Methodenartikel

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62553

⸱

28 april 2021

 ,  ,  , 
1Oncology Division, Genome Stability Laboratory, CHU de Québec Research Center, HDQ Pavilion, 2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Laval University Cancer Research Center, 3Oncology Division, CHU de Québec Research Center, CHUL Pavilion

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Samenvatting

De studie van de DNA-schaderespons (DDR) is een complex en essentieel veld, dat alleen maar belangrijker is geworden door het gebruik van DDR-gerichte geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Deze doelwitten zijn poly(ADP-ribose) polymerasen (PARP's), die verschillende vormen van DNA-reparatie initiëren. Het remmen van deze enzymen met behulp van PARP-remmers (PARPi) bereikt synthetische letaliteit door een therapeutische kwetsbaarheid te verlenen in homologe recombinatie (HR) -deficiënte cellen als gevolg van mutaties in borstkanker type 1 (BRCA1), BRCA2 of partner en localizer van BRCA2 (PALB2).

Cellen behandeld met PARPi accumuleren DNA dubbelstrengs breuken (DSB's). Deze breuken worden verwerkt door de DNA-eindresectiemachinerie, wat leidt tot de vorming van enkelstrengs (ss) DNA en daaropvolgende DNA-reparatie. In een BRCA1-deficiënte context veroorzaakt het nieuw leven inblazen van DNA-resectie door mutaties in DNA-resectieremmers, zoals 53BP1 en DYNLL1, PARPi-resistentie. Daarom is het kunnen monitoren van DNA-resectie in cellulo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om PARPi-resistentie te overwinnen. Immunofluorescentie (IF)-gebaseerde technieken maken het mogelijk om wereldwijde DNA-resectie na DNA-schade te monitoren. Deze strategie vereist lange-puls genomische DNA-etikettering met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU). Na DNA-schade en DNA-eindresectie wordt het resulterende enkelstrengs DNA specifiek gedetecteerd door een anti-BrdU-antilichaam onder inheemse omstandigheden. Bovendien kan DNA-resectie ook worden bestudeerd met behulp van celcyclusmarkers om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus. Cellen in de S/G2-fase maken de studie van eindresectie binnen HR mogelijk, terwijl G1-cellen kunnen worden gebruikt om niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) te bestuderen. Een gedetailleerd protocol voor deze IF-methode gekoppeld aan celcyclusdiscriminatie wordt in dit artikel beschreven.

Inleiding

Modulatie van DNA-reparatiefactoren is een steeds evoluerende methode voor kankertherapie, met name in DNA DSB-reparatie-deficiënte tumoromgevingen. De remming van specifieke reparatiefactoren is een van de ingenieuze strategieën die worden gebruikt om kankercellen te sensibiliseren voor DNA-schadelijke stoffen. Tientallen jaren van onderzoek leidden tot de identificatie van verschillende mutaties van DNA-reparatiegenen als biomarkers voor therapeutische strategiekeuzes1. Bijgevolg is het DNA-reparatieveld een hub geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen om een breed scala aan behandelingen te garanderen, waardoor het concept van gepersonaliseerde geneeskunde wordt versterkt.

DSB's worden gerepareerd door twee hoofdroutes: NHEJ en HR2. De NHEJ-route is foutgevoelig, waardoor de twee DNA-uiteinden snel worden geligeerd met weinig tot geen DNA-eindverwerking en waarbij het eiwitkinase (DNA-PKcs), het Ku70/80-complex, 53BP1 en RIF1-eiwitten3 betrokken zijn. HR daarentegen is een getrouw mechanisme geïnitieerd door BRCA14. Een essentiële stap in HR-reparatie is het DNA-end resectieproces, dat is de afbraak van de gebroken uiteinden die leidt tot enkelstrengs (ss) DNA met 3'-OH-uiteinden. BRCA1 vergemakkelijkt de rekrutering van de downstream eiwitten die het resectosoom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 vormen, die betrokken zijn bij de 5' tot 3' DNA-resectie5.

