OnePot PURE Celvrij Systeem

Samenvatting

We presenteren een snelle en kosteneffectieve methode om het recombinante PURE celvrije TX-TL-systeem te produceren met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

Samenvatting

Het gedefinieerde PURE (eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen) transcriptie-translatiesysteem biedt een aantrekkelijk chassis voor celvrije synthetische biologie. Helaas zijn commercieel verkrijgbare systemen duur en is hun tonijnbaarheid beperkt. Ter vergelijking: een zelfgemaakte aanpak kan worden aangepast op basis van de behoeften van de gebruiker. De bereiding van zelfgemaakte systemen is echter tijdrovend en moeizaam vanwege de behoefte aan ribosomen en 36 middelgrote eiwitzuiveringen. Het stroomlijnen van eiwitzuivering door coculturing en co-zuivering zorgt voor het minimaliseren van tijd- en arbeidsvereisten. Hier presenteren we een eenvoudige, aanpasbare, tijd- en kosteneffectieve methode om alle PURE-systeemcomponenten binnen 1 week te produceren, met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Bovendien zijn de prestaties van de OnePot PURE vergelijkbaar met commercieel verkrijgbare systemen. De OnePot PURE bereidingsmethode breidt de toegankelijkheid van het PURE-systeem uit naar meer laboratoria vanwege de eenvoud en kosteneffectiviteit.

Inleiding

Celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systemen vormen een veelbelovend platform voor het onderzoeken en engineeren van biologische systemen. Ze bieden vereenvoudigde en afstembare reactieomstandigheden, omdat ze niet langer afhankelijk zijn van levensondersteunende processen, waaronder groei, homeostase of regulerende mechanismen¹. Er wordt dus verwacht dat celvrije systemen zullen bijdragen aan het onderzoek van biomoleculaire systemen, een kader zullen bieden om rationele biodesignstrategieën te testen², en een chassis zullen bieden voor een toekomstige synthetische cel^3,4. Het volledig recombinante PURE-systeem biedt een bijzonder aantrekkelijk chassis vanwege de gedefinieerde en minimale samenstelling, evenals de instelbaarheid en afstembaarheid⁵.

Sinds het eerste functionele, volledig recombinante PURE-systeem in 2001 werd opgericht^5,zijn er inspanningen geleverd om de systeemlimieten uit te breiden en de samenstelling van het systeem te optimaliseren om de systeemopbrengsten te verbeteren^6,7,8,transcriptionele regulatie^{9,membraan 10, 11} en secretoire eiwitsynthese^12,en om eiwitvouwing^13,14 te vergemakkelijken . Tegenwoordig zijn er drie commercieel verkrijgbare systemen: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) en Magic PURE (Creative Biolabs). Die systemen zijn echter duur, hun exacte samenstelling is eigendom en dus onbekend, en het aanpassingsvermogen is beperkt.

PURE-systemen die in eigen huis zijn voorbereid, bleken de meest kosteneffectieve en afstembare optie^15,16te zijn. De vereiste 37 zuiveringsstappen voor eiwit- en ribosoomfracties zijn echter tijdrovend en vervelend. Er zijn verschillende pogingen gedaan om de efficiëntie van de PURE-systeemvoorbereiding te verbeteren^17,18,19. We hebben onlangs aangetoond dat het mogelijk is om alle benodigde niet-ribosomale eiwitten in het PURE-systeem te cocultureren en co-purificeren. Deze OnePot-methode is kosteneffectief en tijdsefficiënt gebleken, waardoor de voorbereidingstijd van enkele weken tot 3 werkdagen wordt teruggebracht. De aanpak genereert een PURE-systeem met een eiwitproductiecapaciteit die vergelijkbaar is met het in de handel verkrijgbare PURExpress-systeem^20. In tegenstelling tot de vorige benaderingen om het PURE-preparaat te vereenvoudigen^17,18,19, worden in de OnePot-benadering alle eiwitten nog steeds uitgedrukt in afzonderlijke stammen. Dit stelt de gebruiker in staat om de samenstelling van het OnePot PURE-systeem af te stemmen door alleen specifieke stammen weg te laten of toe te voegen of de inentingsvolumes aan te passen, waardoor respectievelijk uitval PURE-systemen worden gegenereerd of de uiteindelijke eiwitverhoudingen worden gewijzigd.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde methode voor het maken van het OnePot PURE-systeem zoals eerder beschreven²⁰, hoewel β-mercaptoethanol werd vervangen door tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP). Bovendien worden twee methoden voor ribosoomzuivering beschreven: traditionele tag-vrije ribosoomzuivering met behulp van hydrofobe interactie en sucrosekussen, aangepast van Shimizu et al.¹⁵, en Ni-NTA ribosoomzuivering op basis van Wang et al.¹⁸ en Ederth et al.^21, maar aanzienlijk gewijzigd. De laatste methode vergemakkelijkt de voorbereiding van het PURE-systeem verder en maakt het toegankelijk voor meer laboratoria, omdat alleen standaard laboratoriumapparatuur vereist is.

