Methodenartikel

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/62621

⸱

30 juni 2021

 ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel heeft tot doel een protocol te presenteren voor het bereiden van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomale handel is een essentieel cellulair proces dat een breed scala aan biologische gebeurtenissen reguleert. Eiwitten worden geïnternaliseerd uit het plasmamembraan en vervolgens getransporteerd naar de vroege endosomen. De geïnternaliseerde eiwitten kunnen worden overgebracht naar het lysosoom voor afbraak of worden gerecycled naar het plasmamembraan. Een robuuste endocytische recyclingroute is nodig om de verwijdering van membraanmaterialen van endocytose in evenwicht te brengen. Van verschillende eiwitten wordt gemeld dat ze de route reguleren, waaronder ADP-ribosylatiefactor 6 (ARF6). Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie is een klassieke methode voor celfractionering. Na de centrifugatie worden organellen aan hun isopreienoppervlak gesedimenteerd. De fracties worden verzameld en gebruikt voor andere downstream toepassingen. Hier wordt een protocol beschreven om een recycling endosoombevattende fractie te verkrijgen uit getransfecteerde zoogdiercellen met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De geïsoleerde fracties werden onderworpen aan standaard Western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Door deze methode te gebruiken, identificeerden we dat de plasmamembraantargeting van engulfment en celmotiliteit 1 (ELMO1), een Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1) guanine nucleotide-uitwisselingsfactor, door ARF6-gemedieerde endocytische recycling is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomale handel is een essentieel fysiologisch proces dat verschillende biologische gebeurtenissenimpliceert 1, bijvoorbeeld het transport van signaalreceptoren, ionkanalen en adhesiemoleculen. Eiwitten gelokaliseerd bij het plasmamembraan worden geïnternaliseerd door endocytose2. De geïnternaliseerde eiwitten worden vervolgens gesorteerd op het vroege endosoom3. Sommige eiwitten zijn gericht op lysosomen voor afbraak4. Een aanzienlijke hoeveelheid eiwitten wordt echter teruggevoerd naar het celoppervlak door snelle recycling en langzame recyclingprocessen. Bij snelle recycling verlaten eiwitten de vroege endosomen en keren ze direct terug naar het plasmamembraan. Omgekeerd worden eiwitten bij langzame recycling eerst gesorteerd naar het endocytische recyclingcompartiment en vervolgens teruggevoerd naar het plasmamembraan. Verschillende ladingeiwitten, bijvoorbeeld clathrin, retromeercomplex, retrievercomplex en Wiskott-Aldrich-syndroomeiwit en SCAR Homologue (WASH) -complex, nemen deel aan dergelijke membraanrecyclingprocessen4,5,6,7,8,9. De balans van de endocytose en recyclinggebeurtenis is cruciaal voor celoverleving en draagt bij aan verschillende cellulaire gebeurtenissen10, bijvoorbeeld celadhesie, celmigratie, celpolariteit en signaaltransductie.

ARF6, een kleine GTPase, is een gerapporteerde regulator van endocytische handel7,11,12. Van belang, verschillende onderzoeksgroepen hebben het belang van ARF6 in endocytische recycling13,14,15,16,17geïllustreerd. De studie heeft tot doel de relatie tussen ARF6-gemedieerde neurietuitgroei en endocytische recycling te onderzoeken. Het vorige rapport suggereert dat de activering van ARF6 stroomopwaarts is naar Rac1-activiteit door in te werken op ELMO1-dedicator van cytokinese 1 (DOCK180) complex18. Hoe ARF6 ELMO1-DOCK180 gemedieerde Rac1-signalering activeert, blijft echter onduidelijk. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werd gebruikt om de rol van ARF6-gemedieerde endocytische recycling in een dergelijk proces te onderzoeken. Door dat te gebruiken, werd de recycling endosoomhoudende fractie verkregen uit cellysaten19. De fractie werd onderworpen aan Western blotting voor analyse van het eiwitgehalte. De immunoblotresultaten toonden aan dat onder de aanwezigheid van FE65, een met de hersenen verrijkt adaptoreiwit, actieve ARF6 het niveau van ELMO1 in de recycling endosoombevattende fractie aanzienlijk verhoogde. Het volgende protocol omvat de procedures voor (1) transfectie van zoogdiercellen; (2) het voorbereiden van de monsters en de kolommen met dichtheidsgradiënt; en (3) het verkrijgen van de recyclingdosome-bevattende fractie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek en transfectie van zoogdieren

  1. Plaat 2 x 106 cellen in een 100 mm kweekschaal. Gebruik vier gerechten voor elke transfectie.
    OPMERKING: Het aantal benodigde cellen kan variëren voor verschillende cellijnen. Optimalisatie kan nodig zijn voordat u doorgaat naar de isolatiestap.
  2. De volgende dag transfecteer de cellen met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant.

