Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Summary

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Abstract

Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (ZvH), enzovoort. Om oplosbare of diffuse eiwit oligomeren of aggregaten te detecteren en te analyseren, is fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt, die de diffusiesnelheid en helderheid van een enkel deeltje met een enkele molecuulgevoeligheid kan detecteren. De juiste procedure en knowhow voor de detectie van eiwitaggregatie zijn echter niet op grote schaal gedeeld. Hier tonen we een standaardprocedure van FCS-meting voor diffusie-eigenschappen van aggregatiegevoelige eiwitten in cellysaat en levende cellen: ALS-geassocieerd 25 kDa carboxyl-terminal fragment van TAR DNA/RNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP25) en superoxide dismutase 1 (SOD1). De representatieve resultaten tonen aan dat een deel van de aggregaten van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld TDP25 enigszins was opgenomen in de oplosbare fractie van murien neuroblastoom Neuro2a cellysaat. Bovendien toont GFP-gelabelde SOD1 met ALS-geassocieerde mutatie een langzamere diffusie in levende cellen. Dienovereenkomstig introduceren we hier de procedure om de eiwitaggregatie via de diffusie-eigenschap ervan te detecteren met behulp van FCS.

Introduction

Eiwitaggregaties met neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, enzovoort¹ zijn bekend als giftig en zouden de eiwithomeostase (proteostase) in de cellen en organen verstoren, wat dan kan leiden tot veroudering². De klaring van eiwitaggregatie wordt verwacht als een therapeutische strategie; chemische stoffen die eiwitaggregatievorming voorkomen en eiwitaggregaten afbreken (bijv. kleine moleculen of geneesmiddelen) zijn echter nog niet vastgesteld. Bovendien blijft de manier waarop eiwitaggregatie toxiciteit uitoefent ongrijpbaar. Daarom is het belangrijk om, om onderzoeksprojecten met betrekking tot eiwitaggregatie te bevorderen, procedures met een hoge doorvoer in te voeren om eenvoudig eiwitaggregatie te detecteren. Eiwitaggregatiedetectie met behulp van antilichamen die de conformatie van eiwitaggregatie en aggregatiespecifieke fluorescerende kleurstof herkennen, is veel gebruikt³. Het is echter moeilijk om de aggregatie te detecteren, vooral in levende cellen met behulp van dergelijke klassieke procedures.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een procedure om eiwitaggregatie en structurele verandering te detecteren. FRET is echter niet in staat om eiwitdynamiek te analyseren (bijv. diffusie en oligomerisatie van eiwitten in levende cellen)³. Daarom introduceren we hier een eenvoudig protocol om eiwitaggregatie in oplossing (bijv. cellysaat) en levende cellen te detecteren met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), die de diffusie-eigenschap en helderheid van fluorescerende moleculen met één molecuulgevoeligheid^{meet 4}. FCS is een fotontellingsmethode met behulp van een laserscan confocale microscoop (LSM). Met behulp van een zeer gevoelige fotondetector en berekening van de autocorrelatiefunctie (ACF) van de aankomsttijd van foton wordt de passeertijd en helderheid van de fluorescerende moleculen in het detectievolume gemeten. De diffusie vertraagt met een toename van het molecuulgewicht; zo kan intermoleculaire interactie worden geschat met behulp van FCS. Sterker nog, een toename van de helderheid van het fluorescerende molecuul duidt op homo-oligomerisatie van de moleculen. Daarom is FCS een krachtig hulpmiddel om een dergelijke eiwitaggregatie te detecteren.