Het experimentele protocol vat de voorbereiding samen van een veelzijdig PURE-celvrij TX-TL-systeem om een eenvoudig, afstembaar, kosteneffectief celvrij platform te bieden, dat binnen een week kan worden voorbereid met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Naast de introductie van de standaard PURE-samenstelling, geven we aan hoe en waar deze kan worden aangepast, met een primaire focus op kritieke stappen in het protocol om de functionaliteit van het systeem te waarborgen.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de voorbereiding van een celvrij TX-TL-systeem van recombinante componenten. Voor het gemak is het werk opgedeeld in vijf delen. Het eerste deel beschrijft voorbereidingsstappen, die moeten worden uitgevoerd voordat het protocol wordt gestart. Het tweede deel beschrijft de bereiding van de OnePot-eiwitoplossing. Het derde deel beschrijft ribosoomzuiveringen, het vierde deel beschrijft de bereiding van de energieoplossing en het laatste deel biedt een handleiding voor het opzetten van een PURE-reactie. Voor het gemak zijn de protocollen onderverdeeld in dagen en samengevat in dagschema's in tabel 1. Volgens het schema kan het hele systeem in 1 week door één persoon worden voorbereid.

1. Voorbereidende werkzaamheden

1. Bereid de bacteriële kweekmedia en mediasupplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 1. Bereid en steriliseer de benodigde materialen, inclusief pipetpunten, 96 diepe putplaten.
2. Strain voorbereiding
   1. Transformeer de in tabel 2 aangegeven expressiespanningen met de overeenkomstige expressievectoren met behulp van de heat shock-methode.
      1. Voeg gezuiverd plasmide toe aan de chemisch competente bacteriën en incubeer op ijs gedurende 20-30 minuten.
      2. Plaats het mengsel bij 42 °C gedurende 30 s (hitteschok) en plaats het vervolgens gedurende 2 minuten terug op ijs.
      3. Pipetteer 20 μL van de bacteriën rechtstreeks op agarplaten die ampicilline (AMP) bevatten en incubeer bij 37 °C gedurende de nacht. Bewaar de borden bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
      4. Ent 3 ml LB-media met AMP met een enkele kolonie bacteriën uit de agarplaten. Incubeer bij 37 °C terwijl u 's nachts bij 260 tpm schudt.
      5. Meng 250 μL van de kweek met 250 μL 50% (v/v) glycerol en bewaar bij -80 °C.
         OPMERKING: Voor een snellere voorbereiding in de toekomst, bewaar de stammen in een 96-well plaat als glycerol voorraden.
   2. Bevestig alle vectortransformaties door kolonie PCR en sequencing. Sequentieer het gen, promotorgebied en ribosoombindingsplaats.
3. Expressietest
   1. Ent 300 μL LB-media die AMP bevatten met ongeveer 1 μL van de bereide glycerolvoorraden in een diepe putplaat van 1,3 ml. Sluit de plaat af met een ademend membraan en incubeer vervolgens bij 37 °C terwijl u 's nachts bij 260 tpm schudt.
      OPMERKING: Alle expressies worden op dit punt afzonderlijk gedaan.
   2. Ent 300 μL verse LB-media die AMP bevatten met 1 μL van de nachtculturen. Incubeer bij 37 °C terwijl u 's nachts bij 260 tpm schudt. Induceer na 2 uur de cellen met 100 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en groei nog eens 3 uur.