De initiële eindresectie wordt bereikt door de endonuclease-activiteit van MRE11, waardoor verdere verwerking door de DNA2- en EXO1-nucleasen mogelijk is. De gegenereerde ssDNA-overhangen worden snel gecoat met Replicatie-eiwit A (RPA) om ze te beschermen tegen verdere verwerking. Vervolgens nemen BRCA2, PALB2 en BRCA1 deel aan de bemiddeling van de verplaatsing van RPA en de assemblage van het RAD51-nucleofilament dat nodig is voor homologiegericht reparatiemechanisme. Een fijne balans tussen het gebruik van NHEJ en HR is noodzakelijk voor het optimale behoud van de genomische integriteit. De routekeuze hangt af van de celcyclusfase. HR wordt bij voorkeur gebruikt tijdens de S tot G2-fasen waarin DNA-resectie op het hoogste niveau is en de zusterchromatiden beschikbaar zijn om een goede reparatie te garanderen.

Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is een van de vroegste eiwitten die voor de DSB worden gerekruteerd. Het regelt zowel de resectieactiviteit als de assemblage van stroomafwaartse effectoren die betrokken zijn bij de NHEJ5,6. PARP-1 is ook vereist voor DNA enkelstrengs breukherstel tijdens replicatie7,8. Vanwege de belangrijke rol in DNA-reparatie worden PARP-remmers (PARPi) gebruikt als kankertherapieën. Bij verschillende HR-deficiënte kankers leidt parpi-behandeling tot een synthetische letale respons als gevolg van het onvermogen van HR-deficiënte cellen om de geaccumuleerde schade te herstellen via een alternatieve route9,10. Er zijn momenteel vier door de FDA goedgekeurde PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib en Talazoparib (ook wel BMN 673 genoemd), die worden gebruikt voor verschillende borst- en eierstokkankerbehandelingen11. PARPi-resistentie komt echter vaak voor en één mogelijke oorzaak ontstaat door de herovering van HR-vaardigheid12. Verlies of remming van PARP-1 in aanwezigheid van bestraling ontregelt de resectosoommachinerie, wat leidt tot de accumulatie van langere ssDNA-traktaten13. Daarom is een diepgaande studie van DNA-resectie in vivo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de daaropvolgende ontwikkeling van nieuwe strategieën om kanker te behandelen en PARPi-resistentie te overwinnen.

Er zijn verschillende methoden gebruikt om DNA-resectiegebeurtenissen te detecteren5. Een van die methoden is de klassieke IF-gebaseerde techniek die indirecte kleuring en visualisatie van het gereseceerde DNA na stress-geïnduceerde DSB mogelijk maakt met behulp van een anti-RPA-antilichaam. Het labelen van genomisch DNA met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) en het detecteren van alleen ssDNA is een directe meting van DNA-resectiegebeurtenissen. Het omzeilt de monitoring van RPA, die betrokken is bij meerdere cellulaire processen zoals DNA-replicatie. In de hier beschreven methode zorgen cellen geïncubeerd met BrdU voor een enkele celcyclus ervoor dat BrdU kan worden opgenomen in één streng van het replicerende cellulaire DNA. Na resectie wordt IF-kleuring uitgevoerd onder omstandigheden die BrdU-detectie alleen in de ssDNA-vorm mogelijk maken, met behulp van een anti-BrdU-antilichaam. Dit antilichaam heeft alleen toegang tot blootgestelde BrdU-nucleotiden en zal die niet detecteren die zijn geïntegreerd in dubbelstrengs DNA. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kan het gereseceerde DNA worden gevisualiseerd in de vorm van punctate BrdU/ ssDNA-foci. De nucleaire intensiteit van deze foci kan worden gebruikt als een uitlezing om resectie na DNA-schade te kwantificeren. Dit artikel beschrijft stap voor stap de processen van deze methode, die kunnen worden toegepast op de meeste cellijnen van zoogdieren. Deze methode zou van breed nut moeten zijn als een eenvoudige manier om DNA-eindresectie in cellulo te monitoren, als een proof of concept.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek, behandelingen en coverslippreparaat

OPMERKING: Alle celbeplating, transfecties en behandelingen, afgezien van bestraling, moeten plaatsvinden onder een steriele celkweekkap.

