Chirurgie en monsterverwerking voor correlatieve beeldvorming van de muriene longklep

Summary

Hier beschrijven we een correlatieve workflow voor de excisie, druk, fixatie en beeldvorming van de muriene longklep om de bruto-conformatie en lokale extracellulaire matrixstructuren te bepalen.

Abstract

De onderliggende oorzaken van hartklepgerelateerde ziekte (HVD) zijn ongrijpbaar. Murine diermodellen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van HVD, maar de chirurgische en instrumentale expertise die nodig is om de structuur en organisatie nauwkeurig te kwantificeren over meerdere lengteschalen heeft de vooruitgang belemmerd. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de muriene dissectie, en bloc kleuring, monsterverwerking en correlatieve beeldvormingsprocedures voor het weergeven van de hartklep op verschillende lengteschalen. Hydrostatische transvalvulaire druk werd gebruikt om de temporele heterogeniteit te beheersen door de hartklepconformatie chemisch te bevestigen. Micro-computertomografie (μCT) werd gebruikt om de geometrie van de hartklep te bevestigen en een referentie te geven voor de downstream monsterverwerking die nodig is voor de seriële blokkoping elektronenmicroscopie (SBF-SEM). Seriële SEM-beelden met hoge resolutie van de extracellulaire matrix (ECM) werden genomen en gereconstrueerd om een lokale 3D-weergave van de organisatie te bieden. μCT- en SBF-SEM-beeldvormingsmethoden werden vervolgens gecorreleerd om de ruimtelijke variatie over de longklep te overwinnen. Hoewel het gepresenteerde werk uitsluitend op de longklep is, kan deze methodologie worden gebruikt voor het beschrijven van de hiërarchische organisatie in biologische systemen en is cruciaal voor de structurele karakterisering over meerdere lengteschalen.

Introduction

De longklep (PV) dient om eenrichtingsbloeding tussen de rechterventrikel en de longslagader te garanderen. Longklepmisvormingen worden geassocieerd met verschillende vormen van aangeboren hartaandoeningen. De huidige behandeling voor aangeboren hartklepziekte (HVD) is valvulaire reparatie of klepvervanging, die meerdere invasieve operaties gedurende de hele levensduur van een patiënt kan vereisen¹. Het is algemeen aanvaard dat de functie van de hartklep is afgeleid van de structuur, vaak aangeduid als de structuur-functie correleren. Meer specifiek bepalen de geometrische en biomechanische eigenschappen van het hart zijn functie. De mechanische eigenschappen worden op hun beurt bepaald door de samenstelling en organisatie van de ECM. Door een methode te ontwikkelen voor het bepalen van de biomechanische eigenschappen van muriene hartkleppen, kunnen transgene diermodellen worden gebruikt om de rol van het ECM op de hartklepfunctie en disfunctie^2,3,4,5te ondervragen.

Het muriene diermodel wordt al lang beschouwd als de standaard voor moleculaire studies omdat transgene modellen gemakkelijker beschikbaar zijn bij muizen in vergelijking met andere soorten. Murine transgene modellen bieden een veelzijdig platform voor het onderzoeken van hartklep-gerelateerde ziekten⁶. De chirurgische expertise en instrumentatievereisten om zowel de geometrie als de ECM-organisatie te karakteriseren, zijn echter een belangrijke hindernis geweest bij het voortgang van HVD-onderzoek. Hstologische gegevens in de literatuur geven een beeld van het extracellulaire matrixgehalte van de muriene hartklep, maar alleen in de vorm van 2D-afbeeldingen, en kunnen de 3D-architectuur^7,8niet beschrijven . Bovendien is de hartklep zowel ruimtelijk als tijdelijk heterogeen, waardoor het moeilijk is om conclusies te trekken over experimenten met betrekking tot ECM-organisatie als de bemonstering en exterieur niet vastliggen. Conventionele 3D-karakteriseringsmethoden, zoals MRI of 3D-echocardiografie, bieden niet de resolutie die nodig is om ECM-componenten^9,10op te lossen .

Dit werk beschrijft een volledig correlatieve workflow waarbij de temporele heterogeniteit als gevolg van de hartcyclus werd aangepakt door de conformatie van de muriene PV met hydrostatische transvalvulaire druk vast te stellen. De ruimtelijke heterogeniteit werd nauwkeurig gecontroleerd door bemonsteringsgebieden van belang en het registreren van datasets van verschillende beeldvormende modaliteiten, met name μCT en seriële blok gezichtsscan elektronenmicroscopie, over verschillende lengteschalen. Deze methode van scouting met μCT voor het begeleiden van downstreambemonstering is eerder voorgesteld, maar omdat de longklep temporele variatie vertoont, was een extra niveau van controle nodig op chirurgisch niveau¹¹.

