Monstervoorbereiding tot bio-informatica analyse van DNA-methylatie: associatiestrategie voor obesitas en gerelateerde eigenschappenstudies

Samenvatting

De huidige studie beschrijft de workflow om DNA-methylatiegegevens te beheren die zijn verkregen door microarray-technologieën. Het protocol demonstreert stappen van monstervoorbereiding tot data-analyse. Alle procedures worden in detail beschreven en de video toont de belangrijke stappen.

Samenvatting

Obesitas is direct verbonden met levensstijl en is in verband gebracht met DNA-methylatieveranderingen die veranderingen in de adipogenesis en lipideopslagprocessen kunnen veroorzaken die bijdragen aan de ontwikkeling van de ziekte. We demonstreren een compleet protocol van selectie tot epigenetische data-analyse van patiënten met en zonder obesitas. Alle stappen uit het protocol zijn getest en gevalideerd in een pilotstudie. 32 vrouwen namen deel aan de studie, waarin 15 personen werden geclassificeerd met obesitas volgens Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg / ^m2); en 17 personen werden geclassificeerd zonder obesitas volgens BMI (22,6 ± 1,8 kg / ^m2). In de groep met obesitas werden 564 CpG-locaties gerelateerd aan vetmassa geïdentificeerd door lineaire regressieanalyse. De CpG-locaties bevonden zich in de promotorregio's. De differentiële analyse vond 470 CLB's gehypothineerde en 94 gehypermethyleerde plaatsen bij personen met obesitas. De meest gehypothineerde verrijkte routes waren aanwezig in de RUNX, WNT-signalering en respons op hypoxie. De gehypermethyleerde routes waren gerelateerd aan insulinesecretie, glucagonsignalering en ^Ca2+. We concluderen dat het protocol effectief DNA-methylatiepatronen en eigenschapsgerelateerde DNA-methylatie identificeerde. Deze patronen kunnen worden geassocieerd met veranderde genexpressie, die adipogenesis en lipidenopslag beïnvloedt. Onze resultaten bevestigden dat een obesogene levensstijl epigenetische veranderingen in het menselijk DNA zou kunnen bevorderen.

Inleiding

Grootschalige omics-technologieën worden steeds vaker gebruikt in studies naar chronische ziekten. Een interessant kenmerk van deze methoden is de beschikbaarheid van een grote hoeveelheid gegenereerde gegevens voor de wetenschappelijke gemeenschap. Daarom is er een vraag ontstaan om de protocollen te standaardiseren om technische vergelijking tussen studies mogelijk te maken. De huidige studie suggereert de standaardisatie van een protocol om DNA-methylatiegegevens te verkrijgen en te analyseren, met behulp van een pilotstudie als een toegepast voorbeeld.

Negatief energieverbruik overheerst in moderne menselijke levensstijlen, wat leidt tot een overmatige accumulatie van vetweefsel en bijgevolg de ontwikkeling van obesitas¹. Veel factoren hebben de obesitascijfers verhoogd, zoals sedentarisme, calorierijke diëten en stressvolle routines. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schatte dat 1,9 miljard volwassenen in 2016 zwaarlijvig waren, wat betekent dat meer dan 20% van de wereldbevolking meer dan 30 kg / ^{m2 BMI2} heeft. Uit de meest recente update van 2018 bleek dat de prevalentie van obesitas in de Verenigde Staten van Amerika (VS) hoger was dan 42%³.

Epigenetica is de structurele aanpassing van chromosomale regio's om veranderde activiteitstoestanden te registreren, te signaleren of te ^bestendigen4. DNA-methylatie is een omkeerbare chemische verandering in de cytosine-guanosine dinucleotiden sites (CpG-sites), het vormen van 5-methylcytosine-pG (5mCpG). Het kan genexpressie moduleren door de toegang van de transcriptiemachinerie tot het DNA te reguleren5,6,7,8. In deze context is het essentieel om te begrijpen welke CpG-sites geassocieerd zijn met obesitas-gerelateerde ^kenmerken9. Veel factoren kunnen site-specifieke DNA-methylatie ondersteunen of voorkomen. Noodzakelijke enzymen voor dit proces, zoals DNA-methyltransferasen10 (DNTMs) en ten-eleven translocaties (TETs), kunnen DNA-methylatie of -demethylering bevorderen onder blootstelling aan het ^milieu11.

Gezien de groeiende belangstelling voor DNA-methylatiestudies in de afgelopen jaren, is het kiezen van de meest geschikte analysestrategie om elke vraag nauwkeurig te beantwoorden een essentiële zorg van onderzoekers12,13,14. De 450K DNA-methylatiearray is de meest populaire methode, gebruikt in meer dan 360 ^{publicaties14} voor het bepalen van het DNA-methylatieprofiel. Het kan de methylatie bepalen van maximaal 485.000 CLB's in 99% van de bekende ^genen15. Deze array is echter stopgezet en vervangen door de EPIC, die 850.000 CpG-sites beslaat. Het huidige protocol kan worden toegepast voor zowel 450K als EPIC16,17,18.

Het protocol wordt stap voor stap gepresenteerd in figuur 1 en omvat de volgende stappen: populatieselectie, bemonstering, experimentvoorbereiding, DNA-methylatiepijplijn en bioinformatica-analyse. Een pilotstudie uitgevoerd in ons laboratorium wordt hier gedemonstreerd om de stappen van het voorgestelde protocol te illustreren.

Figuur 1: Schema van het gepresenteerde protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De ethische commissie van ribeirão Preto Medical School University Hospital van de Universiteit van São Paulo (HCRP-USP) keurde de studie goed (CAAE:14275319.7.0000.5440). De deelnemers ondertekenden het toestemmingsformulier en alle procedures werden uitgevoerd na de Verklaring van Helsinki.