   3. Meng 10 μL van de kweek met 10 μL 2x Laemmli buffer en verwarm tot 95 °C gedurende 10 min. Draai de monsters gedurende 1 minuut met behulp van een tafelcentrifuge en laad 10 μL van het supernatant op een PAGE-gel. Voer de gel in de Tris/Glycine/SDS-buffer gedurende 30 minuten uit op 200 V. Spoel het goed af met gedeoniseerd water. Bedek de gel met een Coomassie eiwitvlek en incubeer gedurende 1 uur. Desin de gel indien nodig in water (representatieve resultaten voor de expressietest in figuur 1).
      OPMERKING: Gebruik gradiënt (4%-15% of 4%-20%) PAGE-gels om een goede scheiding te bereiken.
4. IMAC Sepharose hars restauratie en reiniging
   1. Columnvoorbereiding.
      1. Meng de Sepharose hars goed door te vortexen.
      2. Pipetteer de benodigde hoeveelheid hars in een lege zwaartekrachtstroomkolom.
         OPMERKING: De benodigde hoeveelheid hars varieert tussen his-ribosoomzuivering en eiwitzuivering en wordt gespecificeerd in de respectieve secties.
      3. Was de hars met 30 ml gedeoniseerd water.
      4. Ga verder met het opnieuw opladen van de kolom zoals gespecificeerd in punt 1.4.4.
         OPMERKING: Laat altijd alle vloeistof door de kolom gaan voordat u doorgaat met de volgende stap. Zorg er echter voor dat de kolom nooit droogloopt. Wanneer u een vloeistof door de kolom laat lopen, zorg er dan voor dat u de stroom stopt of doorgaat naar de volgende stap zodra de vloeistof de hars bereikt.
   2. Restauratie.
      1. Was de kolom met 30 ml gedeoniseerd water.
      2. Breng 10 ml van een 0,2 M EDTA en 0,5 M NaCl-oplossing aan.
      3. Voeg 30 ml van een 0,5 M NaCl-oplossing toe.
      4. Was de kolom met 50 ml gedeoniseerd water.
      5. Bewaren in 20% (v/v) ethanol bij 4 °C of doorgaan met de volgende stap.
   3. Reiniging.
      LET OP: Draag beschermende uitrusting.
      1. Was de kolom met 30 ml van 0,5 M NaOH.
      2. Was de kolom met 30 ml gedeoniseerd water.
      3. Was de kolom met 30 ml azijnzuur van 0,1 m.
      4. Was de kolom met 30 ml gedeoniseerd water.
      5. Was de kolom met 30 ml 70% (v/v) ethanol.
      6. Was de kolom met 50 ml gedeoniseerd water.
      7. Bewaren in 20% (v/v) ethanol bij 4 °C of doorgaan met de volgende stap.
   4. Opladen.
      1. Voeg 10 ml nikkelsulfaatoplossing van 0,1 M toe aan de kolom.
         LET OP: Nikkelsulfaat is giftig. Nikkelsulfaatafval moet worden weggegooid met de voorzorgsmaatregelen die door de leverancier zijn aangegeven.
      2. Was de kolom met 50 ml gedeoniseerd water.
      3. Store in 20% ((v/v)) ethanol bij 4 °C of ga verder met de kolom equilibratie.
         OPMERKING: Als de kolom tussen de stappen door in ethanol wordt opgeslagen, zorg er dan voor dat u alle sporen van ethanol verwijdert door de kolom met water te wassen.

2. OnePot eiwitoplossing expressie en zuivering

OPMERKING: Het protocol bestaat uit drie delen verdeeld in dagen(figuur 2). Een ideale bereidingsprocedure produceert 1,5 ml 13,5 mg / ml OnePot-eiwitoplossing, wat overeenkomt met meer dan duizend PURE-reacties van 10 μL. De hoeveelheid en de ideale concentratie van de oplossing variëren echter van batch tot batch. Ervaren gebruikers kunnen meerdere OnePot PURE-preparaten tegelijk uitvoeren.