In vivo studies die muriene hartklepbiomechanica beschrijven, zijn schaars en vertrouwen in plaats daarvan op rekenmodellen bij het beschrijven van het vervormingsgedrag. Het is van cruciaal belang dat lokale extracellulaire gegevens op de nanometerlengteschaal verband houden met de geometrie en locatie van de hartklep. Dit biedt op zijn beurt kwantificeerbare, ruimtelijk in kaart gebrachte distributies van mechanisch bijdragende ECM-eiwitten, die kunnen worden gebruikt om bestaande biomechanische hartklepmodellen^12,13,14te versterken .

Protocol

Het gebruik van dieren in deze studie was in overeenstemming met de landelijke commissie voor de verzorging en het gebruik van dieren in het Kinderziekenhuis volgens protocol AR13-00030.

1. Pulmonale klep excisie

1. Autoclaaf de benodigde tools die nodig zijn voor de muisdissectie. Dit omvat fijne scharen, micro-forceps, micro vasculaire klemmen, klem aanbrengende tang, microneedle houders, veerschaar en oprolmechanismen.
2. Acclimatiseren alle muizen gedurende minimaal 2 weken voor de operatie. Verwijder C57BL/6 muizen, ongeveer 1 jaar oud, uit hun kooien en weeg, euthanaseer vervolgens met een ketamine/xylazine cocktail (3:1 ketamine:xylazine, 0,01 ml per g) overdosis.
3. Plaats de muis in een dorsale lighouding op een lade en zet de ledematen vast met tape. Eenmaal vastgezet, voert u de thoracotomie uit.
   1. Stel het hart bloot door overtollig vetweefsel en fascia te verwijderen.
   2. Verwijder het rechter atrium en doordrenk door de linkerventrikel met zoutoplossing op kamertemperatuur (0,9% NaCl). De perfusie moet ongeveer 20 ml over 30 s duren. Dit resulteert in de exsanguinatie van de muis.
4. Verwijder het hele hart door de superieure vena cava, inferieure vena cava, longslagader en aorta door te breken. Speciale zorg moet worden genomen voor de longslagader. Snijd ongeveer 2 mm boven de ventriculo-arteriële verbinding, omdat dit zal dienen als de buis voor druk.
5. Verwijder de linker- en rechterventrikel om de kamers bloot te stellen aan atmosferische druk. Zorg ervoor dat de structuur van de longstam niet wordt aangetast door het verwijderen van de ventrikels.

2. Drukfixatie van longklep

1. Anastomose drukslang met longslagader, waardoor ongeveer 1 mm afstand tussen de sino-tubulaire verbinding en het einde van de slang overblijft om grote bewegingen van de folders en de longstam mogelijk te maken.
2. Verhef het reservoir tot een analoge fysiologische druk en vul het met de zoutoplossing. Test het doorstroomsysteem om er zeker van te zijn dat er geen verstoppingen of luchtbellen zijn.
3. Bevestig een kraan aan de anastomosed longklep en zorg voor voldoende doorstroming door de slang (d.w.z. geen luchtbellen) door het uitstroomkanaal te schakelen. Zodra de stroom voldoende is, schakelt u de uitstroom naar de anastomosed longklep en zorgt u voor druk van de longstam. Dit wordt geïdentificeerd door pulmonale rompopstand.
4. Zodra de druk van de longstam is bevestigd, moet geleidelijk primaire fixatieve oplossing (1,25% glutaraldehyde, 1,0% paraformaldehyde in cacodylaat van 0,15 M) worden opgenomen totdat de zoutoplossing is gezuiverd. Dit wordt gedaan door een deel, ongeveer 25% van de reservoircapaciteit, van de zoutoplossing te verwijderen en te vervangen door het primaire fixatieve.
   LET OP: De gebruikte fixatsmiddelen (paraformaldehyde en glutaraldehyde) zijn zeer giftig en om de veiligheid te garanderen, moeten geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) worden gedragen.
5. Plaats een fixatief gedrenkt gaas over het weefselmonster om uitdroging te voorkomen.
6. Doorlaat het fixatief gedurende 3 uur en vul het reservoir indien nodig bij om een constante druk te behouden. Tijdens de fixatie is het niet ongewoon dat de longklep krimpt vanwege de chemische fixatie. Als dit het geval is, vult u het reservoir voortdurend aan met primair fixatief om fysiologische druk te behouden.
7. Bewaar de hartklep in de fixatieve oplossing bij 4 °C tot gebruik. Monsters werden maximaal 1 week bewaard zonder enig waarneembaar verschil.