Protocol

1. Materialen en reagentia

1. Gebruik pyrogene vrije oplossingen en medium voor celkweek (Tabel 1).
2. Bereid oplossingen voor het biochemische experiment met ultrapure water en gebruik als DNase / RNase vrij.
3. Selecteer een geschikte FBS voor de celcultuur met een partijcontroleproces. Aangezien de geselecteerde FBS-lot regelmatig verandert, kunnen de catalogus en het lotnummer voor FBS hier niet worden weergegeven.
4. Plasmide DNA
   1. Bereid pmeGFP-N1⁵ voor op eGFP monomeerexpressie; pmeGFP-C1-TDP25⁶ voor GFP-TDP25-expressie; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ voor SOD1-G85R-GFP-expressie; en pCAGGS⁸ als drager.
      OPMERKING: meGFP is een monomere variant met A206K-mutatie van verbeterde GFP (eGFP). TDP25 is een ALS-geassocieerd C-terminal fragment van TDP-43. SOD1-G85R is een ALS-geassocieerde mutant van SOD1.
5. Celspanning
   1. Gebruik murien neuroblastoom Neuro2a cellen.
      OPMERKING: Neuro2a-cellen hebben een hoge transfectie-efficiëntie en drukken exogene eiwitten zeer uit. Voor TDP25-expressie zijn celstammen met hoge expressie-efficiënties zoals Neuro2a- of HEK293-cellen vereist. In HeLa-cellen kon TDP25 niet efficiënt worden uitgedrukt.

2. Celcultuur en transfectie

1. Bereid een plastic schaal van 100 mm die Neuro2a-cellen halfconfluently kweekt in een normaal groeimedium.
   OPMERKING: Het is noodzakelijk om ongeveer 48-72 uur na het vorige zaaien bij 37 °C te incuberen totdat de semi-samenvloeiing is bereikt.
2. Verwijder het medium.
3. Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal en incubeer ze gedurende 1 minuut bij 37 °C.
4. Voeg 9,5 ml normaal groeimedium toe aan de schaal en hang de losgemaakte cellen op.
5. Als u Trypan blauw gebruikt om de dode cellen te beitsen, telt u het aantal cellen met behulp van een celteller of handmatig. Verdun vervolgens de cellen in kweekmedium (1,0 × 10⁵/ml).
6. Voeg 2 ml celsuspensie toe aan een plastic schaal van 35 mm voor cellyse of een glazen basisschaal voor live-celmeting.
7. Incubeer het gerecht gedurende 1 dag op 37 °C.
8. Start de volgende voorbereidingen 15 minuten voor de dag van de transfectie.
9. Bereid twee buizen van 1,5 ml voor en voeg 100 μL Opti-MEM I toe aan elke buis.
10. Meng in de eerste buis 1,0 μg plasmide-DNA (oplossing A). Meng in de tweede tube 2,5 μL Lipofectamine 2000 (oplossing B).
    OPMERKING: Om de transfectie-efficiëntie te behouden, moet u de totale HOEVEELHEID DNA hetzelfde houden. Om het expressieniveau voor FCS-meting in levende cellen te verlagen, moet de fractiehoeveelheid plasmide-DNA voor eiwitexpressie afnemen (bijv. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R en 0,8 μg pCAGGS-mengsel). Houd bovendien dezelfde verhouding tussen het volume lipofectamine 2000 en de hoeveelheid plasmide-DNA.
11. Meng oplossing A en B voorzichtig door er een in een van beide buizen toe te voegen en incubeer deze vervolgens gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (oplossing C).
12. Voeg oplossing C toe aan het cultuurmedium; en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C.

3. Cellysis & middelgrote uitwisseling

1. Controleer de GFP-expressie met behulp van een routinemicroscoop.
2. Verwijder het medium in de schaal.
3. Voeg 2 ml PBS bij 25 °C toe om het medium uit te wassen. Verwijder de PBS.
4. Leg de schaal op een aluminium plaat bovenop het gemalen ijs.
   OPMERKING: We gebruiken een 1 mm dikke aluminium plaat gesneden in een zondagse gereedschapswinkel of in de handel verkrijgbaar als laboratoriumapparatuur.
5. Voeg 200 μL lysisbuffer toe bij 4 °C. Schud de schaal lichtjes zodat de buffer gelijkmatig verdeeld is over de bodem van de schaal.
6. Schraap de schaal met een celschraper en herstel het lysaat met onopgelost celafval in een nieuwe buis van 1,5 ml.
7. Centrifugeer de oplossing bij 20.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
8. Herstel het supernatant in een nieuwe buis van 1,5 ml en houd het op 4 °C of op ijs.
   OPMERKING: Vries het lysaat niet in.
9. Vervang voor metingen van levende cellen het medium vóór de meting. Controleer de celbevestiging met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Bevestig de expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

4. Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) kalibratie

1. Start het systeem en voer de bedieningssoftware uit. Schakel de Argon⁺ laser (458/477/488/514 nm) in. Stabiliseer het systeem ten minste gedurende 30 minuten.
2. Stel het optische pad in: Grootlichtsplijter: HFT488; Dichroïsche spiegel: NFT600; Fluorescentiebarrièrefilter: een banddoorlaatfilter 505-540 (BP505-540); Detector: lawine fotodiode (APD)).
3. Stel de pinholegrootte in door de waarde direct in te voeren (66 μm; 1 luchtige eenheid).
4. Voeg de Rhodamine 6G (Rh6G) oplossing toe aan een put van de afdekglaskamer op het podium.
5. Voeg de onderdompeling ultrapure water op het doel. Gebruik de onderdompelingsolie niet.
6. Plaats de kamer op het microscoopstadium. Verplaats het werkgebied naar de juiste positie.
7. Focus op het bovenste glasoppervlak door het verstrooide licht van het glasoppervlak te meten. Nadat u de objectieve lens naar beneden hebt verlaagd, draait u de scherpstelknop met de klok mee om deze aan te passen.
   OPMERKING: Controleer de draairichting van de scherpstelknop omdat deze tegenovergesteld is aan die in Japan en Duitsland.
8. Breng het brandpunt 200 μm boven het bovenste glasoppervlak om de binnenkant van de oplossing te observeren.
9. Klik op de telsnelheid en controleer de snelheid van het aantal fotons.
10. Verhoog geleidelijk de AOTF-waarde (acousto-optic tunable filters) (bijv. excitatielasertransmissie) zodat de telsnelheidswaarde meer dan 10 kHz is.
11. Klik op de pinhole-aanpassing en open de wizard pinhole-aanpassing. Zoek de pinhole positie met het hoogste (een piek) aantal fotonen in zowel de x- als de y-as.
12. Draai de correctiering van de objectieve lens zo dat de tellingen per molecuul (CPM) de hoogste zijn.
    OPMERKING: Aangezien de dikte van het afdekglas van de hier gespecificeerde kamer 0,12-0,17 mm is, bevindt de correctiering zich rond het minimum of slechts een paar omwentelingen ervan, waar de CPM maximaal is.
13. Verlaag de AOTF-waarde geleidelijk, zodat de CPM-waarde 2-3 kHz wordt.
14. Verkrijg de autocorrelation functie (ACF) van Rh6G gedurende 90 s.
15. Zodra de meting is voltooid, klikt u op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.
16. Selecteer een model voor eencomponent driedimensionale (3D) diffusie met een tripletstatus.
    OPMERKING: De Rh6G is monodisperse en eencomponenten diffuus met een triplettoestand.
17. Stel de begintijd van de montage in door de rode lijn te verplaatsen. Klik op Alles passen en controleer de afwijking van de pasvorm. Zorg er na het uitvoeren van de curvefitting voor dat de diffusietijd (DT) en de structuurparameter (SP) ruwweg tussen respectievelijk 20-30 μs en 4-8 liggen.
18. Onthoud de waarde van de structurele parameter. Gebruik de SP-waarde voor curvemontageanalyse van alle ACL's die op dezelfde dag worden gemeten, onder dezelfde optische omstandigheden, en met hetzelfde type glazen basisschaal of kamerdekselglas dat op het microscoopstadium is geplaatst.

5. FCS-meting in cellysaat

1. Bereid de cellysaten voor (zie hierboven).
2. Plaats het lysaat op de glazen afdekkamer. Plaats een deksel om uitdroging te voorkomen en het podiumdeksel voor lichte schaduw.
3. Stel de aanschafconditie, laservermogen, meettijd en herhalingen in.
4. Klik op Telsnelheid en pas de AOTF-waarde van de laser aan zodat de CPM-waarde meer dan 1 kHz wordt.
5. Voer een proefmeting uit gedurende 1 min. Controleer of de berekende ACF een positieve amplitude en glad verval vertoont.
6. Voer de hoofdmeting gedurende 5 minuten uit.
   OPMERKING: De totale meettijd wordt geleidelijk verhoogd totdat de vorm van de ACF niet verandert, zelfs niet als de meettijd wordt verhoogd.
7. Klik op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.
8. Selecteer een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus. Vergeet niet om de SP-waarde in te voeren en de instelling te wijzigen in "Opgelost" niet "Gratis" voordat u op Alles passen klikt.
9. Exporteer de ingerichte tabel als een door tabs gescheiden tekstbestand.
10. Exporteer indien nodig de ACF- en count-tariefrecord als een door tabbladen gescheiden tekstbestand.

