Micro-injectie methode voor Anopheles gambiae embryo's

Samenvatting

Micro-injectietechnieken zijn essentieel om exogene genen in het genoom van muggen te introduceren. Dit protocol verklaart een methode die door het James-laboratorium wordt gebruikt om DNA-constructies in Anopheles gambiae-embryo's te micro-injecteren om getransformeerde muggen te genereren.

Samenvatting

Embryo micro-injectie technieken zijn essentieel voor vele moleculaire en genetische studies van insectensoorten. Ze bieden een middel om exogene DNA-fragmenten die coderen voor genen van belang en gunstige eigenschappen op een stabiele en erfelijke manier in de kiembaan van insecten te introduceren. De resulterende transgene stammen kunnen worden bestudeerd voor fenotypische veranderingen als gevolg van de expressie van het geïntegreerde DNA om basisvragen te beantwoorden of worden gebruikt in praktische toepassingen. Hoewel de technologie eenvoudig is, vereist het van de onderzoeker geduld en oefening om een vaardigheidsniveau te bereiken dat de efficiëntie maximaliseert. Hier afgebeeld is een methode voor micro-injectie van embryo's van de Afrikaanse malariamug, Anopheles gambiae. Het doel is om door middel van micro-injectie exogene DNA aan het embryo af te leveren, zodat het kan worden opgenomen in de zich ontwikkelende kiembaan (pool) cellen. Expressie uit het geïnjecteerde DNA van transposasen, integrasen, recombinases of andere nucleasen (bijvoorbeeld CRISPR-geassocieerde eiwitten, Cas) kan gebeurtenissen veroorzaken die leiden tot de covalente insertie in chromosomen. Transgene An. gambiae gegenereerd uit deze technologieën zijn gebruikt voor basisstudies van componenten van het immuunsysteem, genen die betrokken zijn bij bloedvoeding en elementen van het reuksysteem. Bovendien zijn deze technieken gebruikt om An. gambiae-stammen te produceren met eigenschappen die kunnen helpen de overdracht van malariaparasieten onder controle te houden.

Inleiding

Micro-injectietechnieken worden sinds de vroege jaren 1900 gebruikt om organismen experimenteel te manipuleren¹. Micro-injectie is gebruikt om zowel biologische basisfuncties te bestuderen als /of belangrijke veranderingen in de biologie van een gewenst organisme aan te brengen. De micro-injectietechniek is van bijzonder belang geweest voor vectorbiologen en is veel gebruikt om vectorgenomen^2-11te manipuleren. Transgenese-experimenten in geleedpotige vectoren zijn vaak bedoeld om vectoren minder efficiënt te maken in het overbrengen van pathogenen door veranderingen door te voeren die de fitheid van een vector verminderen of de refractie verhogen voor de pathogenen die ze overbrengen. Muggen brengen een verscheidenheid aan menselijke ziekteverwekkers over en hebben een aanzienlijke impact op de morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Het geslacht Van muggen anopheles brengt de menselijke malariaparasitaire pathogenen, Plasmodium spp, over. Genetische manipulatie-experimenten met Anopheles hebben tot doel de biologie beter te begrijpen en de vectoriële capaciteit van deze muggen te verminderen in pogingen om nieuwe malaria-eliminatiestrategieën te ontwikkelen.

De muggenvectoren die wereldwijd de meeste malaria-infecties veroorzaken, bevinden zich in het Anopheles gambiae-soortencomplex. De meeste succesvolle transgenese-experimenten zijn echter uitgevoerd op de malariavector van het Indiase subcontinent, Anopheles stephensi. Hoewel er veel laboratorium-aangepaste Anopheles gambiae stammen bestaan, is het aantal transgene Anopheles gambiae spp. lijnen gerapporteerd in de literatuur niet te vergelijken met dat van Anopheles stephensi. Er wordt gedacht dat het Anopheles gambiae embryo moeilijker te injecteren is en succesvolle transgenese bereikt dan Anopheles stephensi, hoewel de redenen voor deze verschillen onbekend zijn. Dit protocol beschrijft een methode waarvan bewezen is dat deze consistent succesvol is in het bereiken van transgenese van Anopheles gambiae embryo's via micro-injectie. Het protocol is gebaseerd op een methode die eerder is ontwikkeld door Hervé Bossin en Mark Benedict¹² met enkele aanvullende details en wijzigingen die zijn toegevoegd die de efficiëntie van transgenese blijken te verhogen.