3. En bloc monsterkleuring en inbedding^15,16

LET OP: De kleuringsreagentia die in deze rubriek worden gebruikt (kaliumferrocyanide, osmiumtetroxide, thiocarbohydrazide, loodaspartaat en uranylacetaat) zijn zeer giftig en moeten met uiterste zorg worden behandeld. Het gebruik van een afzuigkap en een goede PBM wordt geadviseerd.

1. Kleuring
   1. Was het monster van de vaste hartklep gedurende 5 minuten met een koude cacodylaatbuffer van 0,15 M. Herhaal de was nog twee keer.
   2. Dompel de hartklep volledig onder in een oplossing van 1,5% kaliumferrocyanide, 0,15 M cacodylaat, 2 mM calciumchloride en 2% osmiumtetroxide, gedurende 1 uur op ijs.
   3. Bereid tijdens het incuberen thiocarbohydrazide (TCH)-oplossing door 0,1 g TCH op te lossen in 10 ml ddH₂O. Plaats de oplossing gedurende 1 uur in een oven van 60 °C. Roer voorzichtig regelmatig om ervoor te zorgen dat TCH volledig is opgelost. Filtreer de oplossing vlak voor gebruik door een spuitfilter van 0,22 μm.
   4. Was de monsters met kamertemperatuur ddH 2 O door ze gedurende₅minuten in een buis van ddH₂O te plaatsen en licht te roeren door de container te schudden. Herhaal dit proces drie keer.
   5. Plaats het in gefilterde TCH-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voer de wasstap drie keer (elk 5 min) uit met kamertemperatuur ddH₂O zoals beschreven in stap 3.1.4.
   6. Als u klaar bent, plaatst u het monster gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in 2% osmiumtetroxide. Was het vervolgens opnieuw gedurende in totaal drie keer gedurende 5 minuten elk met kamertemperatuur ddH₂O.
   7. Incubeer het monster in 1% uranylacetaat 's nachts bij 4 °C.
   8. Maak gedurende deze tijd een oplossing van 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuurvoorraadoplossing. Stel de pH in op 5,5 met 1 N KOH. Plaats de oplossing in een oven van 60 °C om loodnitraat op te lossen.
   9. Voer na de nachtelijke incubatie de wasstap uit zoals beschreven in stap 3.1.4. Herhaal dit drie keer. Incubeer vervolgens het hartklepweefsel in lood aspartaatoplossing vanaf stap 3.1.8 in een oven van 60 °C gedurende 30 minuten.
2. Dehydratie
   1. Was de tissues 5 min op kamertemperatuur met ddH₂O. Herhaal dit driemaal.
   2. Maak verse oplossingen van 20%, 50%, 70%, 90% en 100% ethanol in ddH₂O. Houd op ijs tot gebruik.
   3. Om het hartklepweefsel uit te drogen. Voer daaropvolgende behandelingen uit van 20%, 50%, 70% en 90% ethanol op ijs gedurende elk 5 minuten. Voer vervolgens twee daaropvolgende behandelingen van 100% ethanol op ijs gedurende 5 minuten uit.
   4. Verplaats het weefsel gedurende 10 minuten naar ijskoud aceton. Plaats vervolgens 10 minuten verse aceton op kamertemperatuur.
3. Insluiten
   1. Maak het harsmengsel (zie tabel met materialen)volgens de specificaties van de fabrikant: 11,4 g component A, 10 g component B, 0,3 g component C en 0,05-0,1 g component D. Meng in eerste instantie de componenten A en B door elk van de componenten te verwarmen tot 60 °C voordat u de componenten C en D toevoegt. Het mengsel verandert in een amberkleur bij het toevoegen van componenten C en D. Het zal uniform zijn wanneer het goed wordt gemengd.
   2. Maak mengsels met volumeverhoudingen van 25:75, 50:50 en 75:25 hars:aceton. Meng.
   3. Plaats weefsels in volgende behandelingen van het 25:75, 50:50 en 75:25 hars:acetonmengsel gedurende elk 2 uur bij kamertemperatuur.
   4. Plaats weefsels 's nachts in 100% hars bij kamertemperatuur.
   5. Plaats de volgende dag weefsels in verse 100% hars gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   6. Breng de hartklepweefsels over naar een inbeddingscapsule, vervang ze door verse 100% hars en plaats ze 48 uur in een oven van 60 °C om uit te harden.
4. Voer correlatieve beeldvorming uit zoals hieronder wordt weergegeven.