6. FCS-meting in levende cellen

1. Vervang het medium door een nieuw medium voor de meting.
2. Gebruik een warmtefase incubator. Zet de celkweekschaal op het microscoopstadium.
3. Bevestig de scherpstelling en positie met behulp van de confocale micrope. Selecteer de meetcel. Zoom in en pas de celpositie aan. Verkrijg fluorescentiebeelden van een GFP-expresserende cel met behulp van de modus voor langzame scansnelheid.
4. Selecteer een FCS-meetpositie met behulp van Positie in de sectie "FCS".
5. Selecteer ten minste één FCS-meetpunt met behulp van een kruisdraad (figuur 1).
6. Meet de ACF gedurende 1 min.
   OPMERKING: Omdat fluorescerende eiwitten de neiging hebben om in levende cellen te worden gefotobleekt als gevolg van langzame beweging in vergelijking met de oplossing, moet de meettijd minimaal zijn. Het is over het algemeen moeilijk om ACF in de cel zo soepel te verkrijgen als oplossingsmetingen, omdat langdurige metingen zullen leiden tot fotobleaching van fluorescerende eiwitten.
7. Klik op Aanpassen om curve-montageanalyse uit te voeren met behulp van een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus.
   OPMERKING: Voor metingen van levende cellen zou een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een triplettoestand beter zijn omdat het empirisch moeilijk is om de chi-kwadraatwaarde te verlagen met een 3D-diffusiemodel met één component vanwege het bestaan van verschillende mobiele componenten in de levende cel. Maar zelfs met behulp van een model voor driecomponenten 3D-diffusie, worden de diffusiecomponenten meestal niet gescheiden in vergelijking met het gebruik van het model voor twee componenten.

Results

We voerden FCS-meting uit van GFP-TDP25 in cellysaat en SOD1-G85R-GFP in levende cellen. In beide gevallen konden een positieve amplitude en gladde ACL's worden verkregen. We hebben aangetoond dat een deel van GFP-TDP25, uitgedrukt in Neuro2a-cellen, werd teruggevonden in de oplosbare fractie onder de aangegeven toestand⁶. In de oplosbare fractie van het cellysaat werden extreem heldere fluorescentiemoleculen gedetecteerd in het fotontellingssnelheidsrecord met behulp van FCS(...

Discussion

Wat de systeemkalibratie vóór de metingen betreft, moet hetzelfde glaswerk worden gebruikt als het glaswerk dat wordt gebruikt om het monster te meten (bv. de 8-putten bedekken de glazen kamer voor cellysaat en de glazen basisschaal van 35 mm voor levende cellen). Door de adsorptie van Rh6G op het glas kan de effectieve concentratie soms afnemen. Als dat het gevolg is, moet een sterk geconcentreerde Rh6G-oplossing zoals 1 μM alleen voor de pinhole-aanpassing worden gebruikt. Extreem hoge fotontellingen moeten worden verm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	Voor meting van levende cellen
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminium plaat	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objectief
Celkrabber	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetaat filtermembraan (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Dekglaskamer 8-wells	IWAKI	5232-008	Voor oplossingsmeting
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basismedium
Foetaal bovien serum (FBS)	biosera		Lotcontrole vereist
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS-systeem
Murine neuroblastoma Neuro2a cellen	ATCC	CCL-131	Cellijn
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmied-DNA voor de transfectiedrachter
Penicilline-Streptomycine Oplossing (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmied-DNA voor TDP25 getagd met monomer eGFP
pmeGFP-N1			Plasmied-DNA voor eGFP monomeer expressie
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmied-DNA voor ALS-gekoppelde G85R mutant van SOD1 getagd met monomer eGFP
Protease remmercocktail	Sigma-Aldrich	P8304