Optische sectie en visualisatie van de tussenwervelschijf van embryonale ontwikkeling tot degeneratie

Summary

We presenteren een methode om ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van de tussenwervelschijf te onderzoeken met behulp van een optische sectioningmethode.

Abstract

Intervertebral disc (IVD) degeneratie is een belangrijke oorzaak van lage rugpijn en het brengt een hoge mate van stoornis met zich mee voor de getroffen personen. Om schijfdegeneratie te decoderen en regeneratieve benaderingen te kunnen ontwikkelen, is een grondig begrip van de cellulaire biologie van de IVD essentieel. Een aspect van deze biologie dat nog steeds onbeantwoord blijft, is de vraag hoe cellen ruimtelijk zijn gerangschikt in een fysiologische toestand en tijdens degeneratie. De biologische eigenschappen van de IVD en de beschikbaarheid ervan maken dit weefsel moeilijk te analyseren. De huidige studie onderzoekt de ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadium degeneratie. Een optische sectioningmethode (Apotome) wordt toegepast om kleuringsanalyses met hoge resolutie uit te voeren met behulp van runderembryonaal weefsel als diermodel en menselijk schijfweefsel verkregen van patiënten die een wervelkolomoperatie ondergaan. Van een zeer hoge chondrocytendichtheid in de vroege embryonale runderschijf neemt het aantal cellen af tijdens de dracht, groei en rijping. In menselijke schijven ging een toename van de cellulaire dichtheid gepaard met de progressie van weefseldegeneratie. Zoals al was aangetoond in gewrichtskraakbeen, vertegenwoordigt clustervorming een kenmerkend kenmerk van geavanceerde schijfdegeneratie.

Introduction

De tussenwervelschijf (IVD) is een op kraakbeen gebaseerde structuur die biochemisch en met betrekking tot cellulaire architectuur op het eerste gezicht in veel opzichten lijkt op het gewrichtskraakbeen¹. Inderdaad, zowel IVD-degeneratie als artrose (OA) van gewrichtskraakbeen worden gekenmerkt door gewrichtsruimtevernauwing als gevolg van kraakbeenslijtage, subchondrale cyste en osteofytvorming en subchondrale sclerose^2,3. Ondanks deze schijnbare overeenkomsten verschillen de architectuur en de functionele rol van beide weefsels. Terwijl de matrix van gewrichtskraakbeen voornamelijk wordt gevormd door een arcadevormend collageen type II-netwerk, bestaat de IVD uit drie verschillende soorten weefsel: de collageentype II-rijke nucleus pulposus in het midden neemt axiale belastingen op en brengt ze over naar een omvattende ring van dicht opeengepakte cirkelvormige collageen type I-vezels die anulus fibrosus wordt genoemd. Hun functie is om de vertaalde axiale drukken te absorberen die worden ontvangen door de proteoglycaan- en waterrijke kern met hun treklengte vezelsterkte. Aan de boven- en onderkant van elke kern en anulus vormt een hyalien kraakbeenachtige endplate de kruising met de aangrenzende wervels⁴ (figuur 1).

In gewrichtskraakbeen zijn vier verschillende ruimtelijke chondrocytenpatronen te vinden: paren, snaren, dubbele snaren, kleine respectievelijk grote clusters^5,6,7 ( figuur2). Veranderingen in dit patroon zijn geassocieerd met het begin en de progressie van^{artrose 8,9}. Ruimtelijke chondrocytenorganisatie is ook indicatief voor een directe functionele eigenschap van kraakbeen, namelijk de stijfheid ervan, wat de functionele relevantie van deze beeldgebaseerde beoordelingsbenadering^10,11onderstreept. Deze patronen kunnen bovendien worden geïdentificeerd met reeds bestaande klinisch beschikbare technologie¹². Vanwege de overeenkomsten tussen de IVD en gewrichtskraakbeen, kan worden verondersteld dat karakteristieke chondrocytenpatronen ook aanwezig zijn in de IVD. Clustervorming is een fenomeen dat ook wordt waargenomen in de gedegenereerde IVD^13,14.