1. Populatie en steekproef

1. Rekruteer deelnemers met een BMI >30 kg / ^m2 voor de studie. Voor de huidige studie werden 32 vrouwen uit een bijmengpopulatie19 tussen 18 en 60 jaar oud gerekruteerd.
   OPMERKING: In de HCRP-USP werden hogere percentages obesitas waargenomen, voornamelijk bij ^vrouwen20. Deelnemers met obesitas, met een BMI ≥30 kg/^m2 (n = 15), werden gerekruteerd uit de polikliniek Metabole Ziekten in HCRP-USP. De deelnemers zonder obesitas, met een BMI tussen 18,5 kg/^m2 en 24,9 kg/^m2 (n = 17), werden gerekruteerd uit andere klinieken en hadden geen ernstige ziekten; de klinische gegevens zijn weergegeven in tabel 1.
2. Sluit vrouwen uit die zwanger zijn, moeders die borstvoeding geven, rokers en alcohol consumeren.

2. Antropometrie en lichaamssamenstelling

1. Meet het gewicht van de deelnemers met behulp van een digitale antropometrische weegschaal van 200 kg. Zorg ervoor dat u schoenen en overtollige kleding verwijdert.
2. Beoordeel de hoogte met behulp van een stadiometer met een schaalverdeling van 0,5 cm. Deelnemers kregen de opdracht om op blote voeten, voeten bij elkaar en armen naast elkaar te ^staan21.
3. Verzamel de vetmassa (FM) informatie met behulp van een elektrische bio-impedantie. Na 12 uur vasten, beoordelen met een lege urineblaas. Plaats de deelnemers in rugligging, met de benen uit elkaar en de armen parallel zonder het lichaam aan te raken. Instrueer de deelnemers om alle metalen accessoires te ^{verwijderen22}.
4. Verkrijg de tailleomtrek (WC) met behulp van een onuitrekbaar meetlint met een schaalverdeling van 0,1 mm. De tape werd horizontaal om de middelste taille geplaatst, net boven de heupbeenderen. De meting vond plaats net na een uitademing. Volgens de Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) is de WC-cut-off voor vrouwen 88 ^cm23.

Tabel 1: Bevolkingskenmerken. Alle variabelen waren parametrisch (p > 0,05, Shapiro Wilk) en verschillen werden geëvalueerd met behulp van een onafhankelijke t-test, waarbij p < 0,05 als significant werd beschouwd. *p < 0,0001. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Verzameling van biologisch materiaal

1. Verzamel perifeer bloed na 12 uur vasten, zoals eerder ^beschreven24.
2. Verzamel 4 ml van de volbloedmonsters in verzamelbuizen met antistollingsmiddel (bijv. EDTA) en bewaar ze op ijs voor transport.

4. DNA-extractie

1. Centrifugeer elke buis met het bloed bij 2.000 x g gedurende 10 minuten. Verzamel ongeveer 300 μL van de buffy vacht (witte interfase).
2. Extraheer DNA uit het perifere bloed met behulp van een in de handel verkrijgbaar instrument (zie Tabel met materialen), zoals eerder ^beschreven25. Eluteer het DNA in 480 μL ultrapuur _H2O.
3. Beoordeel de DNA-concentratie en -kwaliteit met behulp van een fluorometer. De integriteit werd geëvalueerd met behulp van een 1% agarose gel ^analyse25. Bewaren in een vriezer bij -80 °C.

5. Voorbereiding vóór methyleringsanalyse

1. Zorg ervoor dat de monsters de minimale DNA-concentratie hebben (500 ng is de ideale eerste invoer om te beginnen), maar verdunning kan variëren tussen monsters in deze stap.
2. Sommige reagentia zijn niet inbegrepen in de microarray ^kit26, dus koop ze ^apart27.
3. Controleer of de kit alle reagentia bevat die tijdens de procedure zijn gebruikt; ze zijn onvervangbaar. Controleer de vervaldatum van alle reagentia. Zorg ervoor dat er ook andere reagentia en oplossingen beschikbaar zijn die niet in de kit zijn geleverd (95% formamide/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, absolute ethanol, 2-propanol).
   LET OP: Formamide is een vluchtig reagens; de kwaliteit van de resultaten kan worden verbeterd als het product vers is. De integriteit en kwaliteit van formamide en absolute ethanol worden als kritiek beschouwd omdat ze het door de fabrikant voorgestelde kleuringsproces kunnen beïnvloeden. De gekozen alcoholen moeten ultrapuurproducten zijn die specifiek zijn voor moleculair biologische analyse.
4. Zodra de microarray-kit is verkregen, downloadt u de Chips Decode Maps (DMAP's). Deze bestanden zijn 24-48 uur nadat de kit is verzonden beschikbaar op de website van de fabrikant en zijn uitgesloten op de ^{vervaldatum28}. Voer de onderstaande stappen uit om de genoemde bestanden te downloaden.
   1. Zorg ervoor dat er een computer met internet beschikbaar is. Voer de download uit met behulp van de Software Decode File Client.
   2. Voordat u het programma installeert, moet u ervoor zorgen dat de computer uitgaande en inkomende toegang heeft die door de instelling is verleend; de decodeerbestandsclient heeft geen beveiligingsbeperkingen.
   3. Meld u aan bij de Decode File Client-software met de optie Access by BeadChip. Deze login wordt uitgevoerd met behulp van MyIllumina gebruikers-ID en wachtwoord. Registratie op deze pagina is ^vereist28.
   4. Nadat u zich hebt aangemeld bij de Decode File Client, voert u de onderstaande informatie in hun respectieve velden in op de startpagina van de ^software28: Lijst met streepjescodes; Lijst van Box Ids; Inkoopordernummer (PO); en verkoopordernummer (vergeet niet de letters op te nemen die op de cijfers volgen).
   5. Selecteer de DMAP's die u wilt downloaden op basis van het streepjescodenummer in het aankoopvak en geef de bestemming op in het dialoogvenster om de DMAP's op te slaan.
   6. Klik op de knop om het downloaden te starten.
      OPMERKING: Zorg er aan het einde van de download voor dat de gedownloade mappen niet leeg zijn en sla de bestanden veilig op, omdat ze nodig zijn voor de laatste stap om de experimenten te converteren naar intensiteitsgegevensbestanden (IDAT-bestanden). Na de vervaldatum kan Illumina de DMAP-gegevens uit haar online database verwijderen.

