Methodenartikel

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 mei 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en genbewerkingstechnologieën maken de ontwikkeling mogelijk van nieuwe op menselijke cellen gebaseerde ziektemodellen voor fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma's. Hoewel deze nieuwe apparaten de veiligheid en werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen bij mensen nauwkeuriger konden voorspellen, is hun ontwikkeling naar de kliniek nog steeds sterk afhankelijk van zoogdiergegevens, met name het gebruik van muizenziektemodellen. Parallel aan humane organoïde of organ-on-chip ziektemodellen is de ontwikkeling van relevante in vitro muismodellen daarom een onvervulde behoefte aan het evalueren van directe geneesmiddeleneffectiviteit en veiligheidsvergelijkingen tussen soorten en in vivo en in vitro aandoeningen. Hier wordt een vasculaire kiemtest beschreven die gebruik maakt van embryonale stamcellen van muizen die zijn gedifferentieerd in embryoïde lichamen (EB's). Gevasculariseerde EB's gekweekt op 3D-collageengel ontwikkelen nieuwe bloedvaten die uitzetten, een proces dat kiemende angiogenese wordt genoemd. Dit model vat de belangrijkste kenmerken samen van in vivo ontkiemende angiogenese-vorming van bloedvaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk - inclusief endotheelcelselectie, endotheelcelmigratie en proliferatie, celgeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het is vatbaar voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren en vertoont overeenkomsten met recent beschreven driedimensionale (3D) vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen drie decennia is target-based drug discovery (TDD) op grote schaal gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen door de farmaceutische industrie. TDD bevat een gedefinieerd moleculair doelwit dat een belangrijke rol speelt in een ziekte en is gebaseerd op de ontwikkeling van relatief eenvoudige celkweeksystemen en uitlezingen voor geneesmiddelenscreening1. De meeste typische ziektemodellen die in TDD-programma's worden gebruikt, omvatten traditionele celkweekmethoden zoals kankercellen of onsterfelijke cellijnen die zijn gekweekt in kunstmatige omgevingen en niet-fysiologische substraten. Hoewel veel van deze modellen levensvatbare hulpmiddelen hebben geboden voor het identificeren van succesvolle kandidaat-geneesmiddelen, kan het gebruik van dergelijke systemen twijfelachtig zijn vanwege hun slechte ziekterelevantie2.

Voor de meeste ziekten zijn de onderliggende mechanismen inderdaad complex en verschillende celtypen, onafhankelijke signaalroutes en meerdere sets genen blijken vaak bij te dragen aan een specifiek ziektefenotype. Dit geldt ook voor erfelijke ziekten waarbij de primaire oorzaak een mutatie in één enkel gen is. Met de recente komst van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën en genbewerkingstools, is het nu mogelijk om 3D-organoïden en organ-on-chip ziektemodellen te genereren die de in vivo menselijke complexiteit beter kunnen samenvatten 3,4. De ontwikkeling van dergelijke technologieën wordt geassocieerd met een heropleving van de interesse in fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma's1. PDD kan worden vergeleken met empirische screening, omdat ze niet afhankelijk zijn van kennis van de identiteit van een specifiek geneesmiddeldoelwit of een hypothese over de rol ervan bij de ziekte. De PDD-aanpak wordt nu steeds meer erkend om sterk bij te dragen aan de ontdekking van eersteklas geneesmiddelen5. Omdat de ontwikkeling van menselijke organoïde en organ-on-chip-technologieën nog in de kinderschoenen staat, wordt verwacht dat iPSC-modellen (aangevuld met innovatieve beeldvormings- en machine-learningtools6,7) in de nabije toekomst meerdere nieuwe complexe celgebaseerde ziektemodellen voor geneesmiddelenscreening en bijbehorende PDD-programma's zullen bieden om de slechte productiviteit van de TDD-benadering te overwinnen8, 9.