Protocol

1. Muggen voorbereiden op micro-injectie

1. Zaai een kooi¹³ (~ 5000 cm³) met ~ 100 mannelijke en 200-300 vrouwelijke 1-2 dagen volwassen post-eclosie muggen en laat ze 2 dagen paren.
2. Geef muggen na de paarperiode een bloedmaaltijd met behulp van 2 ml bloed met een kunstmatig voedingsapparaat of levende verdoofde dieren, afhankelijk van insectenpraktijken¹⁴. Geef muggen de volgende dag een tweede bloedmaaltijd om ervoor te zorgen dat alle gepaarde vrouwtjes de gelegenheid hebben gehad om zich te voeden en dat gedeeltelijk gevoede muggen volledig zijn opgezwollen.
3. Gebruik de muggen voor embryoverzamelingen 2-4 dagen na de tweede bloedmaaltijd.
   OPMERKING: Larvale voeding is belangrijk voor de robuustheid van volwassenen en reproductieve fitheid. Zie Benedictus et al. (2020) voor informatie over het fokken van gezonde insecten¹⁴. Er zijn geen significante verschillen in het leggen van eieren waargenomen wanneer muggen worden gevoed met een kunstmatige feeder of levende verdoofde dieren. Gebruik de methode die routinematig wordt gebruikt voor Anopheles gambiae in het insectarium.

2. Embryopreparatie

1. Gebruik een aspirator om 20-30 vrouwtjes in een transparante conische buis van 50 ml te plaatsen die is gesneden (met een lintzaag) om aan beide uiteinden open te zijn en aan het ene uiteinde bedekt is met latex tandfolie en aan het andere uiteinde nylon gaas en filtreerpapier(figuur 1).
   OPMERKING: De muggen zullen hun eieren op het filterpapier deponeren en het nylon gaas zal het filterpapier stevig op zijn plaats houden. Muggeneieren zijn cilindrisch van vorm, ~ 500 μm lang, ~ 200 μm in diameter op hun breedste punt en taps toelopend aan de voorste en achterste uiteinden(figuur 2).
2. Plaats de met muggen gevulde buis in een kleine (60 mm x 15 mm) petrischaal gevuld met dubbel gedestilleerd water (ddH₂O). Plaats de tube en schaal in een couveuse bij 28 °C gedurende 45 minuten(figuur 3).
3. Haal de buis uit de couveuse en steek de buis in een lege kooi. Tik voorzichtig op de buis om muggen naar buiten te laten vliegen en verwijder de buis uit de kooi zodra alle muggen zijn uitgevlogen.
4. Wanneer de buis vrij is van muggen, schroeft u de onderste ring los, verwijdert u het nylon en gebruikt u een tang om het filterpapier met de eieren voorzichtig uit de buis te verwijderen. Plaats het filtreerpapier in een plastic petrischaaltje (100 mm x 15 mm) met daarin een laag filterpapier bevochtigd met ddH₂O.
5. Observeer de eieren. Eieren die zo oud zijn dat ze lichtgrijs van kleur zijn(figuur 4)zijn klaar voor uitlijning.
   1. Als de eieren nog wit zijn, breng ze dan terug naar de broedmachine en controleer de kleur elke 5 minuten. Witte eieren zijn kwetsbaar, scheuren gemakkelijk en overleven niet goed na het injectieproces, wat resulteert in een laag uitkomen.
   2. Eieren die donkergrijs of zwart zijn, zijn te veel verouderd. Gebruik ze niet.