2. Celoogst

  1. Gooi het kweekmedium 48 uur na de transfectie weg.
  2. Was de cellen tweemaal met ijskoude PBS (10 mM natriumfosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride).
  3. Voeg 1 ml ijskoude PBS+ (PBS aangevuld met 0,5x proteaseremmercocktail en 0,5x fosfataseremmercocktail) toe aan elk gerecht.
  4. Verzamel de cellen met een celschraper en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren met behulp van een zwenkbakrotor op 400 x g gedurende 5 minuten.
  6. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel voorzichtig in 5 ml homogenisatiebuffer (HB; 250 mM sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA aangevuld met 0,03 mM cycloheximide, 1x proteaseremmer cocktail en 1x fosfataseremmer cocktail).
  7. Verzamel de cellen door centrifugering bij 1.300 x g gedurende 10 minuten.
  8. Resuspend de celkorrel in 1 ml HB.
  9. Homogeniseer de cellen met een Dounce homogenisator voor 15-20 slagen.
    OPMERKING: Andere homogenisatiemethoden, bijvoorbeeld het passeren van het monster door een spuit, kunnen worden gebruikt. De homogenisatie-efficiëntie kon worden onthuld door het homogenaat te observeren onder een fasecontrastmicroscoop.
  10. Breng het homogenaat over in een centrifugeerbuis van 2 ml.
    OPMERKING: Oogst 50 μL homogenaat met 12,5 μL 5x monsterbuffer en label het als totaal lysaat.
  11. Voeg 0,7 ml HB toe aan het homogenaat.
  12. Spin het verdunde homogenaat gedurende 10 minuten bij 4 °C op 2.000 x g.
    OPMERKING: De pellet bevat kernen en ongebroken cellen.
  13. Verzamel 1,5 ml van het supernatant en herhaal stap 2.12 eenmaal.
  14. Verzamel 1,4 ml van het supernatant en label het als postnucleair supernatant (PNS).

3. Voorbereiding van de dichtheidsgradiëntkolom

  1. Breng 1,2 ml PNS over in een ultracentrifugebuis.
  2. Voeg 1 ml 62% sucrose-oplossing (2,351 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan het monster en meng goed door zachtjes te pipetteren.
    OPMERKING: De resulterende oplossing is een 40,6% sucrose-oplossing.
  3. Voeg 3,3 ml 35% sucrose-oplossing (1,177 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) voorzichtig toe aan het monster.
  4. Voeg voorzichtig 2,2 ml 25% sucrose-oplossing (0,806 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan de 35% sucrose-oplossing.
    OPMERKING: De brekingsindex van de sucrose-oplossingen van 62%, 40,6%, 35% en 25% bij kamertemperatuur is respectievelijk 1,44, 1,40, 1,39 en 1,37. De brekingsindexen van de sacharoseoplossingen kunnen met een refractometer worden gecontroleerd om de precisie en consistentie van het experiment te waarborgen.
  5. Vul de ultracentrifugatiebuis met HB.
    OPMERKING: Bewaar de voorbereide kolom met dichtheidsgradiënt tijdelijk bij 4 °C.

4. Fractionering en terugwinning van recycling endosoomhoudende fractie

  1. Centrifugeer de kolom bij 210.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °C.
  2. Verzamel 12 fracties (elk 1 ml) zorgvuldig, te beginnen vanaf de bovenkant van de helling.
    OPMERKING: De recycling-endosomen moeten worden gevonden op het grensvlak tussen 35% en 25% sucrose-oplossingen. De verzamelde fracties kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C.
  3. Verdun alle fracties met 1 ml verdunningsbuffer (3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA).
  4. Centrifugeer het verdunde monster bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
  5. Zuig het supernatant op en voeg 50 μL 1x monsterbuffer toe om de fracties te oogsten.
  6. Analyseer het eiwitgehalte in de fracties door western blotting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na fractionering van de niet-getransfecteerde HEK293-cellen door middel van ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, werden 12 fracties verzameld vanaf de bovenkant van de gradiënt. De geoogste fracties werden verdund met de verdunningsbuffer in een verhouding van 1:1 en onderworpen aan een tweede ronde van centrifugatie. De monsters werden vervolgens onderworpen aan western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Zoals weergegeven in figuur 1,wordt de recycling endosoommarke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bovenstaande protocol schetst de procedures voor het isoleren van recycling-endosomen uit gekweekte cellen door ultracentrifugatie. De betrouwbaarheid van deze methode is aangetoond door de laatste publicatie22, waaruit blijkt dat recycling-endosomen met succes worden geïsoleerd uit andere organellen (figuur 1), zoals het Golgi-apparaat en mitochondriën. Er moet aandacht worden besteed aan enkele kritische stappen voor het verkrijgen van een goed scheidingsresulta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund en de TUYF Charitable Trust. De cijfers in dit werk zijn aangepast van onze vorige publicatie, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" gepubliceerd in het FASEB Journal in oktober 2020.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm weefselkweekschaalSPL20100
13,2 mL, gecertificeerde vrijstaande Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Sample BufferGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-vrije Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
COX IV (3E11) Konijn mAbCell Signaling Technology4850SKonijn monoklonaal antilichaam voor het detecteren van COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met lage glucoseHyCloneSH30021.01
ELMO1 antilichaam (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 antilichaam (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Geit polyklonaal antilichaam voor het detecteren van FE65.
Foetaal runderserum, onderzoekskwaliteitHyCloneSV30160.03
GAPDH monoklonaal antilichaam (6C5)AmbionAM4300Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMeting van bandintensiteit
ImidazoolSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfectie ReagensInvitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP antilichaamSigmaG6160Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van β-COP.
Myc-tag (9B11) muis mAbCell Signaling Technology2276SMuis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van myc-getagde eiwitten.
OmniPur EDTA, Dinatriumzout, DihydraatCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Reduced Serum MediaGibco31985070
PBS TablettenGibco18912014
PhosSTOPRoche4906845001
RAB11A-Specifiek polyklonaal antilichaamProteintech20229-1-APKonijn polyklonaal antilichaam voor het detecteren van Rab11.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter362046
Trypsine-EDTA (0,05%), fenolroodGibco25300062

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endosomaal transportrecyclerende endosomencel fractioneringWestern blottingARF6 regulatieRab11 markerprote netransport

Gerelateerde artikelen