Hoewel menselijke organoïde- en organ-on-chip-modellen belangrijke inzichten kunnen bieden in de complexiteit van de ziekte en in de identificatie van nieuwe geneesmiddelen, is het brengen van geneesmiddelen in de nieuwe klinische praktijk ook sterk afhankelijk van gegevens uit diermodellen om hun werkzaamheid en veiligheid te beoordelen. Onder hen zijn genetisch gemodificeerde muizen zeker de meest geprefereerde zoogdiermodellen. Ze hebben veel voordelen omdat ze een relatief korte generatietijd hebben voor zoogdieren, veel vergelijkbare fenotypen hebben als menselijke ziekten en gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd. Ze worden daarom op grote schaal gebruikt in programma's voor het ontdekken van geneesmiddelen10. Het overbruggen van de kloof tussen muizen en mensen blijft echter een belangrijke uitdaging11. De ontwikkeling van in vitro muismodellen die gelijkwaardig zijn aan humane organoïde en organ-on-chip-modellen zou deze leemte ten minste gedeeltelijk kunnen opvullen, omdat het directe vergelijkingen van de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen tussen in vivo muis- en in vitro menselijke gegevens mogelijk zal maken.

Hier wordt een vasculaire kiemtest in embryoïde lichamen van muizen (EB's) beschreven. Bloedvaten zijn samengesteld uit endotheelcellen (binnenbekleding van vaatwanden), muurschilderingen (vasculaire gladde spiercellen en pericyten)12. Dit protocol is gebaseerd op de differentiatie van muizenembryonale stamcellen (mESCs) in gevasculariseerde EB's met behulp van hangende druppels die de novo endotheelcel- en muurschilderceldifferentiatie recapituleren13,14. Muis-SER's kunnen gemakkelijk in cultuur worden vastgesteld van geïsoleerde dag 3.5 muisblastocysten met verschillende genetische achtergronden15. Ze bieden ook mogelijkheden voor klonale analyse, afstammingstracering en kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd om ziektemodellente genereren 13,16.

Omdat bloedvaten alle organen voeden, is het niet verrassend dat veel ziekten, zo niet alle, geassocieerd zijn met veranderingen in de microvasculatuur. In pathologische omstandigheden kunnen endotheelcellen een geactiveerde toestand aannemen of disfunctioneel worden, wat resulteert in de dood van muurschilderingen of migratie weg van bloedvaten. Deze kunnen leiden tot overmatige angiogenese of tot bloedvaten, kunnen een abnormale bloedstroom en een defecte bloedvatbarrière veroorzaken, wat leidt tot extravasatie van immuuncellen en ontsteking12,17,18,19. Onderzoek voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die bloedvaten moduleren is daarom hoog, en meerdere moleculaire spelers en concepten zijn al geïdentificeerd voor therapeutische targeting. In deze context is het beschreven protocol bijzonder geschikt voor het bouwen van ziektemodellen en voor het testen van geneesmiddelen, omdat het de belangrijkste kenmerken van in vivo kiemende angiogenese samenvat, waaronder endotheelpunt- en stengelcelselectie, endotheelcelmigratie en -proliferatie, endotheelcelbegeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het vertoont ook overeenkomsten met recent beschreven 3D vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mediavoorbereiding en cultuur van mESC