6. DNA-methylatiepijplijn

OPMERKING: Het DNA-methylatie-experiment is verdeeld in 4 dagen (figuur 1). Volg de aanbevelingen en specificaties van de fabrikant om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.

1. Dag 1: Bisulfiet behandeling
   1. Begin met het denatureren van 500 ng genomisch DNA en voeg vervolgens de conversiereagentia toe. Volg de aanbevelingen van de bisulfiet- en microarraykits29 om deze stap uit te voeren.
   2. Behandel het gedenatureerde DNA met 130 μL bisulfietconversiereagens in de door de fabrikant opgegeven standaardconcentratie.
   3. Incubeer de buis in een thermocycler gedurende 16 cycli bij 95 °C gedurende 30 s en 50 °C gedurende 1 uur. Zet de thermocycler gedurende 10 minuten neer op 4 °C.
   4. Voer de wasstap uit door 100 μL van de wasbuffer toe te voegen en vervolgens gedurende 30 s op volle snelheid te centrifugeren. De concentratie wordt niet vermeld in de gebruikershandleiding en de fabrikant standaardiseert de volumes.
      OPMERKING: Dit reagens wordt bij de kit geleverd en hoeft niet te worden verdund of bereid.
2. Dag 2: Amplificatie - Methylatie Assay, Handmatig Protocol
   1. Verwarm de hybridisatieoven voor op 37 °C en laat de temperatuur in evenwicht brengen.
   2. Breng een barcodelabel aan op een microplaat van 0,8 ml.
   3. Ontdooi de versterkingsreagentia (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix en Multi-Sample Amp Master Mix) bij kamertemperatuur (deze reagentia worden bij de kit geleverd en hoeven niet te worden verdund of bereid). Voer vervolgens minstens 10x een zachte inversie uit totdat de volledige inhoud van de buizen is gemengd.
   4. Doseer 20 μL van de Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) in de putjes van de plaat.
   5. Breng 4 μL van het DNA-monster van de bisulfiet geconverteerde plaat over naar de overeenkomstige putjes op de 0,8 ml plaat. Noteer op dit punt de ID van het originele DNA-monster op het laboratoriumvolgformulier dat overeenkomt met de plaatputten.
   6. Doseer 4 μL van 0,1 N NaOH in elke put van de plaat met de Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) en het DNA-monster.
   7. Sluit de plaat af met een plastic afdichting.
   8. Vortex de plaat om de reagentia te mengen met de monsters bij 1.600 tpm gedurende 1 min. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de afdichting.
   9. Pipetteer 68 μL Random Primer Mix (RPM) in elke put van de plaat. Pipetteer 75 μL Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) in elke put van de plaat (zonder de vorige oplossing te verwijderen). Gebruik een nieuwe afdichting om de plaat te bedekken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de putten combineert met de plaat en deze correct oriënteert.
   10. Vortex de verzegelde plaat bij 1.600 rpm gedurende 1 min. Incubeer in de hybridisatieoven gedurende 20-24 uur bij 37 °C.
3. Dag 3: Hybridisatie - Methylatie Assay, Handmatig Protocol
   1. Verwarm het blok voor op 37 °C.
   2. Ontdooi de inhoud van de buis bij kamertemperatuur. Keer de Fragmentation Solution (FMS)-buizen voorzichtig en voorzichtig ten minste 10x om om de inhoud grondig te mengen.
   3. Verwijder de plaat voorzichtig uit de hybridisatieoven. Pulse-centrifugeer de plaat bij 280 x g.
   4. Verwijder nu de afdichting van de plaat. Voeg in elke put van de plaat die een monster bevat 50 μL Fragmentation Solution (FMS) toe en sluit de plaat opnieuw af. Vortex de plaat bij 1.600 rpm gedurende 1 min.
   5. Centrifugeer de plaat enkele seconden bij 280 x g (voer pulscentrifugering uit). Plaats vervolgens de verzegelde plaat gedurende 1 uur op het verwarmingsblok bij 37 °C.
   6. Als werd besloten om het experiment te pauzeren en de plaat in te vriezen, ontdooi deze dan bij kamertemperatuur en centrifugeer deze bij 280 x g. Als het niet is bevroren, slaat u deze stap over en gaat u naar stap 6.3.7.
   7. Laat het verwarmingsblok voorverwarmen tot 37 °C.
   8. Laat de wasbuffer ontdooien bij kamertemperatuur. Wanneer het ontdooid is, keert u het minstens 10x om om de inhoud te mengen.
   9. Verwijder de verzegeling van de plaat.
   10. Voeg 100 μL precipitatieoplossing (PM1) toe aan elke put van de plaat met monsters.
   11. Sluit de plaat opnieuw af met de afdichting.
   12. Vortex de plaat bij 1.600 rpm gedurende 1 min.
   13. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min.
   14. Plaats vervolgens gedurende 1 minuut in de pulscentrifuge op 280 x g .
       OPMERKING: Stel de centrifuge in op 4 °C voor de volgende stap.
   15. Verwijder voorzichtig de verzegeling van de plaat en gooi deze weg.
   16. Voeg 300 μL 2-propanol (100%) toe aan elke put die het monster bevat.
   17. Sluit de plaat met uiterste zorg af met een nieuwe afdichting. Zorg ervoor dat je het bord niet schudt.
   18. Keer de plaat minstens 10x om en meng de volledige inhoud.
   19. Incubeer bij 4 °C gedurende 30 min.
   20. Centrifugeer bij 3.000 x g bij 4 °C gedurende 20 min.