Bij het analyseren van ruimtelijke cellulaire organisatie in de IVD, is het noodzakelijk om verschillende technische problemen te overwinnen die niet aanwezig zijn bij het onderzoeken van gewrichtskraakbeen:

Ten eerste is de verwerking van het weefsel zelf veel uitdagender dan bij het homogene hyaliene kraakbeen dat grotendeels bestaat uit collageen type II. De belangrijkste vezelcomponent van de IVD is collageen type I, waardoor het veel moeilijker wordt om dunne histologische secties te genereren. Terwijl in het hyaliene gewrichtskraakbeen zelfs dikke delen gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd vanwege de "glasachtige" aard van het weefsel, is het collageentype I-netwerk van de IVD optisch zeer ondoordringbaar. Om deze reden is een sterk achtergrondgeluid een veel voorkomend probleem in de histologie van de IVD. Een snelle en goedkope manier om dit optisch dichte weefsel binnen te dringen is het gebruik van een optisch sectioning apparaat, bijvoorbeeld door middel van een Apotome. In zo'n Apotome wordt een raster ingevoegd in het verlichtingspad van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Voor het rooster is een vlak-parallelle glasplaat geplaatst. Deze kantelt heen en weer waardoor het raster in het beeld in drie verschillende posities wordt geprojecteerd. Voor elke z-positie worden drie raw-afbeeldingen met het geprojecteerde raster gemaakt en over elkaar heen gelegd. Door middel van speciale software kan het onscherpe licht worden uitgerekend. Het onderliggende principe is dat, als het raster zichtbaar is, die informatie in focus is, zo niet wordt het als onscherp beschouwd. Met deze techniek kunnen goed gefocuste en hoge resolutie beelden in een redelijke hoeveelheid tijd worden verkregen.

Ten tweede is het weefsel moeilijk te verkrijgen van menselijke donoren. Bij het uitvoeren van totale knievervanging kan het volledige oppervlak van het gewricht worden verkregen voor verdere analyse tijdens de operatie. Hoewel artrose van een diarthrodiaal gewricht ook een ziekte van het hele gewricht is, zijn er toch sterke focale verschillen in de kwaliteit van het kraakbeen waarbij meestal sommige delen van het gewricht nog intact zijn, bijvoorbeeld door verminderde belasting in dat gebied. Deze situatie is anders in de IVD, waar een operatie meestal alleen wordt uitgevoerd wanneer de schijf wereldwijd is vernietigd. Bij het verkrijgen van weefsel van menselijke donoren uit de operatiekamer, is het weefsel ook sterk gefragmenteerd en is het noodzakelijk om het weefsel correct toe te wijzen aan een van de drie kraakbeentypen van de IVD voordat verdere analyses worden uitgevoerd. Om meer gedetailleerde analyses van ook grotere weefselsecties mogelijk te maken en om de embryonale ontwikkeling van de IVD te onderzoeken, is de keuze van een diermodelorganisme daarom noodzakelijk.

Bij het kiezen van een dergelijk modelorganisme is het belangrijk om een systeem te hebben dat vergelijkbaar is met de menselijke schijf met betrekking tot zijn anatomie en afmetingen, zijn mechanische belasting, de huidige celpopulatie en zijn weefselsamenstelling. Voor het doel van de gepresenteerde techniek hier stellen we het gebruik van bovien lumbaal schijfweefsel voor: een kritieke eigenschap van de menselijke schijf die resulteert in zijn lage regeneratieve potentieel is het verlies van notochordale cellen tijdens rijping in de kern. In tal van modelorganismen kunnen notochordale cellen echter hun hele leven lang worden gedetecteerd. De meeste van de weinige dieren die hun notochordale cellen verliezen, zoals schapen, geiten of chondrodystrofehonden, hebben een IVD die veel kleiner is dan menselijke schijven. Alleen lumbale runderschijven aanwezig met een vergelijkbare sagittale schijfdiameter als die van menselijke IVD's¹⁵.

Een belangrijke factor die leidt tot vroege schijfdegeneratie is overmatige mechanische belasting. De intradiscale druk van een staande koe in de lumbale wervelkolom is ongeveer 0,8 MPa met de wervelkolom horizontaal uitgelijnd. Verrassend genoeg zijn deze drukken vergelijkbaar met de lumbale intradiscale drukken gerapporteerd voor de rechtopstaande menselijke wervelkolom (0,5 MPa)^15,16. Ook de hoeveelheid water en proteoglycanen in runderschijven is vergelijkbaar met die van de IVD van jonge mensen¹⁷. Daarom, hoewel het werkelijke bewegingspatroon van de bewegingssegmenten bij viervoetige dieren kan verschillen van de tweevoetige mens, staat de koe met betrekking tot de totale belasting en schijfkenmerken veel dichter bij de menselijke biologie dan andere gevestigde diermodellen voor de IVD zoals schapen en honden.

