laatste jaren aanzienlijk aan belangstelling gewonnen vanwege zijn cruciale functies in de tumorbiologie. Het bestaat uit cellulaire en acellulaire componenten, zoals (myo-)fibroblasten, pancreasstellaatcellen, immuuncellen, bloedvaten, extracellulaire matrix, cytokinen en groeifactoren3. Deze micro-omgeving is geen niet-functionele tumorcomponent, maar induceert tumorprogressie en metastase en lijkt substantieel bij te dragen aan resistentie tegen radio- en chemotherapie4. De PDAC-micro-omgeving compromitteert niet alleen mechanisch de medicijnafgifte, maar heeft ook een immuun- en medicijnopruimende activiteit 5,6,7. Er zijn dus dringend preklinische modellen nodig die de complexe interactie van tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor weerspiegelen om de behandelingsrespons van patiënten ex vivo adequaat te testen en een geïndividualiseerde klinische behandeling te begeleiden.
Ex vivo culturen van verse tumormonsters vertegenwoordigen een nauwe benadering van de tumor in situ. Organotypische plakculturen (OTSC's) zijn onlangs ontwikkeld en bestudeerd voor verschillende tumoren, zoals hoofd-, nek-, borst-, prostaat-, long-, colon- en pancreaskanker 8,9,10,11,12. Het is aangetoond dat OTSC's hun basismorfologie, proliferatieve activiteit en micro-omgeving behouden tijdens de teelt gedurende een gedefinieerde, weefselafhankelijke periode 11,12,13. OTSC's van PDAC's behielden hun levensvatbaarheid, morfologie en de meeste componenten van hun tumormicro-omgeving gedurende 4-9 dagen in verschillende in vitro onderzoeken 5,12,14. Perspectief maakt deze techniek een onmiddellijke toepassing van de behandeling op levensvatbaar menselijk tumorweefsel ex vivo en daaropvolgende stroomafwaartse analyses mogelijk, zoals profilering van het transcriptoom en proteoom.
De oprichting van OTSC's biedt een unieke kans om de respons op de behandeling ex vivo onmiddellijk na de operatie te testen. OTSC's zullen het dus prospectief mogelijk maken om therapeutische strategieën te identificeren om de behandeling van gemetastaseerde ziekte te personaliseren. Dit protocol beschrijft het genereren en kweken van levensvatbare OTSC's van alvleesklierkanker.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Weefselmonsters werden verzameld en verwerkt na goedkeuring door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Lübeck (# 16-281).
1. Verzamelen en hanteren van vers weefsel
OPMERKING: Elk niet-gefixeerd menselijk weefselmonster moet met de nodige voorzichtigheid worden behandeld om het risico op infectie door door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen. Alle patiënten moeten worden getest om negatief te zijn op HIV, HBV en HCV voorafgaand aan weefselverwerking. Draag een beschermende jas en hanteer menselijke weefselmonsters met handschoenen.
- Verzamel vers, niet-gefixeerd en niet-ingevroren PDAC-weefselmonster met een minimale grootte van 0,4 x 0,4 cm onmiddellijk na de operatie en vervoer het monster naar het laboratorium in een weefselopslagoplossing.
- Verwerk het verse weefsel indien mogelijk onmiddellijk.
- U kunt de tissues ook een nacht bewaren in een tissueopslagoplossing op nat ijs bij 4 °C. Weefselopslag kan echter leiden tot verminderde levensvatbaarheid en moet in het algemeen worden vermeden.
2. Voorbereiding
- Bereiding van agarose met laag smelten
- Bereid 100 ml agarose met een laag smeltende laag smelten (8%) door 8 g agarose op te lossen in 100 ml voorverwarmde Ringer-oplossing en bewaar dit bij 4 °C tot het nodig is.
- Bij de aankondiging van tumorresectie, smelt de agarose in een magnetron.
- Plaats de agarose in een voorverwarmd waterbad (37 °C) en laat het afkoelen tot fysiologische temperaturen vóór de bereiding.
- Vibratome instelling
- Plaats een scheermesje in de houder van de vibratoom en voer een geautomatiseerde hoekverstelling uit volgens de instructies van de fabrikant, indien van toepassing.
- Koel de mantel van de snijkamer af met behulp van een koeleenheid of natijs.
- Vul de snijkamer met ongeveer 100 ml van een fysiologische snijoplossing (bijv. Ringer's oplossing).