  1. Dag 1
    1. Plaats in een plaat met 6 putten een enkele afdekplaat in elke put voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ~ 150.000 HeLa-cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling, naar wens.
      OPMERKING: Als transfecteert, wordt het aanbevolen om een omgekeerde transfectie uit te voeren op het moment van plating, of het is mogelijk om enkele uren na het platen een voorwaartse transfectie uit te voeren om hechting mogelijk te maken. Een omgekeerde transfectie wordt bereikt door de transfectiemix aan de coverslip toe te voegen voordat de cellen worden toegevoegd; transfectie begint dus voordat de cellen beginnen te hechten. Een voorwaartse transfectie daarentegen is de toevoeging van het transfectiemengsel na hechting aan het oppervlak, meestal op de volgende dag. Het is echter mogelijk om dit op dezelfde dag te doen, op voorwaarde dat er voldoende tijd wordt gegeven voor de cellen om zich te hechten.
    2. Gebruik voor deze methode 4 putten: Put 1: siRNA-controle (siCTRL genoemd); Nou 2: siRNA tegen PARP-1 (siPARP-1); Nou 3: onbehandeld; Wel 4: Te behandelen cellen met 5 μM BMN673 1 uur voorafgaand aan de bestraling.
      OPMERKING: In dit protocol werden alle tests uitgevoerd onder bestraalde omstandigheden (zie rubriek 1.3).
    3. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator 's nachts, hoewel het transfectieprotocol tot 3 dagen incubatie mogelijk maakt. De incubatietijd voorafgaand aan de BrdU-behandeling is afhankelijk van de siRNA-transfectie-efficiëntie. Als er geen transfectie is, is incubatie gedurende 16 uur voldoende om hechting aan de coverslip en enige celgroei mogelijk te maken.
      OPMERKING: De omstandigheden van de incubator kunnen worden gewijzigd op basis van de gebruikte cellijn.
  2. Dag 2
    1. Voeg BrdU toe in een eindconcentratie van 10 μM in de juiste kweekmedia en incubeer gedurende 16 uur (één celcyclus).
      OPMERKING: De BrdU-oplossing wordt bereid in dimethylsulfoxide; de gebruikte stamoplossing is 10 mM en wordt opgeslagen in aliquots bij -20 °C.
  3. Dag 3
    1. Bestraal de platen met een totale dosis van 5 Gy röntgenstraling (varieer de dosis bestraling afhankelijk van het type bestralingsapparaat, bijvoorbeeld bestralingen voor kleine dieren versus tafelbestralingen). Zie de tabel met materialen voor het merk en het model van de gebruikte bestralingsmachine.
    2. Breng de platen terug naar de incubator en laat de cellen gedurende 3 uur los.
    3. Bereid tijdens de incubatietijd van 3 uur de twee buffers, A en B, en 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Buffers A en B en de sucrose moeten vers worden bereid op de dag van fixatie, met behulp van verse sucrose-oplossing om besmetting te voorkomen.
      1. Bereid buffer A (pre-extractiebuffer) voor, volgens de volgorde (30 ml) beschreven in tabel 1.
        OPMERKING: De 1M sucrose moet op de dag van gebruik worden bereid om besmetting te voorkomen.
      2. Bereid buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) voor volgens de volgorde beschreven in tabel 1 (30 ml).
        OPMERKING: Buffer B moet in de aangehaalde volgorde worden bereid om precipitatie van Tween-20 en natriumdeoxycholaatoplossing te voorkomen.
      3. Bereid 4% PFA, 2 ml per conditie (10 ml), onder een chemische kap (tabel 1).

2. Voorextractie en fixatie

OPMERKING: Alle voorextractie en fixatie worden uitgevoerd met de coverslips die in de weefselkweekplaat op ijs of bij 4 °C achterblijven; de coverslip wordt pas in de laatste stap van de montage opgetild (zie discussie).

  1. Voorextractie
    1. Zuig het medium op, was de cellen twee keer voorzichtig met 1x PBS en verwijder de PBS. Voeg 2 ml voorextractiebuffer A toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de incubatietijd in buffer A niet wordt verlengd. Verlengde incubatie in de pre-extractiebuffers zal resulteren in een verhoogd aantal losgemaakte cellen van de coverslip. Als alternatief kan in plaats van incubatie bij 4°C incubatie op ijs worden gedaan.
    2. Verwijder buffer A door middel van aspiratie.
      OPMERKING: Was de coverslips niet na het verwijderen van buffer A. Ga verder met de volgende stap.
    3. Voeg 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten. Aspirateer buffer B zorgvuldig en was de cellen eenmaal zorgvuldig met 1x PBS. Aspiraleer de 1x PBS zorgvuldig.
  2. Fixatie
    1. Fixeer de cellen door 2 ml 4% PFA onder de chemische kap toe te voegen.
      OPMERKING: PFA is giftig en moet worden gemanipuleerd onder een chemische kap.
    2. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was de dekenslips twee keer met 1x PBS en zuig het overtollige op.
    3. Bedek de coverslips met 100% koude methanol en incubeer de coverslips bij -20 °C gedurende 5 min. Was twee keer met 1x PBS.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De coverslips kunnen bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard en de plaat indien nodig in aluminiumfolie worden gewikkeld. De cellen mogen niet langer dan 5 dagen worden bewaard voordat het IF-protocol wordt voortgezet.