In dit protocol presenteren we een techniek hoe veranderingen in de IVD kunnen worden geanalyseerd vanuit het oogpunt van ruimtelijke chondrocytenorganisatie van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadiumdegeneratie.

Protocol

Voor de analyse van de embryonale ontwikkeling en rijping werden runderschijven gebruikt. Om de degeneratie van de IVD te evalueren, werden menselijke monsters geanalyseerd.

Humaan IVD-weefsel werd verkregen van patiënten die een operatie ondergingen voor lumbale schijfdegeneratie, schijfverzakking of ruggenmergtrauma op de afdeling Orthopedische Chirurgie, het Universitair Ziekenhuis van Tübingen en het BG Traumacentrum Tübingen. Volledige goedkeuring van de ethische commissie werd verkregen voor de start van de studie (projectnummer 244/2013BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten vóór deelname. De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.

Runderweefsel is verkregen van het Beierse staatsbureau voor gezondheid en voedselveiligheid/Oberschleißheim en van een destructiebedrijf in Warthausen (Duitsland). De goedkeuring van lokale en veterinaire autoriteiten werd ontvangen voor weefsel van dode dieren.

1. Monsteroogst

1. Humaan IVD-weefsel: Plaats intraoperatief verkregen IVD-monsters onmiddellijk in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2% (v/v) penicilline-streptomycine en 1,2% (v/v) amfotericine B. Bewaren bij 4 °C tot verdere verwerking. Verwerk het weefsel binnen 48 uur. U kunt de weefsels ook enkele weken bewaren bij -20 °C.
2. Runder IVD-weefsel: Zorg ervoor dat het weefsel van de dieren binnen 24 uur na de dood wordt geoogst.
   Reseceer de runderschijven met de omringende wervels van de dode dieren en-bloc. Transporteer het ingevroren weefsel op droogijs en bewaar bij -20 °C tot verdere verwerking.
   OPMERKING: Als alleen fluorescentieanalyses zijn bedoeld en er geen verdere biochemische kwantificeringsmethoden zoals ELISA of PCR zijn gepland, voert u de weefselfixatie uit zoals hieronder wordt uitgelegd. Dit maakt het mogelijk om het weefsel langer in opslag te houden voordat het moet worden verwerkt. Om verslechtering van de weefselmatrix te voorkomen, voert u fixatie uit binnen 48 uur na de oogst, tenzij het weefsel direct wordt ingevroren.

2. Monstervoorbereiding

1. Ontdooi het bevroren weefsel bij kamertemperatuur. Verwerk het weefsel zodra er geen ijskristallen meer voelbaar zijn bij digitale zachte compressie van het weefsel.
   OPMERKING: Voer de bereiding van het weefsel in DMEM uit in een petrischaaltje.
2. Identificeer de oorsprong van het menselijke IVD-weefsel (anulus fibrosus, tussenzone, nucleus pulposus of kraakbeenachtige endplate) op basis van macroscopische eigenschappen zoals collageendichtheid en oriëntatie.
3. Neem het bewegingssegment bestaande uit de runder IVD-schijf met zijn twee aangrenzende wervels en ontleed de schijf als geheel van het subchondrale bot met behulp van een chirurgisch mes (bladnummer 15).
   1. Gebruik twee anatomische tangen om de schijf om te draaien om gebieden te bereiken die meer gecentreerd zijn. Voer de dissectie uit. Zorg ervoor dat u de nucleus pulposus als laatste reseceert, omdat deze veel dunner is dan de anulus, gevoelig is voor scheuren en deze niet gemakkelijk op een gedefinieerde manier loskomt.
   2. Identificeer de verschillende gebieden van het kraakbeen.
   3. Knip het interessegebied uit de hele schijf met behulp van een chirurgisch mes (mes nummer 20 of 22). U kunt ook een cryomaanblad gebruiken.
      OPMERKING: Omdat runderschijven en-bloc komen als onderdeel van de wervelkolom, kunnen de schijven in-toto worden bereid. Dit maakt een correcte identificatie van de verschillende soorten kraakbeen veel gemakkelijker. Bij het ontleden van de schijf op de hierboven beschreven manier blijft de kraakbeenachtige endplaat op de wervels. Indien dit gebied moet worden onderzocht, kan het het best van het onderliggende bot worden verwijderd met een beitel die in een licht gebogen tangentiële richting werkt.
4. In het geval dat embryo's een kroon-romplengte hebben van kleiner dan 20 cm, zorg er dan voor dat de embryo's in toto worden verwerkt om de weefselarchitectuur van de IVD te behouden. Voer in deze gevallen geen dissectie van de wervels uit.
5. Zodra de schijf in-toto is gereseceerd, identificeert u de verschillende delen van het kraakbeen.
   1. Voer de ontkalking uit in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (20% (w/ v); pH = 7,4) bij kamertemperatuur. Kies het volume afhankelijk van de steekproefgrootte - het hele weefsel moet goed bedekt zijn met EDTA.
   2. Vervang de ontkalkingsoplossing dagelijks, wat tot 5 dagen kan duren, afhankelijk van de grootte van het weefsel.
   3. Controleer of de ontkalking succesvol is met een naald van 20 gauge die zonder noemenswaardige weerstand de wervels binnendringt.
      OPMERKING: De dagelijkse verandering van de ontkalkingsoplossing is belangrijk om te voorkomen dat het chelaatbindmiddel EDTA verzadigd raakt om de reactie-effectiviteit te behouden. Het voorkomt ook bacteriële kolonisatie.