- Plaats het gemonteerde scheermesje in de voorgekoelde snijoplossing, zodat het scheermesje kan afkoelen.
3. Weefselinbedding in agarose met een laag smeltend gehalte
- Was het weefselmonster met gekoelde (4 °C) PBS en plaats het weefsel in PBS op een grote (~14 cm) petrischaal op ijs.
- Verwijder macroscopisch zichtbaar overtollig bindweefsel op ijs met een scalpel, omdat dit de snij-efficiëntie kan belemmeren.
- Plaats het zakdoekje in een klein petrischaaltje (~3 cm).
- Pas de weefseloriëntatie aan zodat het resterende macroscopisch zichtbare bindweefsel dezelfde oriëntatie heeft als het vlak van de bodem van de petrischaal. De bodem van de petrischaal heeft dezelfde oriëntatie als het snijvlak.
- Giet de bereide laagsmeltende agarose in de kleine petrischaal.
- Pas de oriëntatie van het weefsel indien nodig opnieuw aan met behulp van een pincet.
- Plaats de petrischaal op nat ijs voor een snellere uitharding van de agarose.
- Snijd het weefsel voorzichtig door met een scalpel en laat aan elke kant van het weefsel ten minste 5 mm rondom agarose over.
- Breng het ingebedde weefsel voorzichtig over en lijm het met superlijm op de monsterhouder.
- Plaats na een paar seconden de monsterhouder in de snijkamer.
- Pas indien nodig de oriëntatie van het weefsel ten opzichte van het scheermesje aan.
4. Snijden van het in agarose ingebedde weefsel met behulp van een vibratoom
- Definieer de buitengrenzen van het snijbereik (y-as) op basis van de grootte van het weefselmonster.
- Stel het mes af in de richting van de bovenkant van het weefselblok.
- Stel de snijsnelheid in op 0,04 mm/s, de snijamplitude op 1 mm en de plakdikte op 300 μm.
- Snijd de eerste plakjes voorzichtig en doe de plakjes in een aparte bak met voorgekoelde (4 °C) snijoplossing op nat ijs.
5. Cultuur van organotypische plakculturen
- Bereid een bord met 6 putjes voor met 1 ml van het juiste kweekmedium per putje.
- Medium A: Geavanceerd DMEM/F12, 10% FBS, 1% Penicilline/Streptomycine.
- Medium B: RPMI 1640, 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 4 μg/ml insuline, 8 ng/ml EGF, 0,3 μg/ml hydrocortison.
OPMERKING: Het medium voor optimale kweekomstandigheden kan variëren, afhankelijk van het weefsel en de patiënt. Er werden twee verschillende weefselkweekmedia vergeleken, één op basis van DMEM/F12 (medium A), de tweede op basis van RPMI (medium B). Er werden geen substantiële verschillen ontdekt tussen deze media. Voor alle experimenten die in dit protocol worden getoond, is medium A gebruikt.
- Plaats de plaat met 6 putjes met het medium in een incubator en laat de temperatuur en pH aanpassen voordat u gaat kweken.
- Plaats plakjes op celcultuurinzetstukken (bijv. hydrofiele PTFE-inzetstukken met een poriegrootte van 0,4 μm) met behulp van een gazefilter.
- Verwijder overtollige snijoplossing door het geladen filter op een steriele doek te plaatsen.
- Plaats het geladen filter in de voorbereide plaat met 6 putjes. Voeg geen extra medium toe aan het inzetstuk.
- Plaats de plaat met 6 putjes in een incubator (37 °C, 5% CO2).
- Vervang het medium elke 2 dagen door stap 5.1, 5.2 en 5.5 te herhalen met een nieuwe plaat met 6 putjes.
OPMERKING: Organotypische plakculturen kunnen gedurende verschillende perioden worden gekweekt, afhankelijk van de individuele onderzoeksvraag.
6. De levensvatbaarheidstest van resazurin
OPMERKING: De resazurine-levensvatbaarheidstest meet de algemene metabolische activiteit van de organotypische plakculturen op basis van de reductie van niet-fluorescerend blauw resazurine tot rood fluorescerend resorufin in levende cellen15. De test heeft geen toxische effecten op cellen en kan herhaaldelijk op de culturen worden toegepast, afhankelijk van de individuele onderzoeksvraag. De levensvatbaarheid werd elke 2-3 dagen gemeten met behulp van de resazurine-assay.