  1. Bereid geconditioneerd medium +/- (CM+/-) met behulp van het supplement 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 0,05 mM β-mercaptoethanol, 1x niet-essentiële aminozuren (NEAA 1x), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat.
  2. Bereid geconditioneerd medium +/+ (CM+/+) met behulp van het supplement CM+/- medium met leukemie remmende factor (LIF) (1.500 E/ml) en 0,1 mM β-mercaptoethanol.
  3. Bereid geconditioneerd medium +/+ in aanwezigheid van twee remmers (CM+/+ 2i) met behulp van het supplement CM+/+ medium met 1 μM PD0325901 en 3 μM CHIR99021.
  4. Bereid 0,1% gelatine-oplossing door 25 ml voorverwarmde 2% gelatine-oplossing te mengen in 500 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (DPBS).
  5. Bereid 10x Trypsine Versene Fosfaat (TVP 10x) buffer door Trypsine (2,5%) te mengen met TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% kippenserum, 0,01% Trypsine (2,5%) in H2O) (1:10 verhouding, vol/vol).
    OPMERKING: Filter alle oplossingen door een poriënfilter van 0,22 μm. Bewaar het kweekmedium langdurig bij -20 °C en bewaar andere reagentia gedurende maximaal 3 weken bij 4 °C (zie materiaaltabel).
  6. Bedek twee 12-well celkweekplaten met 0,1% gelatine-oplossing (500 μL per put) en incuber ze gedurende 30 minuten in een CO 2-incubator (37 °C, 5% CO2, vochtige atmosfeer).
  7. Was de met gelatine beklede platen met PBS en voeg 500 μL CM+/- medium toe.
  8. Ontdooi twee injectieflacons met 1 x 106 gecryopreserveerde bestraalde muizenembryonale fibroblasten (MEF's) bij 37 °C en breng de celsuspensie over in een conische buis met 5 ml CM+/- medium.
  9. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Zuig het medium aan en resuspensie de celpellet voorzichtig in 12 ml CM+/- medium in een concentratie van 1,67 x 105 cellen per ml.
  10. Zaai 500 μL MEF-suspensie in een 12-well celkweekplaat (2,4 x 105 cellen per cm 2) en incuber de plaat 's nachts (o/n) in een CO2-incubator.
  11. Ontdooi één injectieflacon met gecryopreserveerde mESCs (1 x 106) in CM+/+ 2i medium.
  12. Zaai de mESC-suspensie op een voorgewassen plaat met 12 putjes met MEF's in 1 ml CM+/+ 2i medium en breng de plaat over naar een CO 2-incubator. Ververs het medium dagelijks.
  13. Was bij 70% samenvloeiing de mESC-kolonies met DPBS. Voeg 150 μL warme 10x TVP-buffer toe en incubeer gedurende 30 s bij RT om enzymatische dissociatie te initiëren.
  14. Verwijder voorzichtig de TVP-buffer, resuspendien de cellen in 1 ml CM+/+ 2i-medium en dissocieer de kolonies in afzonderlijke cellen door voorzichtig pipetteren.
  15. Passeer de cellen door ze over te brengen naar een nieuwe 12-well celkweekplaat met MEF's (splitsingsverhouding: 1:3-1:5). Meng voorzichtig om de cellen te verdelen en incuber in een CO 2-incubator.
  16. Ververs het kweekmedium (2-3 ml) en observeer de celgroei/morfologie dagelijks. Herhaal seriële passaging bij 70% confluency om de 2 dagen. Schakel over naar CM+/+ medium gedurende twee passages voordat u celdifferentiatie start.

2. EB-vorming in hangende druppel

  1. Bereid vers mesodermdifferentiatiemedium door het CM+/- medium aan te vullen met de basisch fibroblastgroeifactor (bFGF) (50 ng·ml-1) en met botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP-4) (5 ng·ml-1) en houd het tot gebruik op 4 °C.
  2. Bedek een putje van de 6-well celkweekplaat met 500 μL 0,1% gelatine-oplossing en plaats deze gedurende 30 minuten in een CO 2-incubator.
  3. Was de met gelatine beklede platen met PBS en voeg 500 μL CM+/- medium toe.
  4. Om een zuivere populatie van mESCs te verkrijgen, trypsiniseert u de celkweekplaat met 10x TVP-buffer gedurende 30 s bij RT, resuspenseert u de cellen in 1 ml mesodermdifferentiatiemedium en brengt u ze vervolgens gedurende 30 minuten over naar de met gelatine gecoate 6-well-plaat, zodat de MEF's zich kunnen hechten terwijl de mESCs in suspensie blijven.
  5. Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 50 ml en tel de cellen met behulp van een Neubauer-hemocytometer en Trypan-blauwe kleurstof voor een uitsluiting van levende / dode cellen.
  6. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant en resuspensie de celpellet in mesodermdifferentiatiemedium tot 4,55 x 104 cellen per ml.
  7. Vul de bodem van 94 mm polystyreen schaaltjes met lage aanhechting met 15 ml steriel water.
    OPMERKING: Vier schalen met hangende druppels (1,6 x 105 cellen in 3,52 ml medium) zijn vereist voor het testen van een bepaalde aandoening met behulp van de 3D-kiemangiogenesetest.
  8. Breng de celsuspensie over in een steriel plastic reservoir en laad vier posities van een meerkanaalspipet met 22 μL celsuspensie per kanaal (1 x 103 cellen per druppel van 22 μL).
  9. Til het deksel van de 94 mm schotel op en keer het om en plaats het op het schone oppervlak van de stroomkast met de binnenkant naar boven gericht.
  10. Leg 40 druppels van de celsuspensie op het binnenoppervlak van elk deksel. Keer het deksel voorzichtig om zonder verstoring en plaats het terug op de schaal, zodat de druppels naar het water gericht zijn.
  11. Incubeer de gerechten in een CO 2-incubator. Beschouw dit als differentiatie dag 0. Houd de platen 4 dagen aan om EB's te vormen.