3. Embryo-uitlijning

1. Knip met een scheermesje een stuk nylon vloeimembraan (2 cm x 1 cm) af en zorg ervoor dat de rand netjes is bijgesneden.
   OPMERKING: Als de rand niet recht is, blijven de eieren tijdens het injectieproces niet goed op het membraan bevestigd.
2. Plaats een membraan op een glasplaat en bedek het membraan met een stuk filterpapier (2 cm x 2 cm), waardoor ~ 1 mm van het membraanfilter onbedekt blijft(figuur 5).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat microscoopglaasjes schoon zijn voor gebruik en gebruik een schone tang om het membraanfilter te manipuleren.
3. Maak het filtreerpapier nat met gedeïoniseerd H₂O, omdat eieren zullen sterven als ze gedurende langere tijd worden uitgedroogd.
   OPMERKING: Doe niet te veel water op het papier omdat de embryo's tijdens het injectieproces zullen bewegen, maar zorg ervoor dat er voldoende is om te voorkomen dat het embryo droogt(Figuur 6A,B). Overtollig water kan worden verwijderd door het te absorberen met een stukfilterpapier.
4. Breng voorzichtig 30-50 embryo's over naar de rand van het membraan met een penseel (maat # 0). Gebruik de borstel om de eieren verticaal langs het membraan uit te lijnen door ze voorzichtig over de glijbaan te rollen, zodat de ventrale kant (bol) naar boven is gericht.
5. Oriënteer alle eieren in dezelfde richting, zodat wanneer de eieren onder de micro-injectiemicroscoop worden waargenomen, het achterste uiteinde (meer puntig, figuur 6A, B) zich in een neerwaartse positie bevindt en een hoek van ~ 15 ° vormt met de naald ( figuur6C). Bekleed de hele rand van het membraan met eieren (30-50) en plaats de dia onder de microscoop voor injectie.
   OPMERKING: Kies de eieren zorgvuldig. Gooi de witte (te jong of onontwikkeld) of donkergrijs (te oud en zal de naald breken) en de abnormale(figuur 7)weg. Zorg ervoor dat het filtreerpapier te allen tijde vochtigblijft.

4. DNA-bereiding

1. Zuiver plasmide DNA's voor injectie, op zijn minst, met een endotoxinevrije DNA-plasmide maxiprep-kit volgens de protocollen van de fabrikant.
2. Resuspend het DNA in water van PCR-kwaliteit en centrifugeer bij 17.100 x g in een gekoelde centrifuge gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe, schone conische buis van 1,5 ml. Voorzichtig micropipet om te voorkomen dat ongewenste deeltjes uit de kolom worden overgebracht.
3. Voer een tweede precipitatie van DNA uit met behulp van een tiende volume 3M natriumacetaat en een tweevoudig volume van 100% ethanol.
4. Resuspend het DNA in 300-500 μL PCR-water voor een uiteindelijke plasmideconcentratie van 1000 ng/μL. Meng de plasmidecocktail in de injectiebuffer voor een uiteindelijke plasmideconcentratie van 300-400 ng/μL en maak 10-20 μL aliquots.
   OPMERKING: DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. DNA-micro-injectie aliquots kunnen worden opgeslagen bij -20 °C, of bij -80 °C bij gebruik van RNA-componenten. Overschrijd niet meer dan 800 ng/μL DNA in het injectiemengsel, omdat de viscositeit ervoor zorgt dat de naalden verstoppen.

5. Naaldvoorbereiding

1. Maak de naalden door 10 cm kwartscapillairen te trekken met behulp van een programmeerbare micropipettetrekker.
2. Onderzoek de naald onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de punt goed is gevormd. Zorg ervoor dat de naaldinstelling op de programmeerbare trekker een punt oplevert die ~0,5 mm van het uiteinde van de terminal begint taps toe te lopen en eindigt in een fijn punt (zie figuur 6). Naalden die gemakkelijk breken, hebben meestal een te lange taps toelopende.
   OPMERKING: De omstandigheden kunnen verschillen afhankelijk van de naaldtrekker (de auteurs zullen op verzoek de instellingen beschikbaar stellen voor de programmeerbare trekker die ze gebruiken. Tijdschriftbeperkingen voorkomen dat we een specifiek merk citeren). Naalden kunnen met de hand worden getrokken, maar dit vereist een vaardighedenset die in de meeste laboratoria niet beschikbaar is.