- Bereiding van resazurine-voorraadoplossing
- Doe het licht van de steriele kap uit, aangezien resazurin-voorraadoplossing lichtgevoelig is.
- Bereid een bouillonoplossing met 10 mg/ml resazurinenatriumzout in 1x PBS.
- Bewaar de bouillonoplossing in licht beschermde hoeveelheden bij 4 °C in de koelkast tot gebruik.
- Beoordeling van de algehele levensvatbaarheid van segmenten
- Doe het licht van de steriele kap uit, aangezien resazurin-voorraadoplossing lichtgevoelig is.
- Verdun de resazurine-bouillonoplossing 1:250 met een geschikt medium.
OPMERKING: Het medium dat voor de verdunning wordt gebruikt, moet hetzelfde zijn als voor de teelt (medium A of medium B). - Bereid 1 ml van de uiteindelijke resazurine-oplossing per plak en voeg nog eens 1 ml toe voor de blancocontrole, bijv. verdun voor 6 plakjes 28 μl resazurine-bouillonoplossing in 7 ml medium.
- Doseer de resazurineoplossing in platen met 6 putjes, met 1 ml van de verdunde resazurineoplossing per putje.
- Breng de teeltfilters met de plakjes over in de putjes met de resazurine-oplossing. Eén put met de resazurine-oplossing wordt leeg gehouden als blanco controle.
OPMERKING: Om de experimentele procedure te vereenvoudigen, kan deze stap worden gecombineerd met het wijzigen van het medium (stap 5.7). In het geval dat echter aanvullende levensvatbaarheidsmetingen nodig zijn, kan de test op elk moment tijdens de teelt van de plakculturen worden uitgevoerd. - Plaats de weefselschijfjes gedurende 1 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Bereid nieuwe platen met 6 putjes voor met het kweekmedium als de plakcultuur wordt voortgezet (zie stappen 5.1 en 5.2).
- Verwijder de kweekfilters met de plakjes uit de resazurine-oplossing en verwijder overtollige oplossing door het geladen filter op een steriele doek te plaatsen.
- Breng de kweekfilters met de plakjes over op de eerder voorbereide kweekplaat.
- Neem uit elk putje met 6 putjes 100 μL resazurineoplossing en breng dit over op een plaat met 96 putjes. Plaats vanuit blanco controle drie monsters (3 x 100 μl) in aparte putjes van de plaat met 96 putjes.
- Kwantificeer het uitsterven met een plaatfotometer volgens de instructies van de fabrikant. De excitatiegolflengte is ingesteld op 545 nm en de emissiegolflengte is ingesteld op 600 nm.
7. Formalinefixatie en paraffine-inbedding van OTSC's
- Breng de gekweekte weefselplakken voorzichtig over in een plastic inbeddingscassette. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
- Plaats het kweekfilter met de gemonteerde plak op een petrischaaltje.
- Knip met een scalpel voorzichtig het filtermembraan uit met de gemonteerde weefselplak.
- Breng het filtermembraan met de gemonteerde plak voorzichtig over in een biopsiezak en plaats deze in een inbeddingscassette.
- Breng vervolgens de plastic inbeddingscassettes over in een container met voorgekoelde (4 °C) 4,5% formaline. Plakjes kunnen tot verder gebruik in formaline-oplossing bij 4 °C worden bewaard, maar moeten ten minste 24 uur worden geïncubeerd.
OPMERKING: OTSC's moeten met grote voorzichtigheid worden overgedragen, omdat ze gemakkelijk uit elkaar scheuren.
- Spoel de met formaline gefixeerde plakcultuur voorzichtig af met stromend kraanwater gedurende 1,5 uur.
- Dehydrateer de met formaline gefixeerde weefselplak door incubatie in 70% ethanol (2x gedurende 3 uur), 95% ethanol (1x voor 's nachts, 1x voor 3 uur), gevolgd door absolute ethanol (1x voor 3 uur, 1x voor 's nachts).
- Verwijder de met formaline gefixeerde weefselplak door 3 uur incubatie in xyleen tweemaal.
- Dompel het weefsel onder met paraffine bij 60 °C (1x voor een nacht, 1x voor 2 uur). Veranker het weefsel in een paraffineblok in een weefselinbeddingsmal.