       OPMERKING: Verwijder aan het einde van stap 6.3.20 onmiddellijk de centrifugeplaat.
   21. Verwijder de verzegeling van de plaat en gooi deze weg.
   22. Keer de plaat snel om en laat de vloeistof op een pad aflekken om het supernatant weg te gooien. Druk vervolgens op de plaat in een droge ruimte op een papieren handdoek om de vloeistof af te tappen.
   23. Tik meerdere keren stevig gedurende 1 minuut of totdat alle putjes vrij zijn van vloeistof.
   24. Laat de plaat omgekeerd en onbedekt gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
       OPMERKING: Er wordt verwacht dat er blauwe pellets op de bodem van de putten te zien zijn.
   25. Verwarm de hybridisatieoven voor op 48 °C.
   26. Zet het warmteblok aan om voor te verwarmen. Houd rekening met dit proces van 20 minuten.
   27. Ontdooi Resuspension, Hybridization en Wash Solution bij kamertemperatuur. Keer minstens 10x om. Controleer of er geen zout in de oplossing zit.
   28. Voeg 46 μL resuspensie, hybridisatie en wasoplossing (RA1) toe aan elke put van de plaat.
       OPMERKING: Eventuele resterende reagentia moeten worden gereserveerd voor de kleurings- en hybridisatiestappen.
   29. Breng de afdichting aan op de plaat. Gebruik een aluminium afdichting om de plaat te bedekken. Houd stevig vast om de afdichting gelijkmatig uit te voeren.
   30. Controleer of alle putten veilig gesloten zijn om verdamping te voorkomen.
   31. Plaats de nieuw verzegelde plaat voorzichtig in de hybridisatieoven en incubeer gedurende 1 uur bij 48 °C.
   32. Vortex de plaat bij 1.800 rpm gedurende 1 min.
   33. Pulscentrifuge bij 280 x g.
   34. Breng de plaat gedurende 1 uur over in het warmteblok bij 95 °C.
   35. Bereid de Hybridisatie (Hyb) Kamers voor door ze bij elkaar te plaatsen. Doseer 400 μL bevochtigingsbuffer (PB2) in de reservoirs van de Hyb-kamers. Doe het deksel er meteen op.
   36. Laad elk monster van de plaat in de opening van de microarray.
   37. Laad de Hyb Chamber-inzetstukken met de microarrays in de Hyb-kamer. Sluit de Hyb-kamer kruislings om mogelijke verschuiving van de Hyb-kamer te voorkomen.
       OPMERKING: Hyb-kamers moeten worden geïncubeerd bij 48 °C gedurende ten minste 16 uur, maar niet meer dan 24 uur.
4. Dag 4: Kleuring - Methylatie assay, Handmatig Protocol
   1. Resuspend de Kleuringsoplossing 4 met 330 ml 100% EtOH, waardoor een eindvolume van 350 ml wordt verkregen. Schud de fles Staining Solution 4 krachtig om volledige resuspensie te garanderen. Bewaren op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Kleuroplossing 4 kan tot 2 weken worden bewaard bij een temperatuur tussen 2 °C en 8 °C.
   2. Haal de kamers uit de hybridisatieoven en laat ze 30 minuten afkoelen op de bank voordat ze worden geopend.
   3. Terwijl de Hyb-kamer koelt, vult u twee wascontainers met wasbuffer (200 ml per wascontainer). Vergeet niet om elke container te labelen als "Wasbuffer" (PB1 en PB2).
   4. Vul de microarray-uitlijnaccessoires met 150 ml wasbuffer.
   5. Scheid de plastic afstandhouders en maak indien nodig het glas schoon.
   6. Om de microarray-dia's te wassen, bevestigt u de draadlus aan het rooster en dompelt u de druppelapparatuur onder in de containers met 200 ml wasbuffer voor een totaal van 10x.
   7. Verwijder alle inserts uit de hybridisatiekamer en verwijder elke array uit de inserts. Verwijder de verzegeling.
      OPMERKING: Raak tijdens het verwijderen de blootgestelde matrices niet aan.
   8. Tijdens het verwijderen van de microarray-dia's uit de hybridisatiekamer, moet u oppassen dat u niets morst.
   9. Was de microarrays in de wasbuffer (PB1) oplossing langzaam en licht, waarbij ze 10x op en neer bewegen. Ga naar een verse PB1-oplossing en voer de was uit door de microarrays langzaam 10x op en neer te bewegen in de oplossing.
   10. Verwijder de microarray uit de container en bevestig de afwezigheid van residu.
   11. Gebruik een transparante afstandhouder aan de bovenkant van elke microarray en leid de afstandhouders naar de overeenkomstige posities.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat u alleen de transparante afstandhouders gebruikt, niet de witte.
   12. Plaats de uitlijnbalk op het uitlijnaccessoire.
   13. Plaats een glazen achterplaat op de bovenkant van de doorzichtige afstandhouder; wees voorzichtig om de hele microarray te bedekken. Bevestig vervolgens metalen klemmen aan de stroomkamers. Gebruik indien nodig een schaar om de uiteinden van de stroomkamerafstandhouders bij te knippen.
   14. Was onmiddellijk de hybridisatiekamerreservoirs met _ddH2O en schrob met een kleine reinigingsborstel. Laat geen bevochtigingsbuffer in het reservoir achterblijven.
   15. Ga naar de volgende stap die verantwoordelijk is voor de uitschuivende en beitsende microarray.