3. Permeabilisatie

  1. Incubeer de cellen met 2 ml 1x PBS met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.

4. Immunostaining

  1. Blokkeringsstap
    1. Bereid voldoende verse blokkeringsbuffer (3% BSA in 1x PBS) voor om 2 ml per coverslip te gebruiken.
      OPMERKING: Bereid een extra 5 ml blokkerende buffer voor om de antilichaamoplossingen te maken.
    2. Voeg 2 ml blokkeerbuffer toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Primaire antilichaam incubatie
    1. Bereid de primaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 en prolifererend celkernair antigeen (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
      OPMERKING: Om het antilichaam te behouden, kan een kleiner volume worden gebruikt, 75-100 μL voor een coverslip van 22 x 22 mm, 50-75 μL voor een coverslip van 18 x 18 mm.
    2. Voeg op elke coverslip 100 μL primaire antilichaamoplossing toe. Bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en positioneer de parafilm voorzichtig om geen bubbels te creëren.
    3. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    4. Verwijder de vierkanten van de parafilm en was de dekplaten drie keer met 2 ml steriele 1x PBS.
  3. Secundaire antilichaamincubatie
    1. Bereid voldoende secundaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: anti-muis 488 fluorescerende secundaire A11011 (voor BrdU) verdunning 1:800 en anti-konijn 568 fluorescerende secundaire A11011 (voor PCNA) verdunning 1:800.
      OPMERKING: De gebruikte kleuren kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften. Het specifieke gebruikte merk is te vinden in de Materialentabel.
    2. Voeg op elke coverslip 100 μL secundaire antilichaamoplossing toe, bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en plaats de parafilm voorzichtig zonder bubbels.
    3. Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met de plaat bedekt met aluminiumfolie.
    4. Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.
  4. Nucleaire kleuring
    1. Bereid een volume van 2 ml per coverslip van 1x PBS met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in een eindconcentratie van 1 μg/ml (1:1000).
    2. Voeg op elke coverslip 2 ml van de DAPI-oplossing toe. Incubeer de coverslips bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met de plaat bedekt met aluminiumfolie. Was de coverslips twee keer met 1x PBS.
    3. Bedek de coverslips met 1x PBS en gebruik een naald of een fijn pincet om de coverslip van de bodem van de put te tillen. Dep de overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapiertje op een rand te tikken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de dia niet laat vallen of dat het vlakke oppervlak met de hechtende cellen het papier raakt.
    4. Monteer de coverslips op dia's met behulp van 10-20 μL IF-specifieke montagemedia.

5. Beeldverwerving en -analyse

OPMERKING: Beeldacquisitie kan worden gedaan op verschillende soorten fluorescerende microscopen. Er werd gebruik gemaakt van een epifluorescentiemicroscoop met een 63x olieobjectief; zie de tabel met materialen voor het merk en model. Z-stacks zijn niet vereist, hoewel ze van nut kunnen zijn, afhankelijk van de cellijn en het niveau van mitochondriale kleuring.