- Snijd het in paraffine ingebedde weefselblok op 4 μm dikte in met een microtoom en drijf het in een waterbad van 40 °C met gedestilleerd water. Breng de secties over op glasplaatjes.
- Incubeer paraffinecoupes gedurende 1 uur bij 60 °C om het weefsel aan het glas te hechten. Laat de objectglaasjes een nacht incuberen bij 37 °C.
8. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring
- Ontparaffiniseer secties uit stap 7.7 door incubatie in xyleen (3x gedurende 5 min).
- Rehydrateer door incubatie in absolute alcohol (2x gedurende 5 min), 95% alcohol (2x gedurende 5 min) en 70% alcohol (1x gedurende 5 min). Spoel kort af met gedestilleerd water.
- Vlek in Mayer hematoxyline-oplossing gedurende 5 min. Spoel af met stromend kraanwater gedurende 10 min.
- Tegenvlek in 0,5% Eosine-oplossing gedurende 40 s. Spoel af met gedestilleerd water.
- Dehydrateer door incubatie in respectievelijk 70% alcohol (maximaal 1 min), 95% ethanol (2x gedurende 3 min) en absolute alcohol (2x gedurende 3 min).
- Helder in drie veranderingen van xyleen (elk enkele seconden). Plaats een druppel montagemedium en dek de dia's af met een dekglaasje.
9. Immunohistochemie van OTSC's
- Deparaffiniseer secties door incubatie in xyleen 2x gedurende 10 min, gevolgd door 1:1 ethanol/xylol gedurende 10 min.
- Breng de dia's over naar 100% ethanol (2x gedurende 3 min), 96% ethanol (2x gedurende 3 min), 70% ethanol (1x gedurende 3 min) en vervolgens naar 50% ethanol (1x gedurende 3 min).
- Voer antigeenextractie uit om het antigene epitoop te ontmaskeren. Verwarm de glaasjes in een magnetron in citraatbuffer gedurende 5 min op 900 W, gevolgd door 2x gedurende 8 min op 600 W. Laat de glaasjes 20 min afkoelen tot kamertemperatuur.
- Wassen in PBS 3x gedurende 3 min op een shaker.
- Voer permeabilisatie van celmembranen uit door incubatie in 0,1% Triton X-100 in PBS (200 μL per objectglaasje) in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Was in PBS voor drie wisselingen, elk 3 minuten op de shaker.
- Incubeer secties met 3% H2O2-oplossing in methanol (200 μL per objectglaasje) in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te blokkeren.
- Wassen in PBS 3x gedurende 3 min op een shaker.
- Voeg 200 μL blokkeerbuffer toe (1:50 paardenserum in PBS) en incubeer in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 25 min.
- Laat de blokkeerbuffer van de objectglaasjes weglopen door de dia op een papieren zakdoekje te kantelen.
- Breng 200 μl adequaat verdund primair antilichaam in antilichaamverdunningsmiddel aan op de objectglaasjes en incubeer gedurende een nacht in een bevochtigde kamer bij 4 °C. Gebruik als negatieve controle de juiste isovorm van immunoglobulinen van muizen in dezelfde verdunning als het primaire antilichaam.
- Was 3x gedurende 3 min in PBS op een shaker.
- Breng 200 μL gebiotinyleerd secundair antilichaam (1:50 oplossing in PBS) aan op de objectglaasjes en incubeer in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Was 3x gedurende 3 min in PBS op een shaker.
- Bereid het peroxidasecomplex op basis van avidine/biotine voor volgens de instructies van de fabrikant voordat u het aanbrengt. Breng 200 μL avidine-biotine-peroxidasecomplex aan op de objectglaasjes en incubeer in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Was 3x gedurende 3 min in PBS op een shaker.
- Breng 200 μL DAB-substraatoplossing aan (vers gemaakt direct voor gebruik: 1 druppel DAB in 1 ml substraat), 200 μL per objectglaasje. Laat de kleurontwikkeling 1-3 minuten duren totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt.
- Spoel af met stromend kraanwater gedurende 10 min.
- Voorkom de vlekken van de objectglaasjes door de zijkanten gedurende 5 minuten onder te dompelen in hematoxyline.
- Spoel af met stromend kraanwater gedurende 10 min.