       OPMERKING: Laat alle stroomkamers horizontaal op de laboratoriumbank monteren. Behandel ze pas opnieuw als de hele vlekstap klaar is. Verwarm de resuspensie-, hybridisatie- en wasoplossing tot een temperatuur tussen 20 °C en 25 °C. Meng voorzichtig totdat er geen kristal in de oplossing wordt gezien.
   16. Plaats de reagentia in een rek achter elkaar. Als ze bevroren zijn, laat ze dan op kamertemperatuur staan en keer ze dan minstens 10x om om de oplossingen te mengen.
   17. Vul de watercirculatiepomp tot het juiste niveau.
   18. Zet de pomp aan en stel de temperatuur in op 44 °C.
   19. Verwijder alle bubbels die aan het kamerrek zijn bevestigd.
   20. Voer tests uit op het kamerrek met behulp van een temperatuurvoeler. Alle geteste locaties moeten tussen 44 °C ± 0,5 °C liggen.
       OPMERKING: De volgende stappen moeten zonder onderbreking worden uitgevoerd.
   21. Wanneer het rek een temperatuur van 44 °C bereikt, plaatst u elk aggregaat snel in de stroomkamer.
       OPMERKING: Pipetteer voor de volgende stappen alle reagentia in de achterste glasplaat.
   22. Pipet 150 μL resuspensie-, hybridisatie- en wasoplossing (RA1). Incubeer vervolgens gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap in totaal 5x.
   23. Pipetteer 450 μL Kleuringsoplossing 1 (XC1) en incubeer gedurende 10 min.
   24. Pipetteer 450 μL Kleuringsoplossing 2 (XC2) en incubeer gedurende 10 min.
   25. Pipetteer 200 μL Two-Color Extension Master Mix (TEM) en incubeer gedurende 15 min.
   26. Pipetteer 450 μL van 95% formamide/1 mM EDTA en incubeer gedurende 1 min. Herhaal tweemaal.
   27. Incubeer gedurende 5 min.
   28. Verlaag de temperatuur van het kamerrek tot 32 °C (aangegeven op Superior Two-Color Master Mix).
   29. Pipetteer 450 μL Vlekoplossing 3 (XC3) en incubeer gedurende 1 min. Herhaal 1x.
   30. Wacht tot het rek in de kamer de juiste temperatuur heeft bereikt.
       OPMERKING: Als u de microarray-afbeelding direct na het kleurproces wilt lezen, schakelt u de scanner in dit stadium in.
   31. Doseer nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), gevolgd door een incubatietijd van 10 minuten.
   32. Doseer vervolgens 450 μL Stain Solution 3 (XC3), gevolgd door 1 minuut incubatie. Herhaal dit 1x.
   33. Wacht 5 minuten en voeg dan 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) toe en incubeer gedurende 10 minuten.
   34. Doseer nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), gevolgd door een incubatietijd van 10 minuten.
   35. Doseer vervolgens 450 μL Stain Solution 3 (XC3), gevolgd door 1 minuut incubatie. Herhaal dit 1x.
   36. Wacht 5 minuten.
   37. Voeg 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) toe en incubeer gedurende 10 minuten.
   38. Voeg 450 μL Stain Microarray Solution 3 (XC3) toe en incubeer gedurende 1 minuut en herhaal dit opnieuw.
   39. Wacht 5 minuten.
       OPMERKING: Voer het volgende herhalingsschema uit: Stap 6.4.34., Stap 6.4.35. en stap 6.4.36.; Stap 6.4.37., 6.4.38. en stap 6.4.39.; Stap 6.4.34., Stap 6.4.35. en Stap 6.4.36.
   40. Verwijder nu onmiddellijk de stroomkamers uit het rek en plaats ze voorzichtig horizontaal op de laboratoriumbank. Zorg ervoor dat de temperatuur omgevingstemperatuur is.
   41. 6.4.41.Plaats 310 ml wasoplossing (PB1) voor elke microarray in een wasbak.
   42. Verwijder de metalen klemmen en het glas en ten slotte de microarray.
   43. Plaats de microarrays op een vlekkenrek en plaats ze in de wascontainer met 10x PB1-oplossing. Zorg ervoor dat de barcodes uit de buurt zijn van degene die ze hanteert en dat alle microarrays onder water staan.
   44. Beweeg langzaam en licht met op en neer bewegingen 10x. De microarray moet volledig uit de oplossing worden verwijderd voordat deze opnieuw wordt ondergedompeld. Laat het vervolgens 5 minuten ondergedompeld blijven.
   45. Schud het reagens Stain Solution 4 (XC4) krachtig om totale resuspensie te garanderen. Plaats 310 ml XC4 in een wasbak.
       OPMERKING: Laat de oplossing niet langer dan 10 minuten in de wascontainer zitten.
   46. Verplaats de vlekkenstandaard lichtjes naar de andere container met XC4.
   47. Beweeg langzaam en licht met op en neer bewegingen 10x. Zorg ervoor dat de microarray volledig uit de oplossing wordt verwijderd voordat deze opnieuw wordt ondergedompeld.
   48. Laat de microarray vervolgens 5 minuten ondergedompeld blijven.
   49. Verplaats de vlekstandaard uit de oplossing en plaats deze in een buishouder met de barcodes naar boven gericht.
   50. Verwijder de microarray voorzichtig met een borgtang en plaats ze op een plank om te drogen.
   51. Droog ze met behulp van de vacuümsiccator gedurende 50-55 minuten op 675 mm Hg (0,9 bar).
   52. Reinig de achterkant van elke microarray met EtOH.
       LET OP: Vermijd het aanraken van de strepen en laat EtOH op geen enkele manier op de strepen druppelen.
   53. Ga verder met het in beeld brengen van de microarray.
   54. Bewaar de microarray voorzichtig in een opbergdoos bij kamertemperatuur.
       OPMERKING: Microarray-beelden moeten binnen 72 uur worden gemaakt.