3. Wedstrijdtest voor de positie van de tipcel

  1. Kweek één fluorescerende en één niet-fluorescerende mESC-lijn zoals eerder beschreven13. Als voorbeeld worden 7ACS/EYFP mESCs met gele en R1 mESCs gebruikt.
  2. Bereid mozaïek-EB's voor door gelijke hoeveelheden van de twee mESC-lijnen (1:1-verhouding) te mengen en incuber de hangende druppelschalen in een CO 2-incubator zoals beschreven in stap2 .

4. Drijvende EBs-cultuur voor vasculaire differentiatie

  1. Voordat u EB's van de hangende druppels verzamelt, bereidt u het volgende voor.
    1. Bereid 5% agaroplossing in H2O en steriliseer het door autoclaveren (20 min bij 120 °C).
    2. Gebruik de warme 5% agar-oplossing om G-MEM BHK-21 medium met 1% agar te bereiden en giet snel 3 ml in een van de 60 mm polystyreenschalen. Laat de agar 1 uur stollen bij RT. Bewaar de gerechten bij 4 °C tot gebruik.
  2. Bereid vers 2x vasculaire differentiatiemedium door het CM+/- medium aan te vullen met bFGF (100 ng·mL-1) en VEGF-A (50 ng·mL-1). Bewaar het medium bij 4 °C tot gebruik.
  3. Verzamel de hangende druppels in een conische buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet en verwijder het supernatant na een paar minuten EB-bezinking.
  4. Resuspensie van de EB's in 3 ml 2x vasculair differentiatiemedium, breng de EB-suspensie over naar één met agar gecoate schaal en verdeel de EB's homogeen om aggregatie te voorkomen.
  5. Incubeer de gerechten in CO 2-incubator en ververs het medium elke2 dagen tot dag 9 met behulp van 1x vasculair differentiatiemedium in aanwezigheid van bFGF (50 ng · mL-1) en VEGF-A (25 ng · mL-1).
  6. U kunt ook van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-BB (PDGF-BB) (10 ng·ml-1 op dag 4 en 5 ng·ml-1 op dag 6 en dag 8) toevoegen aan het vasculaire differentiatiemedium om de differentiatie van murale cellen te bevorderen.

5. Flowcytometrie analyse

  1. Verzamel de 9 dagen oude EB's in een conische buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet en was ze eenmaal met warme PBS.
  2. Voeg 1 ml G-MEM BHK-21 medium toe dat 0,2 mg·ml-1 collagenase A bevat en incuber de cellen gedurende 5 minuten in een CO 2-incubator.
  3. Dissocieer de EB's door voorzichtig op en neer te pipetten met een P1000-pipet.
  4. Stop de collagenase-activiteit door 1 ml koud G-MEM BHK-21-medium met 10% FBS toe te voegen.
  5. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Resuspendeer de cellen in 500 μL PBS met 2% FBS.
  7. Tel de cellen met behulp van een Neubauer hemocytometer.
  8. Resuspendeer 400.000 cellen in 100 μL PBS met 2% FBS per kleuringsconditie.
  9. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 4 °C met de volgende antilichamen: APC-geconjugeerd antimuis PECAM-1-antilichaam bij ratten (kloon MEC13.3) en FITC-geconjugeerde antimuis CD45 bij ratten (kloon 30-F11) of isotypecontroleantistoffen.
  10. Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS met 2% FBS.
  11. Resuspendeer de cellen om een uiteindelijke concentratie van 5 x 106 cellen per ml te bereiken.
  12. Filter de cellen met behulp van een polystyreen reageerbuis met ronde bodem, met een klikdop van een celzeef.
  13. Analyseer 20.000 PECAM-1 (+) gebeurtenissen door middel van flowcytometrie.