- Dek de glaasjes af met waterig montagemedium en dekglaasjes. De gemonteerde objectglaasjes kunnen permanent bij kamertemperatuur worden bewaard.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een overzicht van de workflow om OTSC's te kweken uit vers, niet-bevroren tumorweefsel. Monsters van primaire PDAC's en metastasen werden direct na chirurgische resectie verzameld en 's nachts opgeslagen op nat ijs bij 4 °C in de weefselopslagoplossing. De monsters werden verwerkt en de plakjes werden gekweekt zoals beschreven in het protocol. De macroscopische morfologie van elke OTSC veranderde niet ingrijpend tijdens de teelt. De grootte van het oppervlak van de OTSC's nam ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
OTSC's van verse tumormonsters zijn een nauwe benadering van de tumor in situ. Ze behouden hun basismorfologie, proliferatieve activiteit en micro-omgeving tijdens de teelt gedurende een gedefinieerde, weefselafhankelijke periode 11,12,13. Deze techniek maakt het mogelijk om de behandeling onmiddellijk ex vivo toe te passen op levensvatbaar menselijk tumorweefsel en daaropvolgende stroomafwaartse analyses, zoal...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs maakten geen mogelijke belangenconflicten bekend.
Dankbetuigingen
R. Braun werd ondersteund door de Clinician Scientist School Lübeck (DFG #413535489) en het Junior Funding Program van de Universiteit van Lübeck.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco | 12634028 | |
| Agarose Low Melt | Roth | 6351.2 | 8% in Ringer oplossing |
| Antibody Diluent, Background Reducing | Dako | S3022 | |
| AquaTex | Merck | 108562 | |
| Bioethanol (99%, gedenatureerd) | CHEMSolute | 2,21,19,010 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 9664 | 1:400 verdunning |
| Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades | Derby Tokai | ||
| Embedding cassettes | Roth | H579.1 | |
| Eosin Y-oplossing 0,5% waterig | Merck | 10,98,44,100 | |
| Eukitt Quick hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Formaldehyde oplossing 4,5%, gebufferd | Büfa Chemikalien | B211101000 | |
| Hem alum oplossing zuur volgens Mayer | Roth | T865 | |
| Human EGF | Milteniy Biotec | 130-097-794 | |
| Hydrocortison | Sigma Aldrich (Merck) | H0888 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1,08,59,71,000 | |
| Human insulin | Sigma Aldrich (Merck) | 12643 | |
| Liquid DAB+ Substraat Chromogen Systeem | Dako | K3468 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Milteniy Biotech | 130-100-008 | |
| Methanol | Merck | 10.600.092.500 | |
| Microscope Slides Superfrost Plus | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrofiel PTFE, 0,4 µm | Millipore (Merck) | PICM0RG50 | |
| Monoclonal mouse anti-human Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30) | Dako | M7018 | 1:200 verdunning |
| Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1 | Dako | M7240 | 1:200 verdunning |
| Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9) | Dako | M0725 | 1:200 verdunning |
| Negative control Mouse IgG2a | Dako | X0943 | 1:200 verdunning |
| Negative control Mouse IgG1 | Dako | X093101-2 | 1:200 verdunning |
| Paraffin (smelttemperatuur 56°- 58°) | Merck | 10,73,37,100 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade | Gibco | A12860301 | |
| Resazurin natriumzout; 10 mg/ml in PBS | Sigma Aldrich | R7017 | 1:250 verdunning |
| Ringer's oplossing | Fresenius Kabi | 2610813 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma Aldrich (Merck) | R8758 | |
| Tissue culture testplate 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| Xylene (extra zuiver) | J.T.Baker | 8,11,85,000 | |
| Equipment | |||
| ClarioStar Microplate Reader | BMG Labtech | ||
| Paraffin Embedding Center E61110 | Leica | ||
| Rotary Microtome Microm HM355S | Thermo Scientific | ||
| Section Transfer System Microm STS | Thermo Scientific | ||
| VT 1200S Vibratom | Leica |
Referenties
- Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Waghray, M., Yalamanchili, M., di Magliano, M. P., Simeone, D. M. Deciphering the role of stroma in pancreatic cancer. Current Opinion in Gastroenterology. 29 (5), 537-543 (2013).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).
- Hessmann, E., et al. Fibroblast drug scavenging increases intratumoural gemcitabine accumulation in murine pancreas cancer. Gut. 67 (3), 497-507 (2018).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Science Reports. 9 (1), 2133(2019).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Beutler, B., Cerami, A. Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator. Annual Review of Biochemisty. 57, 505-518 (1988).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