4. Micro-computertomografie beeldvorming

1. Monteer het harsmonsterblok met een lijm (lijm of dubbelzijdige tape werkt goed) op een μCT-monsterhouder.
2. Plaats de houder in een μCT-kamer en bevestig deze op het podium door de spantang zodanig te schroeven dat er geen beweging van de houder is. Voorbeeldbeweging tijdens de scan vermindert de beeldkwaliteit.
3. Open de μCT-gebruikersinterface door op het pictogram te dubbelklikken. Voeg een project toe door het + -teken naast Projecten te selecteren en de benodigde velden in te vullen.
4. Zodra dit is gemaakt, zoekt u het gemaakte project en selecteert u het door erop te klikken. Hiermee wordt een tweede kolom Acquisitiesgeopend . Selecteer de + naast Aanwinsten en vul de benodigde velden in.
5. Sluit de kamerdeuren en bewapen het systeem door op de bewapeningsknop op het voorpaneel of de μCT te drukken. Maak röntgenfoto's van de gebruikersinterface door de knop te selecteren die opWarmingaangeeft .
   OPMERKING: Het systeem schakelt de röntgenfoto's automatisch uit na een succesvolle opwarmprocedure. Schakel röntgenfoto's in door de knop te selecteren.
6. Pas de podiumrotatie zo aan dat het middelpunt van de rotatie van het monster niet afwijkt van het midden van de monitor (d.w.z. het monster bevindt zich binnen het gezichtsveld voor de hele scan). Voor het systeem dat voor dit experiment wordt gebruikt, houdt dit in dat de fase van de regio van belang (ROI) wordt aangepast onder het vervolgkeuzetabblad zoals hieronder beschreven.
   1. Stel de instelling van de ROI-fase in door de rotatiehoek op 0° in te stellen en de rand van het monster te markeren. Het monster wordt vervolgens 180° gedraaid en de rand van het monster wordt opnieuw gemarkeerd.
   2. Pas de x-aspositie van de ROI-fase zo aan dat de rand van het monster zich tussen deze twee uitersten bevindt. Herhaal dit proces voor rotatiehoeken van 90° en 270° voor de y-stand.
   3. In het geval dat de rotatie van het monster ervoor zorgt dat de randen uit het gezichtsveld bewegen, vermindert u de vergroting van de μCT-behoeften totdat de randen van het monster zichtbaar zijn onder de hierboven ingestelde hoeken en een grove ROI-faseaanpassing kan worden uitgevoerd.
   4. Eenmaal aangepast bij de onderste vergroting, verplaatst u het monster of de detector om de vergroting te verhogen en kunnen de ROI-posities nauwkeurig worden aangepast.
      OPMERKING: Dit proces moet mogelijk worden herhaald om de uitlijning te garanderen. Een juiste uitlijning resulteert in een monster dat weinig tot geen horizontale beweging door alle rotatiehoeken van het monster laat zien.
7. Pas de μCT aan op de gewenste scanparameters met behulp van de software van de fabrikant. Deze parameters omvatten buispotentiaal, buisstroom, detectorafstand, monsterafstand, belichtingstijd, traject en het aantal projecties (zie tabel S1 voor de μCT-acquisitieparameters die in dit onderzoek worden gebruikt).
   OPMERKING: Kalibratieparameters, zoals duidelijke veld- en donkere veldscans, moeten volgens de specificaties van de fabrikant worden bewaard, tenzij anders vermeld. Als een monster bijvoorbeeld te groot is en het systeem het monster niet uit de veldweergave kan verplaatsen, moet het monster worden verwijderd om duidelijke veldkalibratiescans uit te voeren.
8. Zodra de parameters zijn ingesteld, kan een benadering van de duur van de scan worden gezien door op de knop Tijdschatting te drukken. Selecteer de startknop om de scan te starten.
9. Zorg er na afloop van de scan voor dat de röntgenfoto's zijn uitgeschakeld, schroef de spantang los en verwijder het monster voorzichtig uit de μCT-kamer.