  1. Beeldanalyse
    1. Maak voor elke afbeelding meerdere tiff-bestanden; voeg alle vlakken samen, maar houd de kleurkanalen gescheiden. Importeer deze bestanden in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) en analyseer met behulp van de Spikkeltel-pijplijn (Aanvullende video 1).
    2. Upload de afbeeldingen (aanvullende figuur S1A).
      1. Om te beginnen met het maken van het project, laadt u de spikkeltelpijplijn in het programma en de afbeeldingen die in het opgegeven gebied moeten worden geanalyseerd.
      2. Gebruik de module NamesAndTypes om aan elke afbeelding een betekenisvolle naam toe te wijzen waarmee andere modules verwijzen naar it-C01: Representing BrdU Channel; C02: Vertegenwoordigt PCNA-kanaal; C03: Vertegenwoordigt DAPI-kanaal.
        OPMERKING: Deze identificatiemiddelen zijn afhankelijk van de microscoop; er moet een id in de bestandsnaam staan om onderscheid te maken tussen de kanalen.
    3. Bepaal welk bestand zal worden gebruikt om de kernen te identificeren en geef het een naam (wijzig deze naam indien nodig) (zie Aanvullende figuur S1B en Aanvullende figuur S1C).
      1. Selecteer de diameter van het object tussen eenheden van 50 en 300 pixels, wat het acceptabele groottebereik voor kernen is, maar wijzig de waarde zodat deze in de kernen in de afbeelding past.
        OPMERKING: Het kan zijn dat 50 een te grote waarde is en voorkomt dat kleinere kernen worden geïdentificeerd; evenzo kan 300 het mogelijk maken om grote groepen kernen als 1 te tellen.
      2. Gooi objecten buiten het diameterbereik weg om ervoor te zorgen dat alleen objecten die aan de criteria voldoen, worden geteld.
      3. Verwijder objecten die randen raken om cellen te verwijderen die zich mogelijk slechts gedeeltelijk in het veld bevinden.
      4. Pas de drempelwaarde toe om bij de specifieke afbeeldingen te passen. Let op de volgende instellingen als voorbeeld. Wijzig de drempelcorrectiefactor op basis van hoe streng de drempelstrategie zal zijn. Andere instellingen zijn onder meer drempelstrategie: Globaal; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: twee klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 1; onder- en bovengrenzen op drempel: 0,0 en 1,0; methode om samengeklonterde objecten te onderscheiden: Vorm; en methode om scheidingslijnen tussen samengeklonterde objecten te tekenen: Propagateren.
        OPMERKING: Voor elke parameter biedt cell profiler aanvullende definities en de beschikbare mogelijkheid voor de variabele-instelling.
    4. Identificeer het primaire object om de foci te identificeren (aanvullende figuur S2A).
      1. Gebruik de volgende instellingen: selecteer de invoerafbeelding: Maskedgreen; het te identificeren primaire object genoemd: BrdUFoci; typische diameter van het object: 1-15; gooi het object buiten het diameterbereik weg: Ja; verwijder het object dat de rand van de afbeelding raakt: Nee; drempelstrategie: Adaptatief; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: drie klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 3; en grootte van het afvlakfilter: 4.
    5. Meetintensiteit (aanvullende figuur S2B).
      1. Selecteer de afbeelding die u wilt meten: OrigGreen.
      2. Klik op Nog een afbeelding toevoegen. Selecteer de afbeelding die u wilt meten: PCNA. Selecteer objecten om te meten: Kernen.
        OPMERKING: Dit zal worden gebruikt om de BrdU- en PCNA-intensiteit te meten - de uiteindelijke gegevens die in een grafiek worden weergegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit protocol werd de op bromodeoxyuridine (BrdU) gebaseerde test gebruikt om de resectierespons van HeLa-cellen op door bestraling veroorzaakte schade kwantitatief te meten. De gegenereerde ssDNA-sporen worden gevisualiseerd als afzonderlijke foci na immunofluorescentiekleuring (figuur 1A). De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de BrdU-kleuring in de kernen (figuur 1B, aanv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van IF-kleuring om variaties in DNA-resectie in cellulose te meten. De huidige standaard voor het observeren van een effect op DNA-resectie is door RPA-kleuring; dit is echter een indirecte methode die kan worden beïnvloed door DNA-replicatie. Eerder is een andere op BrdU-integratie gebaseerde DNA-resectie IF-techniek beschreven voor het classificeren van de resulterende intensiteiten in BrdU-positieve en BrdU-negatieve cellen. Met deze methode konden cellen d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Marie-Christine Caron voor haar uitstekende technische advies. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. bekleedt een Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S is een FRQS PhD student fellow, en S.Y.M is een FRQS postdoctoraal fellow.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa 568 geit anti-konijnMolecuulflessenA110111:800
Alexa Fluor 488 geit anti-muisMolecuulflessenA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Zelfgemaakt1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM hoge glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetaal RunderserumGibco12483-020
Fisherbrand Dekglasjes: Vierkant 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescente microscoopLeicaDMI6000B63x onderdompeling objectief
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Naald
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Pincet

Referenties

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA uiteinde resectieBrdU labelingDNA schaderesponshomologe recombinatiePARP remmersimmunofluorescentie imagingenkelstrengs DNAPCNA kleuringspeckle telling

Gerelateerde artikelen