6.3D kiemende angiogenesetest en immunofluorescentiekleuring

  1. Bereid op dag 9 een kiemmedium door toevoeging van 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·ml-1), VEGF-A (25 ng·ml-1), humaan recombinant erytropoëtine (hEPO) (20 ng·ml-1), humaan interleukine-6 (IL-6) (10 ng·ml-1), 0,05 mM β-mercaptoethanol, NEAA (1x), L-glutamine (1x), natriumpyruvaat (1x), collageen van rattenstaarten type I (1,25 mg·ml-1), en NaOH (3,1 mM) naar GMEM BHK-1 medium.
  2. Om collageen gelatie te voorkomen, houdt u het kiemmedium op ijs tot gebruik.
  3. Om het effect van pro/anti-angiogene moleculen te evalueren, voegt u het geselecteerde geneesmiddel of medium toe aan het kiemmedium in de geselecteerde concentratie.
  4. Verzamel 9 dagen oude EB's uit een agarschaal van 60 mm in een conische buis van 15 ml (equivalent aan één voorwaarde) en verwijder het supernatant na een paar minuten sedimentatie.
  5. Bedek de bodem van een kweekschaal van 35 mm met 1 ml van het kiemmedium en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om gelatie op te wekken.
  6. Resuspendie van de EB's in 2 ml koud kiemmedium.
  7. Breng de suspensie over in de 35 mm kweekschaal bedekt met de eerste laag kiemmedium.
  8. Verdeel de EB's over de hele plaat en zorg ervoor dat ze op gelijke afstand van elkaar staan. Incubeer de schaal in een CO 2-incubator. De eerste kiemvorming vindt plaats binnen 24-48 uur.
  9. Op dag 12 wordt de collageengel met EB's voorzichtig overgebracht naar een glasplaat (75 x 26 mm) met behulp van een spatel.
  10. Verwijder de overtollige vloeistof met een pipet (P1000) en droog de gel uit door een gaasje nylon en absorberende filterkaarten (gelblottingpapier) op de gel te leggen. Oefen druk uit door gedurende 2 minuten een gewicht (250 g) te plaatsen. Verwijder voorzichtig het nylon/filterpapier en laat de dia's 30 minuten aan de lucht drogen bij RT.
  11. Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT.
  12. Bevestig de EB's met behulp van zinkoplossing (zie materiaaltabel) o/n bij 4 °C. U kunt ook de mozaïek fluorescerende EB's fixeren met Paraformaldehyde (PFA) (4%) o/n bij 4 °C in het donker.
  13. Verwijder het fixatief. Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT.
  14. Permeabiliseer de EB's in PBS met 0,1% Triton-X100 gedurende 15 minuten bij RT.
  15. Verwijder de permeabilisatieoplossing. Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten.
  16. Incubeer de EB's in de blokkeringsbuffer (PBS met 2% Bovine Serum Albumin, BSA) gedurende 1 uur bij RT.
  17. Om de endotheelspruiten te kleuren, gebruikt u een antimuis anti-PECAM-1 primair antilichaam bij ratten (1:100 verdunning) in blokkeringsbuffer o/n bij 4 °C.
  18. Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten.
  19. Incubeer de dia's met geiten anti-rat Alexa 555 secundair antilichaam in blokkerende buffer (1:250 verdunning) en indien nodig, met FITC-geconjugeerd anti-α-SMA antilichaam in blokkerende buffer (1:250 verdunning) om muurschilderingscellen gedurende 2 uur bij RT in het donker te kleuren.
  20. Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten en één keer met H20 voordat u ze monteert.