7. Bioinformatica analyse

OPMERKING: Het is noodzakelijk om enkele kenmerken van het soort microarray te wijzigen (arraytype = "450k" moet bijvoorbeeld worden vervangen door arraytype = "EPIC"). De auteur van de ChAMP-pijplijn beschrijft in detail alle velden die moeten worden gewijzigd om arrays te analyseren op de pagina Bioconductor van het ^pakket30.

1. Voorbeeldblad
   1. Breng de IDAT-bestanden over naar de computer om verder te gaan met bioinformatica-analyse31. Maak een voorbeeldblad om de gegevensanalyse uit te ^voeren31.
      OPMERKING: Drie kolommen zijn essentieel voor dit spreadsheetbestand. De eerste is Sample_name. Deze kolom moet de namen of codes bevatten die zijn gebruikt om de monsters te identificeren. De tweede is de Sentrix_position. Deze kolom plaatst de overeenkomstige R01C01 van de monsters, waarbij R01 verantwoordelijk is voor de chiprij en de kolom C01 wordt genoemd. De derde essentiële kolom is de Sentrix_ID en is verantwoordelijk voor het ontvangen van het nummer dat de microarray identificeert. Zorg ervoor dat u de juiste nummers plaatst. Het is mogelijk om andere informatie op het monsterblad toe te voegen als variabele waarden. In het huidige experiment zijn gegevens uit de metaalanalyse meegenomen.
2. ChAMP pijplijn
   1. Installeer RStudio (V.4.0.2) op de computer om de analyse uit te ^voeren30.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de computer minimaal 8 G RAM heeft. Data-analyse zal worstelen of crashen met een lagere hoeveelheid RAM.
   2. Open na de installatie RStudio en installeer het ChAMP Bioconductor ^package30 met behulp van de betreffende opdrachtregel (zie Aanvullend materiaal 1).
      OPMERKING: Als er een fout optreedt aan het einde van de installatie, installeert u de vereiste ChAMP-bibliotheken handmatig, één ^{voor één.}
   3. Importeer nu de onbewerkte gegevens en voer de analyse uit. Zie aanvullend materiaal 1.
      champ.load() importeert de ruwe gegevens en voert het filterproces uit, met uitzondering van probes met lage detectie pval, multihit sites, niet-CG probes, CpG sites in de buurt van SNP's en CpG's in geslachtschromosomen.
      champ.impute() voert KNN-imputatie standaard uit.
      Champ. QC haalt grafieken van gegevenskwaliteit op (bijvoorbeeld een grafiek met dichtheidsplots).
      Champ. SVD evalueert batcheffecten op basis van de verstrekte metagegevens in het voorbeeldblad.
      champ.refbase() voert schatting en correctie van het celtype uit.
      Champ. DMP( ) haalt differentieel gemethyleerde posities en eigenschapsassociaties zoals vetmassa op om de DNA-methylatie tussen groepen te controleren en de parameters te wijzigen, zoals weergegeven in aanvullend materiaal 1.
3. Verrijking (String DB)
   OPMERKING: Functionele verrijking wordt gebruikt om de biologische functies van een set genen af te leiden.
   1. Als u gegevens in een tekenreeks wilt verrijken, selecteert u de lijst met doelen die u wilt verrijken en als invoer wilt gebruiken uit: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. Voor organisme selecteert u homo sapiens en drukt u op de knop Zoeken.
   3. Om door de verrijking te navigeren, klikt u op de knop Analyse.
4. GEO-indiening
   1. Deponeer de gegevens in een openbare opslagplaats zoals NCBI's GEO. Registreer u hiervoor voor het account van de indiener.
      OPMERKING: Voltooi de GEO-indiening (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) door het metagegevensblad met beschrijvende informatie en protocollen voor het algehele experiment en individuele voorbeelden te downloaden. GEO-archiefinzendingen kunnen in elke spreadsheetsoftware worden gemaakt. Voeg ten tweede het onbewerkte gegevensbestand dat is gegenereerd uit het cell-ranger count script voor alle bibliotheken toe aan de directory. IDAT en bijbehorende bestanden of een matrixwerkblad bevatten niet-genormaliseerde gegevens. De derde map zijn de verwerkte gegevensbestanden. De matrixtabel is een spreadsheet met de uiteindelijke, genormaliseerde waarden die vergelijkbaar zijn tussen rijen en monsters en bij voorkeur worden verwerkt zoals beschreven in een bijbehorend manuscript.
   2. Plaats verwerkte gegevensbestanden die zijn gegenereerd uit het cell-ranger count script voor alle bibliotheken in de directory. Gebruik de FTP-serverreferenties van de GEO-indiener om de map met alle drie de componenten over te zetten.