5. Monsterverwerking en beeldcorrelatie

1. Reconstrueer μCT-projecties met behulp van een gefilterd projectiealgoritme met de software van de fabrikant (zie tabel met materialen).
   1. Selecteer het tabblad Recon boven aan het scherm. Selecteer het tabblad Project en acquisitie.
   2. Selecteer de recon-sjabloon die is gekoppeld aan de teruggefilterde projectie. Druk op de knop Recon starten.
2. Identificeer en segmenteer de longklep met behulp van beeldverwerkingssoftware. Dit vereist voorkennis van de anatomie van de longklep¹⁷. Bij verhoogde arteriële druk coapt en blokkeert de blaadjes het lumen van de longklep.
3. Identificeer de snijrichting ten opzichte van de scanrichting en het monster. Heroriënteer het monster zodanig dat de snijrichting is uitgelijnd met de gewenste as.
4. Identificeer regio's die van belang zijn voor beeldvorming met hoge resolutie. In dit experiment werd gekozen voor de buik (midden) van de folder en de arterio-valvulaire kruising.
5. Verwijder de overtollige hars en het monster door scheermesje of schuren voor grote stukken materiaal, of door microtome voor fijnere stukken.
6. Eenmaal op een locatie van belang, vergelijkt u het fysieke monster met virtuele μCT-segmenten om de locatie te bevestigen. Dit werd gedaan door anatomische kenmerken aan de doorsnede te vergelijken.

6. Seriële blok gezicht scannen elektronenmicroscopie¹⁸

1. Verklein de doorsnede van het monster voor SBF-SEM, ongeveer 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Monteer het bijgesneden monster met epoxy op de SBF-SEM aluminium stomp.
3. Bedek het monsterblok met 35 nm goud. Draai het monster op het platform om een gelijkmatige laag coating aan te brengen.
4. Ontlucht de SBF-SEM-kamer en stel de hoogte van het mes in op de eucentrische hoogte van de microscoop.
5. Plaats het monster en breng de monsterstub waterpas.
6. Afbeelding onder lage vacuümomstandigheden om opladen te voorkomen en met backscatterdetector (zie tabel S2 voor SBF-SEM acquisitieparameters).
7. Afbeelding en steek meerdere gebieden van belang bij verschillende vergrotingen met behulp van geautomatiseerde software (zie tabel met materialen).

Results

Anastomose van de longslagader naar de drukslang is weergegeven in figuur 1A. Na het toepassen van hydrostatische druk distent de longstam radiaal (figuur 1B) wat aangeeft dat de longklepbijsluiters zich in een gesloten configuratie bevinden. Longklepconformatie werd bevestigd door μCT. In dit geval waren de bijsluiters coapt (gesloten) en was de annulus circulair (figuur 2A). Figuur 2B,C

Discussion

Verwijdering van de ventrikels dient twee doeleinden. Ten eerste, het blootstellen van de ventrikelzijde aan de atmosferische druk, waardoor alleen een transvalvulaire druk van de arteriële kant van de longklep hoeft te worden uitgeoefend om te sluiten, en ten tweede, het verstrekken van een stabiele basis om verdraaiing van de longstam te voorkomen. Tijdens drukopzetting disteneert de longstam radiaal en inferieur, waardoor deze gevoelig is voor verdraaiing, waardoor de longstam instort. Het voorladen van de longklep me...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primaire fixeermiddelcomponent
0.9% natriumchloride-injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL-sering	BD	309659
10 mL-sering	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G naald	BD	305156
3 mL-sering	BD	309657
3-weg stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmiumtetraoxide	EMS	19150	Kleurcomponent
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primaire fixeermiddelcomponent
Absorbeerbare hemostaat	Ethicon	1961
Aceton	EMS	10012
Zwarte polyamide monofilament naad, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Zwarte polyamide monofilament naad, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 muizen	Jackson Laboratories	664	Ongeveer 1 jaar oud
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Klemtoepasser	FST	00072-14
Wattenstaafjes	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 pincet	FST	11251-20
Dumont #5/45 pincet	FST	11251-35
Dumont #7 fijn pincet	FST	11274-20
Durcupan ACM hars	EMS	14040	Voor inbedding
Fijn schaar	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketaminehydrochloride-injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-asparaginezuur	Sigma-Aldrich	56-84-8	Kleurcomponent
Lodzaniaat	EMS	17900	Kleurcomponent
laagvacuüm backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson pincet	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0,22 µm, PES 33 mm, niet-sterieel	EMD Millipore	SLGP033NS
Niet-geweven zwammen	McKesson Corp.	94442000
Kaliumhexacyanoferraat(II)-trihydraat	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Kleurcomponent
Kaliumhydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Drukbewakingslijn	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Zoutoplossing (steriele 0,9% natriumchloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Inbeddingscontainer
Natriumcacodylate trihydraat	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractoren	FST	17000-04
Sputter, koolstof en e-beam coater	Leica	EM ACE600	Goudcoater
Chirurgisch microscoop	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Kleurcomponent
Tish naaldaanhanger/pincet	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranylacetaat	EMS	22400	Kleurcomponent
Volumescope rasterelektronenmicroscoop	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serieel Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazinesteriele oplossing	Akorn Inc.	NADA# 139-236