7. Confocale beeldvorming, morfometrische en kwantitatieve analyse van EB-endotheelspruiten

  1. Verkrijg beelden met hoge resolutie van de immunogekleurde EB's door samenvoeging van het brandpuntsvlak (z-stacking) met behulp van een confocale microscoop. Gebruik een vergrotingsobjectief van 10x om hele EB's in beeld te brengen.
  2. Analyseer de beelden verkregen met behulp van ImageJ om de morfologie te evalueren en kwantificeer de kenmerken van PECAM-1 positieve endotheelspruiten volgens gevestigde kwantificeringsmethoden13,14,21.
    1. Bereken het gemiddelde aantal endotheelspruiten per EB door handmatig het totale kiemgetal per individuele EB te tellen.
    2. Meet de afzonderlijke spruitlengtes met het tekengereedschap ImageJ. Definieer de basis van de endotheelspruit vanaf het EB-kerngebied en teken handmatig een lijn tot het uiteinde van de spruitpunt.
    3. Bereken het gemiddelde aantal tipcellen per spruit door handmatig het aantal tipcellen per individuele spruit te tellen en bereken vervolgens het gemiddelde per EB.
    4. Bereken de filopodia-oriëntatie door handmatig de as van de ouderspruit te bepalen en meet de scherpe hoek ertussen met behulp van het beeldJ-softwarehoekgereedschap. Bereken het aantal spruiten met een oriëntatie >50 ° en deel het door het totale aantal spruiten van de EB van belang.
      OPMERKING: De hoeken varieerden altijd van 0° tot 90°.
  3. Verkrijg beelden met hoge resolutie van de immunogekleurde EB's met behulp van een confocale microscoop. Gebruik een vergrotingsobjectief van 40x om afbeeldingen met een hoge resolutie van enkele endotheelspruiten te realiseren.
  4. Kwantificeer de vaatdekking van PECAM-1-positieve EC-spruiten omringd door α-SMA-positieve MC's met behulp van de ImageJ-software.
    1. Splits de samengevoegde afbeeldingen in afzonderlijke rode en groene kanalen.
    2. Converteer de afbeeldingen naar de binaire vorm.
    3. Meet het totale cellulaire gebied van de spruit dat afzonderlijk wordt ingenomen door PECAM-1 (endotheelcellen gelabeld in rood) en door α-SMA (muurschilderingscellen gelabeld in groen) positieve cellen.
    4. Genereer de samengevoegde afbeelding met behulp van de functie afbeeldingscalculator en de operator AND. Meet het totale cellulaire gebied van de afbeelding. Om de dekking te berekenen, deelt u het gebied van de gecolokaliseerde afbeelding door de oppervlakte van de pecam-1 binaire afbeelding.
  5. Om de celcompetitie voor endotheeltip / stengelcelpositie van spruiten ontwikkeld door mozaïek-EB's te analyseren, scoort u handmatig het aantal tipcellen en markeert u hun genotypische oorsprong op basis van het fluorescentiesignaal. Bereken de gemiddelde waarden per EB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocoloverzicht van de bloedvatkiemtest is weergegeven in figuur 1. Negen dagen oude EB's afgeleid van drie onafhankelijke 129 / Ola mESC-lijnen (Z / Red, R1 en E14) werden enzymatisch gedissocieerd in enkele cellen met behulp van collagenase A. Cellen werden gekleurd voor PECAM-1 en geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) zoals beschreven. Alle cellijnen vertoonden robuuste endotheeldifferentiatie en er werden geen verschillen waargenomen in hun vermogen om te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een onbevooroordeelde, robuuste en reproduceerbare 3D EB-gebaseerde vasculaire kiemtest die vatbaar is voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van veel veelgebruikte tweedimensionale (2D) assays met behulp van endotheelcelculturen zoals Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) om migratie te monitoren (laterale scratch assay of de Boyden chamber assay)22,23 of proliferatie (celnummer tellen, detectie van DNA-synthese

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND en door de Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolMilipore, Merck805740Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgGLife technologiesA21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscopeZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mmMarienfeld640211
Cell culture dishes 60 x 15mmCorning353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mmCorning353801
Cell culture plates 12-wellCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad1855196
Chicken serumSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mgCorning354249
Collagenase ARoche10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5Leica
Cover glasses, 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ?secretase inhibitorSigma AldrichD5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotype rat IgG1BioXcellBP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesiumGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine SerumGibco, Thermofisher scientific16141-079Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)Roche11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Filter tip,clear,sterile F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Filter tip,clear,sterile F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Filter tip,clear,sterile F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)Biolegend400605
Fluorscent mounting mediaDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003WhatmanWHA10547922
Gelatin solution, type BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamine 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Microscope slide boxKartell Labware278
Microscope slide, StarfrostKnittel glassVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kiemende angiogenesedriedimensionale assayembryonale lichamencollageengelcultuurendotheel tipcellenassay voor geneesmiddelentestengenetische screeningrekrutering van murale cellen

Gerelateerde artikelen