Resultaten

Na gebruik van de ChAMP-pijplijn werden 409.887 probes in de analyse overwogen na alle filters (ongekwalificeerde CpG's, niet-CG probes, CpG near SNPs, multihit sites en CpGs gerelateerd aan XY); een schema is weergegeven in figuur 2.

Figuur 2: Pijplijn van de bioinformatica analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bovendien bleek uit de dichtheidsgrafiek dat alle monsters vergelijkbare dichtheden van de bètaverdeling hadden met betrekking tot de stappen voor kwaliteitscontrole. Deze analyse evalueert de verdeling van bètawaarden en wijst erop of er monsters zijn die moeten worden uitgesloten. In deze batch werden op basis van deze analyse geen monsters uitgesloten.

Figuur 3: Bètawaarden dichtheidsdiagram verkregen met het ChAMP-pakket. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De singular value decomposition (SVD) analyse werd gebruikt om de belangrijkste componenten te verifiëren die de variabiliteit van DNA-methylatiegegevens significant beïnvloedden. Uit de gegevens bleek dat BMI, WC (p < 1e10-5) en FM (p < 0,05) een significant effect hadden op de gegevensvariabiliteit (figuur 4).

Figuur 4: Enkelvoudige waarde decompositie analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Schatting van het celtype toonde aan dat zowel natural killer-cellen (NK) als B-cellen hoger waren bij zwaarlijvige vrouwen (figuur 5).

Figuur 5: Celfracties geschat volgens de methode van Houseman. Gran: granulocyt. CD4T: helper T-cel, lymfocyt. CD8T: cytotoxische T-cel, lymfocyt. Mono: monocyt. B Cel: B lymfocyt. NK: natural killer cellen, lymfocyten. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNA-methylatieniveaus tussen zwaarlijvige en niet-obese vrouwen verschilden voor en na celtypecorrectie. Vóór dna-methylatiegegevenscorrectie voor celtypen werden 43.463 differentieel gemethyleerde posities (DMP's) waargenomen en 3.329 CLB's bleven daarna significant. 445 CpG-locaties bevonden zich in intergene regio's (IGR) en 2.884 in geniale regio's, waarvan de meeste in de promotorregio (n = 1.438). De verdeling over alle regio's was TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), eerste exon (n = 273), body (n = 724) en 3'UTR (n = 59). Rekening houdend met Δβ-waarden <-0,05 en >0,05, waren 162 CLB's gehypomethyleerd en 576 hypermethyleerd bij zwaarlijvige personen in vergelijking met niet-zwaarlijvige personen (figuur 6). De gegevens zijn beschikbaar in de GEO-database onder de registratiecode GSE166611.

Figuur 6: Differentieel gemethyleerde posities. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.

Het is mogelijk om de verschillende methylatie tussen groepen te evalueren en CpG-sites te vinden die geassocieerd zijn met specifieke eigenschappen in methylatiestudies. Voor vetmassastudies werden 13.222 CpG-locaties gevonden. 6.159 CLB's in het promotorgebied waren gerelateerd aan vetmassa, met 470 gehypermethyleerde en 94 hypomethyleerde (figuur 7), en de respectieve genen waren verrijkt (tabel 2).

Figuur 7: Promotorgebieden van gehypothineerde en gehypermethyleerde genen, onafhankelijk van de vetmassa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 2: Functionele verrijking van de genen van de differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend materiaal 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

DNA-methylatiearrays zijn de meest gebruikte methoden om toegang te krijgen tot DNA-methylatie vanwege hun kosten-batenverhouding14. De huidige studie beschreef een gedetailleerd protocol met behulp van een commercieel beschikbaar microarray-platform om DNA-methylatie te evalueren in een pilotstudie uitgevoerd in een Braziliaans cohort. De verkregen resultaten van de pilotstudie bevestigden de effectiviteit van het protocol. Figuur 3 toont de vergelijkbaarheid van het monster en de volledige bisulfietconversie32.

Als een stap voor kwaliteitscontrole adviseerde het ChAMP-algoritme de uitsluiting van CpG-sites tijdens het filterproces. Het doel van het uitsluiten van probes is om data-analyse te verbeteren en bias te elimineren. De cpg's van lage kwaliteit (p-waarden lager dan 0,05) werden verwijderd om experimentele ruis in de dataset te elimineren. De doelen bleven gepasseerd in de dichtheidsplotanalyse. ^Zhou33 beschreef het belang van het filteren van CpG's in de buurt van SNP's om mismatches, misinterpretatie van methylatie van polymorfe cytosines en het veroorzaken van schakelkleur van type I probe ^design34 te voorkomen. Omdat XY-chromosomen differentieel worden beïnvloed door inprenting, versterkten Heiss en ^Just35 het belang van het filteren van die sondes omdat bij vrouwen de problemen met hybridisatie verstorende factoren kunnen ^zijn35.

De vervaldatum van de DMAP's, de openingsdatum van formamide, de analytische kwaliteit van de absolute ethanol en het totale aantal leukocyten worden beschouwd als kritieke stappen in het protocol.

Bovendien is volgens onze waarnemingen de schatting van het celtype essentieel bij het uitvoeren van de bioinformatica-analyse. De Houseman-methode voert de schatting van het celtype uit zoals beschreven in tian's ^studie30. Deze methode is gebaseerd op 473 specifieke CpG-locaties die de percentages van de belangrijkste celtypen kunnen voorspellen, zoals granulocyten, monocyten, B-cellen en ^T-cellen36. We gebruikten de aanbevolen functie "myRefbase" uit het ChAMP-pakket. Na de schatting past het ChAMP-algoritme de bètawaarden aan en elimineert deze bias uit de dataset. Deze stap is cruciaal in studies gericht op obesitas omdat deze populatie een aanzienlijk verschil heeft in witte bloedcellen vanwege hun chronische ontstekingstoestand.