3. Indeling van de leeftijd, integriteit en degeneratie van de steekproef

1. Deel het menselijke schijfweefsel in een van de vijf volgende categorieën in met behulp van klinische informatie en röntgen- en magnetische resonantiebeeldvorming¹⁸ (figuur 3).
   OPMERKING: Categorie I: Om te dienen als bijna-gezond monster gebruik anulus zonder enig radiologisch teken van IVD-degeneratie afgeleid van acuut spinale trauma.
   Categorie II: Om een situatie van acute ontsteking met beginnende degeneratie te illustreren, gebruikt u weefsel uit de tussenzone van patiënten met klinische symptomen met een duur van minder dan 4 weken.
   Categorie III: Om een situatie te beschrijven waarin de ontstekingsreactie al de tijd had gehad om het weefsel te beïnvloeden en cellen weefsel afnemen van patiënten die werden geopereerd voor een nucleaire verzakking, maar met een symptoomduur van meer dan 4 weken.
   Categorie IV: Selecteer voor matige schijfdegeneratie anulus verkregen uit chirurgie met interlichaamsfusie voor degeneratieve schijfziekte met een Pfirrmann-score van 3 of 4 in magnetische resonantiebeeldvorming¹⁹.
   Categorie V: Voor het eindstadium degeneratieproces anulus verkregen uit chirurgie met interbody fusion voor degeneratieve schijfziekte met een Pfirrmann score van 5.
2. Indeling van het weefsel van runderen op basis van het ontwikkelingsstadium/de leeftijd van het dier in een van de acht categorieën, zoals weergegeven in tabel 1.
   1. Bereken de drachtleeftijd op de kruin-romplengte van de embryo's op basis van de door Keller voorgestelde formule:
      Draagtijd in maanden =
      OPMERKING: Dieren in de eerste 4 weken van de dracht aanwezig met een kroon-romplengte van 0,8-2,2 cm²⁰.

4. Weefselfixatie

1. Fixeer de monsters in 10x het volume van het monster van 4% (w/v) formaldehyde-oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende de nacht bij 4 °C.
   OPMERKING: De formaldehyde-oplossing dringt weefsel binnen met een snelheid van ongeveer 1 mm / uur van elke richting. Voor zeer kleine of zeer grote monsters kan een aanpassing van de belichtingstijd noodzakelijk zijn.
2. Bewaar het weefsel in PBS bij 4 °C tot verdere verwerking.