6. Micro-injectie van embryo's

1. Gebruik een microladerpunt om de naalden te vullen met 2 μL DNA-mengsel. Steek de naald in de naaldhouder en sluit de automatische drukpompbuis aan(figuur 8).
2. Belangrijk: Lijn de naald zo uit dat deze een hoek van 15° maakt met het vlak van de dia(figuur 8).
3. Open de punt van de naald door het eerste ei voorzichtig aan te raken en injecteer het door de punt van de naald ≤ 10 μm in de achterste paal te steken. Een succesvolle injectie zal leiden tot een kleine beweging van het cytoplasma in het ei.
4. Gebruik de coaxiale faseregelaars van de microscoop om naar het volgende ei te gaan om de injectie voort te zetten.
   1. Om ervoor te zorgen dat de naaldpunt open blijft en niet verstopt is, drukt u op de injecteerknop voordat u een ander embryo binnengaat en visualiseert u het kleine druppeltje bij de opening van de naald.
   2. Als de naald verstopt raakt, drukt u op de knop Wissen om de naald te wissen en herhaalt u de druppelvisualisatietest. Pas de druk indien nodig aan als de opening van de naaldpunt iets groter wordt om ervoor te zorgen dat de grootte van de druppel klein blijft.
   3. Injecteer ~ 40-50 eieren met één naald.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het filtreerpapier te allen tijde vochtig blijft. Houd voldoende tegendruk op de naald om deze vrij te houden. Een naald die niet kan worden ontstopt, moet worden vervangen door een nieuwe naald. Het plaatsen van embryo's, het inbrengen van naalden en injectie worden vergemakkelijkt met microscopen met coaxiale controles voor horizontale beweging van het stadium(figuur 9).
5. Nadat de injecties zijn voltooid, spoelt u de eieren af in een glazen container bekleed met filtreerpapier en gevuld met 50 ml gedeïoniseerd H₂O(figuur 10).
   OPMERKING: Embryo's beginnen 2 dagen na de injectie uit te komen en kunnen 3-5 dagen duren. Uitgekomen eerste instarlarven moeten onmiddellijk worden overgebracht (controleer 2 keer per dag) naar een schone container met water en voedsel.

Resultaten

Een representatief voorbeeld van de toepassing van het beschreven micro-injectieprotocol is te vinden in Carballar-Lejarazú et al⁵. De bedoeling hier was om een autonoom gene-drive systeem in te brengen in de kiembaan van een laboratoriumstam, G3, van An. gambiae. Het systeem is ontworpen om zich te richten op de kardinaal ortholog locus (Agcd) op het derde chromosoom in deze soort, dat codeert voor een heemperoxidase dat de omzetting van 3-hydroxykynurenine naar xanthom...

Discussie

Met de toegenomen beschikbaarheid van nauwkeurige en flexibele genetische manipulatietechnologieën zoals CRISPR/Cas9 kunnen transgene organismen op een eenvoudigere en stabielere manier worden ontwikkeld dan voorheen mogelijk was. Deze tools hebben onderzoekers in staat gesteld om transgene stammen van muggenvectoren te creëren die zeer dicht bij het bereiken van de gewenste eigenschappen van refractie voor pathogenen (populatiemodificatie) of erfelijke steriliteit (populatieonderdrukking) liggen. Om echter de meest veil...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Netjes en recht gesneden in 2x1 cm stuk
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Enden af
De-geïoniseerd of dubbel gedistilleerd water (ddH20)	Mili-Q		In een wasfles
Dissectiemicroscoop	Leica	Leica MZ12	Voor embryo-uitlijning
Pincet			Nr. 5 maat
Glazen container	Pyrex	Nr. 3140	125 x 65
Glijplaatje	Fisher Brand	Nr. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Modelnr. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex tandheelkundig film	Crosstex International	Nr. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipet	Rainin		20 µL
Micropipet puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipet puller
Microscoop	Leica	DM 1000 LED of M165 FC	Voor micro-injectie
Minimum vezel filterpapier	Fisher Brand	Nr. 05-714-4	Chromatografiepapier, Dik
Muggen	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, gepaarde volwassen vrouwtjes, 4-5 dagen na uitkomst bloed gevoed
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon gaas
Verfkwast	Blick	Nr. 05831-7040	Fijn, maat 4/0
Petrischaal			Kunststof, (60x15 mm, 90x15 mm)
Natriumacetaat			3M
Kwartsglas capillairen	Sutter Instrument	Nr. QF100-70-10	Met filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm lengte
Water PCR kwaliteit	Roche	Nr. 03315843001