We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (ZvH), enzovoort. Om oplosbare of diffuse eiwit oligomeren of aggregaten te detecteren en te analyseren, is fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt, die de diffusiesnelheid en helderheid van een enkel deeltje met een enkele molecuulgevoeligheid kan detecteren. De juiste procedure en knowhow voor de detectie van eiwitaggregatie zijn echter niet op grote schaal gedeeld. Hier tonen we een standaardprocedure van FCS-meting voor diffusie-eigenschappen van aggregatiegevoelige eiwitten in cellysaat en levende cellen: ALS-geassocieerd 25 kDa carboxyl-terminal fragment van TAR DNA/RNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP25) en superoxide dismutase 1 (SOD1). De representatieve resultaten tonen aan dat een deel van de aggregaten van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld TDP25 enigszins was opgenomen in de oplosbare fractie van murien neuroblastoom Neuro2a cellysaat. Bovendien toont GFP-gelabelde SOD1 met ALS-geassocieerde mutatie een langzamere diffusie in levende cellen. Dienovereenkomstig introduceren we hier de procedure om de eiwitaggregatie via de diffusie-eigenschap ervan te detecteren met behulp van FCS.
Inleiding
Eiwitaggregaties met neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, enzovoort1 zijn bekend als giftig en zouden de eiwithomeostase (proteostase) in de cellen en organen verstoren, wat dan kan leiden tot veroudering2. De klaring van eiwitaggregatie wordt verwacht als een therapeutische strategie; chemische stoffen die eiwitaggregatievorming voorkomen en eiwitaggregaten afbreken (bijv. kleine moleculen of geneesmiddelen) zijn echter nog niet vastgesteld. Bovendien blijft de manier waarop eiwitaggregatie toxiciteit uito....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Materialen en reagentia
- Gebruik pyrogene vrije oplossingen en medium voor celkweek (Tabel 1).
- Bereid oplossingen voor het biochemische experiment met ultrapure water en gebruik als DNase / RNase vrij.
- Selecteer een geschikte FBS voor de celcultuur met een partijcontroleproces. Aangezien de geselecteerde FBS-lot regelmatig verandert, kunnen de catalogus en het lotnummer voor FBS hier niet worden weergegeven.
- Plasmide DNA
- Bereid pmeGFP-N15 voor op eGFP monomeerexpressie; pmeGFP-C1-TDP256 voor GFP-TDP25-expressie; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We voerden FCS-meting uit van GFP-TDP25 in cellysaat en SOD1-G85R-GFP in levende cellen. In beide gevallen konden een positieve amplitude en gladde ACL's worden verkregen. We hebben aangetoond dat een deel van GFP-TDP25, uitgedrukt in Neuro2a-cellen, werd teruggevonden in de oplosbare fractie onder de aangegeven toestand6. In de oplosbare fractie van het cellysaat werden extreem heldere fluorescentiemoleculen gedetecteerd in het fotontellingssnelheidsrecord met behulp van FCS(.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wat de systeemkalibratie vóór de metingen betreft, moet hetzelfde glaswerk worden gebruikt als het glaswerk dat wordt gebruikt om het monster te meten (bv. de 8-putten bedekken de glazen kamer voor cellysaat en de glazen basisschaal van 35 mm voor levende cellen). Door de adsorptie van Rh6G op het glas kan de effectieve concentratie soms afnemen. Als dat het gevolg is, moet een sterk geconcentreerde Rh6G-oplossing zoals 1 μM alleen voor de pinhole-aanpassing worden gebruikt. Extreem hoge fotontellingen moeten worden verm.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Deze auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
A.K. werd ondersteund door een Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), door een grant-in-aid van de Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, door een subsidie van Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) en een grant-in-aid van Hoansha Foundation. M. K. werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) en een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | Voor meting van levende cellen |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminium plaat | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objectief | |
| Celkrabber | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetaat filtermembraan (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Dekglaskamer 8-wells | IWAKI | 5232-008 | Voor oplossingsmeting |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basismedium |
| Foetaal bovien serum (FBS) | biosera | Lotcontrole vereist | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS-systeem | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cellen | ATCC | CCL-131 | Cellijn |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmied-DNA voor de transfectiedrachter |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmied-DNA voor TDP25 getagd met monomer eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmied-DNA voor eGFP monomeer expressie | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmied-DNA voor ALS-gekoppelde G85R mutant van SOD1 getagd met monomer eGFP | ||
| Protease remmercocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referenties
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