5. Histologische sectie

1. Sluit de monsters in in wateroplosbaar inbeddingsmedium op de cryotome-knop.
   1. Plaats het weefsel op de knop zodat er een axiale vlak wordt gegenereerd of een vlak dat het collageen type I lamellen loodrecht snijdt (bijvoorbeeld een mediaan sagittale sectievlak).
      OPMERKING: Het weefsel moet volledig worden bedekt door het inbeddingsmedium.
2. Sectie van het ingebedde weefsel met een dikte van 70 μm in menselijke monsters en 40 μm in rundermonsters met behulp van een standaard cryotoom.
   OPMERKING: Het verschil in sectiedikte is te wijten aan het verschil in weefselintegriteit tussen de intacte runderschijf en het sterk gedegenereerde menselijke weefsel.
3. Verzamel de secties op een glasplaat.
   1. Omcirkel de weefselsecties met een hydrofobe pen.
   2. Spoel de secties 3 keer af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om het in water oplosbare inbeddingsmedium te verwijderen.

6. Fluorescentiekleuring

1. Voeg 60 μL van 1% (v/v) DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) en 1% (v/v) Actin Tracking-kleuring (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) toe aan PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Het hier beschreven kleuringsprotocol is om de kern te visualiseren met behulp van DAPI nucleaire kleuring (blauw) en het cytoplasma met behulp van Actin Tracking Stain (rood). De IVD heeft een sterke autofluorescentie door de collageenvezels in het groene kanaal. De hoeveelheid vloeistof die aan de secties in dit protocol wordt toegevoegd, is bedoeld voor secties met een afmeting van ongeveer 5 mm x 5 mm. Voor grotere secties moet dit bedrag dienovereenkomstig worden verhoogd. Voer alle werken uit in kamers zonder directe blootstelling aan zonlicht en met gedimde lichten om bleken van de kleurstof te voorkomen.
2. Verwijder de kleurvloeistof met een pipet en was drie keer met telkens 60 μL PBS.
3. Voeg een geschikt montagemedium toe en bedek de secties met een afdekslip.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn ingesloten bij het toevoegen van de afdekslip. Dit kun je het beste doen door contact te maken met de slip met de glijbaan op één velg en vervolgens de slip langzaam naar beneden te laten komen.

7. Microscopische beeldvorming en verwerking

1. Plaats een dia met een gekleurd gedeelte op de monsterhouder van de microscoop.
   OPMERKING: Vanwege het dichte collageen type I-netwerk van de IVD, maakt het verstrooide licht het weefsel moeilijk te visualiseren met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. Een manier om dit probleem aan te pakken, is door optische secties uit te voeren met behulp van gestructureerde verlichting. Dit maakt het ook mogelijk om een driedimensionale projectie van het hele monster in beide kanalen (blauw en rood) weer te geven. Dit kan het beste worden gedaan met behulp van de gestructureerde verlichtingsinstelling en de Mozaïek-modus met een 10x vergrotingsobjectieve lens om een overzicht van het monster te krijgen, evenals 3D-reconstructies van individuele patronen.
2. Start het gestructureerde verlichtingsapparaat.
   1. Voer beeldvorming met één gezichtsveld uit met een geschikte fluorescentiemicroscoop, fluorescentiefilters en voldoende verlichting.
      OPMERKING: Pas de belichtingstijd aan voor alle gebruikte filters om de beeldacquisitie te standaardiseren. Om een nauwkeurige weergave van het monster te krijgen bij een afbeelding met een hogere resolutie, zijn de secties met een hogere vergroting (bijvoorbeeld 20x objectief).
   2. Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
3. Om de sectie als geheel te visualiseren, gebruikt u de mozaïekbeeldvormingstechniek
   1. Open de acquisitie-instellingen (druk op 6D- Acquisitie) in het werkbalkpaneel.
   2. Pas de mozaïekinstellingen aan (in MosaiX Register)en definieer het aantal kolommen en rijen met gezichtsveldafbeeldingen die later worden samengevoegd tot één overzichtsafbeelding.
   3. Druk op Instellen en pas de scherpstelcorrectie van afzonderlijke tegels aan.
      OPMERKING: Het is bijna onmogelijk voor een groot weefselgedeelte om het hele weefseloppervlak in één focusvlak te hebben. Beeldtegels op verschillende brandpuntsniveaus kunnen worden gemaakt door 'MosaiX Acquisition'.
   4. Als u de verwerving van de afbeeldingstegels wilt starten, drukt u op Start.
   5. Naai de afgebeelde tegels met behulp van de stikfunctie(stikknop) met 20% overlap die in de software is opgenomen.
   6. Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
4. Om de ruimtelijke chondrocytenorganisatie te analyseren, gebruikt u de 3D-functie die in de software is opgenomen.
   1. Pas de z-stack-instellingen aan. Definieer de scanparameters: definieer de start- en stopposities in de z-as en de segmentafstand door de Knop Start/Stop te activeren.
      OPMERKING: De software berekent automatisch het aantal segmenten.
   2. Als u wilt beginnen met het verkrijgen van de z-stacks van de afbeelding, drukt u op Start.
   3. Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
5. Exporteer de afbeeldingen met een bestandsindeling die compatibel is met de beeldverwerkingssoftware.
   OPMERKING: Exporteer de 3D-reconstructies als afzonderlijke afbeeldingen en/of als een interactief 3D-model of in een videoformaat.