We hebben alleen de oorspronkelijke dopkaart voor de gemeenschappelijke PCR-zegel gewijzigd met betrekking tot methodewijziging en probleemoplossing. Na elk centrifugatieproces werd de afdichting vervangen door een nieuwe. We konden de standaard warmteafdichting niet gebruiken en pasten deze aan met aluminiumfolie rond de plaat.

Hoewel commerciële assays worden beschouwd als een gouden standaard voor epigenetische studies, zou een beperking van het protocol de specificiteit van de reagentia en apparatuur van een uniek merk kunnen zijn37,38,39,40. Een andere beperking is het ontbreken van indicatoren waarmee de juiste voortgang van het experiment ^{kan worden geïdentificeerd41}.

De standaardisatie van het huidige protocol vormt een geweldige gids voor epigenetisch onderzoek, het verminderen van menselijke fouten tijdens het proces en het mogelijk maken van succesvolle data-analyse en vergelijkbaarheid tussen verschillende studies.

Volgens onze resultaten zijn DNA-methylatie-experimenten geschikt voor studies waarin personen met en zonder obesitas worden ^vergeleken43. Ook leverde de voorgestelde bioinformatica-analyse gegevens van hoge kwaliteit op en kon deze worden overwogen in grootschalige studies.

Met behulp van de SVD-analyse identificeerden we dat de obesitas-gerelateerde eigenschappen (BMI, WC en FM) de variabiliteit in DNA-methylatiegegevens beïnvloedden. Als significant resultaat geeft de schatting van het celtype aan dat zowel natural killer-cellen (NK) als B-cellen hoger waren bij vrouwen met obesitas dan bij vrouwen zonder obesitas (figuur 5). De hogere aantallen van die cellen kunnen worden verklaard door de laaggradige ontstekingstoestand van deze ^personen44. We zagen dat patiënten met obesitas hypo- en hypermethylated CpG's hebben in promotorregio's van genen geassocieerd met vetmassa. De meeste sites waren gehypomethyleerd, wat verband kon houden met de natuurlijke toename van reactieve zuurstofsoorten (ROS) bij deze individuen. Deze oxidatieve stressaandoening kan guanine-verstoring op de dinucleotideplaats bevorderen, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) vormen, wat resulteert in een 5mCp-8-OHdG dinucleotide-site en tet-enzymen rekrutering veroorzaakt. Al deze gebeurtenissen kunnen verantwoordelijk zijn voor het bevorderen van DNA-hypomethylatie en hypermethylatie door verschillende ^{werkingsmechanismen45}.

Bovendien lijkt de snelheid van adipogenesis toe te nemen bij personen met obesitas, met ongeveer 10% van de nieuwe cellen naar oude ^cellen46,47. Epigenetische bijdragen, met de nadruk op de obesogene omgeving, kunnen de proliferatie- en differentiatiesnelheden van de cellen veranderen, waardoor de ontwikkeling van ^{vetmassa48 wordt bevorderd48}. Epigenetische veranderingen kunnen ook adipogene programma's beïnvloeden, waardoor hun ontwikkeling wordt vergemakkelijkt of beperkt. Primaire transcriptiefactoren (PPARγ of C / EBPα) of de assemblage van multiproteïnecomplexen, gepositioneerd in downstream promotorregio's die worden gebruikt door epigenetische modificerende enzymen op te nemen of uit te sluiten, reguleren genexpressie door hyper- of ^{hypomethylatie45}. De PPARγ-route is eerder beschreven om de WNT-route te veranderen, die genen had verrijkt in deze studie. Hoewel het nog onbekend is hoe WNT-signalering optreedt tijdens adipogenesis, hebben recente studies gemeld dat het een essentiële rol kan spelen in het adipocytenmetabolisme, vooral onder obesogene ^{omstandigheden49}.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Absolute ethanol	J.T. Baker	B5924-03
Agarose gel	Kasvi	K9-9100
Elektrische bio-impedantie	Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit	ZymoResearch, Irvine, CA, USA	D5001
Formamide	Sigma	F9037
FMS—Fragmentatieoplossing	Illumina	11203428	Meegeleverde reagentia
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brazil	AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix	Illumina	11202880	Meegeleverde reagentia
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix	Illumina	11203410	Meegeleverde reagentia
NaOH	F. MAIA	114700
PB1—Reagens gebruikt om BeadChips voor hybridisatie voor te bereiden	Illumina	11291245	Meegeleverde reagentia
PB2—Bevochtigingsbuffer gebruikt tijdens hybridisatie	Illumina	11191130	Meegeleverde reagentia
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1—Resuspensie-, hybridisatie- en wasoplossing	Illumina	11292441	Meegeleverde reagentia
RPM—Random Primer Mix	Illumina	15010230	Meegeleverde reagentia
STM—Superior Two-Color Master Mix	Illumina	11288046	Meegeleverde reagentia
TEM—Two-Color Extension Master Mix	Illumina	11208309	Meegeleverde reagentia
Ultrapure EDTA	Invitrogen	155576-028
96-Well Reaction Plate met barcode (0,1mL)	ByoSystems	4346906
96-Well Reaction Plate met barcode (0,8mL)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1—XStain BeadChip oplossing 1	Illumina	11208288	Meegeleverde reagentia
XC2—XStain BeadChip oplossing 2	Illumina	11208296	Meegeleverde reagentia
XC3—XStain BeadChip oplossing 3	Illumina	11208392	Meegeleverde reagentia
XC4—XStain BeadChip oplossing 4	Illumina	11208430	Meegeleverde reagentia