8. Cellulaire patroonidentificatie en dichtheidsbeoordeling

1. Open de geëxporteerde mozaïekafbeeldingen van het hele weefselgedeelte in een geschikt beeldverwerkingsprogramma.
2. Definieer de gebieden die worden onderworpen aan celdichtheidsbeoordeling door gebieden van belang van 500 μm x 500 μm in de afbeeldingen te definiëren.
   OPMERKING: Alle tegels die geen adequate beeldkwaliteit hebben, zijn uitgesloten van analyse.
3. Identificeer individuele cellulaire patronen.
   OPMERKING: Afzonderlijke cellen worden gedefinieerd als individuele cellen - volledig ingekapseld in de aangrenzende matrix. Paren worden gedefinieerd als twee aangrenzende cellen in de nabijheid (<25 μm) waarbij de cellen met elkaar verbonden zijn via hun matrixen (zie figuur 2). Snaarformaties zijn ten minste drie chondrocyten die in lijn zijn uitgelijnd (vanaf het midden van de kernen <25 μm). Deze cellen zijn omgeven door een intacte matrix en matrixinterconnecties zijn te zien tussen elke cel. Clusters vertegenwoordigen meerdere cellen die zich in de directe nabijheid van elkaar bevinden (<25 μm) en zijn ingekapseld in een grote lacune zonder matrix.
4. Gebruik een plug-in voor het aantal cellen voor de kwantitatieve analyse van de cellulaire patronen.
   OPMERKING: De cytoplasmakleuring vertegenwoordigt een verificatiemethode om de verschillende ruimtelijke patronen te identificeren.
5. Bereken de celdichtheid door de getelde cellen te delen door de grootte van het gekozen interessegebied.

Results

Met behulp van mozaïekbeelden is de architectuur van de IVD met zijn dichte collageenvezelnetwerk in de anulus en de zachtere kern duidelijk te herkennen(figuur 4). Een continue afname van de cellulaire dichtheid kan worden waargenomen tijdens de embryonale ontwikkeling(figuur 5). Terwijl in de vroege stadia van IVD-ontwikkeling een celdichtheid van 11.435 cellen/mm² in de bovine anulus fibrosus en 17.426 cellen/mm² in de runderkern pulposus kan worden gevonden,...

Discussion

Met behulp van fluorescentiemicroscopie aangevuld met mozaïekbeeldvorming en optische sectioning, evalueerden we de ruimtelijke rangschikking van chondrocyten in de anulus van de lumbale IVD gedurende ontwikkeling, rijping en degeneratie. Hoewel degeneratief weefsel kon worden geoogst van patiënten die een wervelkolomoperatie kregen voor schijfdegeneratie, vereiste analyse van de embryonale periode en rijpingsfase het gebruik van een modelorganisme (rund). Hoge cellulaire dichtheden werden opgemerkt in de anulus tijdens ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA,  Duitsland	A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Duitsland	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Duitsland	462000115
AxioVision Rel. 4.8 met Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Duitsland
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific, VS	A57249
Cryostat	Leica Biosystems, VS	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, VS	D1306
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Duitsland	41966052
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Sigma-Aldrich, VS	60004
Fluorescentie Microscoop - Axio Observer Z1 met Axio Cam MR3 en Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Duitsland	3834000604
Formaldehyde	Merck KGaA,  Duitsland	104002
Image J 1.53a, met Cell counter plugin	National Institute of Health (NIH), VS
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, VS	A12380
Microscopische dekglasjes	R. Langenbrinck, Duitsland	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Services  GmbH, Duitsland	N71310
Penicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich, VS	P4333
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich,VS	P5119
Scalpel	pf medical AG, Duitsland	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Nederland	SA6255012