Dag 1:

1. Bereid bacteriekweekmedia en mediasupplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 1.
2. Bereid en steriliseer de benodigde materialen, inclusief pipetpunten, twee 96 diepe putplaten en een verbijsterde Erlenmeyer van 1 L.
3. Bereid buffers en supplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 2. Filter steriliseer alle buffers met flessendekselfilters (0,45 μm) en bewaar ze bij 4 °C. Vul alle buffers vlak voor gebruik aan met 1 mM TCEP, tenzij anders aangegeven.
4. Gebruik 2 ml sepharosehars voor de OnePot-eiwitzuivering. Bereid de kolom voor zoals beschreven in rubriek 1.4.
5. Om de starterculturen te bereiden, combineert u 20 ml LB-media met 20 μl AMP. Voeg in een steriele 96, 1,3 ml diepe putplaat 300 μL van de media toe in 35 putten. Ent elk van hen met zijn respectievelijke stam, behalve de rekfactor thermo-instabiel (EF-Tu), en sluit de plaat af met een ademend membraan.
   OPMERKING: Ent de plaat met behulp van een replicator met 96 putten (zie Materiaaltabel). Het putvolume van de deep-well plaat en het volume van de startercultuur zijn essentieel. Grotere mediavolumes of kleinere putvolumes zullen leiden tot een andere bacteriële dichtheid als gevolg van inconsistenties in de beluchting.
6. Voor de EF-Tu-cultuur ent u 3 ml LB-media in een kweekbuis van 14 ml met een klikdop. Een enkele 3 ml cultuur voor EF-Tu is voldoende voor één OnePot-expressiecultuur.
7. Incubeer bij 37 °C terwijl u 's nachts bij 260 tpm schudt.

Dag 2:
OPMERKING: Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.

8. Breng 500 ml LB-media en 500 μL AMP over in de steriele verbijsterde kolf.
9. Ent de OnePot PURE-cultuur met 1675 μL van de EF-Tu-cultuur en 55 μL van elk van de culturen van de deep-well plaat(tabel 2).
   OPMERKING: Tijdens deze stap kan de totale eiwitsamenstelling worden aangepast door de inentingsverhoudingen af te stemmen. Zorg ervoor dat het totale inentingsvolume constant blijft op 3,6 ml.
   OPTIONEEL: Om te bevestigen dat alle stammen 's nachts zijn gegroeid, meet u de optische dichtheid van de nachtculturen bij 600 nM (OD₆₀₀) in een 96-well plaat met behulp van een plaatlezer. Gebruik een verdunning van 10x voor de optische dichtheidsmeting.
10. Incubeer de cultuur gedurende 2 uur bij 37 °C met een schudbeweging van 260 tpm, of totdat de OD₆₀₀ van de cultuur 0,2-0,3 bereikt.
11. Induceer de kweek met 500 μL van 0,1 mM IPTG en groei gedurende nog eens 3 uur.
12. Oogst de cellen door centrifugering bij 4 °C en 3220 x g gedurende 10 minuten en bewaar de celkorrel bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Om de timing te optimaliseren, bereidt u de in rubriek 4 beschreven energieoplossing voor tijdens de incubatietijden op dag 2(tabel 1).

Dag 3:

13. Meet de hoeveelheden buffers die nodig zijn voor de zuivering die in de onderstaande stappen wordt beschreven en voeg TCEP toe aan alle buffers zoals aangegeven in aanvullende tabel 2. Bewaar de resterende buffers zonder TCEP bij 4 °C voor toekomstige zuiveringen.
14. Balanceer de geladen kolom (punt 2.4) met 30 ml buffer A. Nadat 25 ml buffer A is doorgegaan, sluit u de kolom vanaf de onderkant. Ga tegelijkertijd verder met stap 2.15-2.17.
15. Ontdooi de cellen en gebruik een serologische pipet om de celkorrel opnieuw te suspenderen in 7,5 ml buffer A.
16. Lyseer de cellen met behulp van een 130 watt sonde sonicator (zie Tabel van materialen, sonde tip diameter: 6 mm) met de volgende parameters: 4 x 20 s puls op, 20 s puls uit, 70% amplitude. Als ultrasoonapparaat succesvol is, wordt de oplossing donkerder(figuur 2).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de cellen op ijs houdt tijdens het ultrasoonapparaat. Plaats de sonde diep genoeg in de oplossing zonder de buis aan te raken. Als er een grote hoeveelheid schuim wordt gegenereerd, wordt de energieoverdracht gedempt. Laat in dat geval het schuim bezinken, laat de sonde dieper in de oplossing zakken en verleng de ultrasoonapparaattijd.
17. Verwijder het celafval door centrifugering bij 21130 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C onmiddellijk na de ultrasoonapparaatvorming. Houd het lysaat op ijs.
18. Voeg het supernatant toe aan de lichtzinnige kolom. Sluit de kolom vanaf de bovenkant en zorg ervoor dat er geen lekkage is. Incubeer de kolom gedurende 3 uur bij 4 °C onder rotatie met behulp van een buisrotatie.
19. Eluteer ongebonden componenten uit de kolom en was met 25 ml buffer A.
20. Was de kolom met 25 ml 25 mM imidazoolbuffer (23,95 ml buffer A en 1,25 ml buffer B).
21. Eluteer de eiwitten met 5 ml 450 mM imidazoolbuffer (0,5 ml buffer A en 4,5 ml buffer B). Houd de eluted eiwitten te allen tijde op ijs.
22. Verdun het eluaat met 25 ml HT-buffer, houd het mengsel op ijs. Voeg 15 ml toe aan een centrifugaalfilter van 15 ml en concentreer tot een volume van 1,5 ml. Voeg de resterende 15 ml toe aan het filter met de geconcentreerde oplossing en concentreer nogmaals tot 1,5 ml.
23. Voeg 10 ml HT-buffer toe aan het geconcentreerde monster en concentreer tot 1 ml. Voeg een gelijke hoeveelheid voorraadbuffer B toe en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Een uitwisselings-/concentratieronde duurt ongeveer 60 minuten draaien bij 3220 x g bij 4 °C.
24. Herstel tijdens de bufferuitwisseling de kolom zoals aangegeven in paragraaf 1.4.

Dag 4:

25. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test zoals beschreven door de leverancier. Concentreer het monster met een 0,5 ml 3 kDa cutoff centrifugaalfilter tot 20 mg/ml.
    OPMERKING: Verdun de eiwitoplossing 25-voudig of 50-voudig vóór de concentratiemetingen om oververzadiging van de Bradford-test te voorkomen.
26. Om de ideale eiwitconcentratie vast te stellen, voert u in dit stadium (rubriek 5.2) een expressietest uit met verschillende concentraties van de eiwitoplossing. Om de titratie uit te voeren, houdt u het totale volume van de oplossing constant en pipetteert u de OnePot-eiwitoplossing, inclusief voorraadbuffer B, in vijf verschillende verhoudingen(aanvullende tabel 7).
27. Controleer de samenstelling van het OnePot PURE-eiwit met SDS-PAGE(Figuur 3A). Verdun 2,5 μL van het monster met 7,5 μL water, meng met 10 μL 2x Laemmli-buffer en laad vervolgens 5 μL en 2,5 μL van de monsters op de gel. Voer de SDS-PAGE uit zoals aangegeven in paragraaf 1.3.3.
28. Aliquot de eiwitoplossing in 50 μL aliquots na verificatie van de expressie en aanpassing van de concentratie. Bewaar de OnePot PURE eiwitoplossing bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Als wordt vermoed dat een eiwitcomponent niet aanwezig is of aanwezig is in een lager dan verwachte concentratie in de OnePot PURE, voer dan de volgende stappen uit.
29. Controleer of de nachtkweek van de betreffende stam in een vergelijkbare snelheid is gegroeid als de andere culturen door optische dichtheidsmetingen (OD₆₀₀) van alle culturen uit te voeren.
30. Voer een aanvullende expressietest van de specifieke stam uit om de expressie van het verdachte eiwit te verifiëren.

3. Ribosoomoplossing

OPMERKING: Er worden twee verschillende ribosoomzuiveringsstrategieën geïntroduceerd, één voor hexahistidine-gelabelde en één voor niet-gelabelde ribosomen. Het grote voordeel van de zuiveringsmethode met his-purification op een standaard affiniteit Ni-NTA zwaartekrachtstroomkolom is dat de zuivering eenvoudig en snel is en geen extra laboratoriumapparatuur vereist, zoals een FPLC-systeem en een ultracentrifuge. De eiwitproductiecapaciteit in OnePot PURE-reacties is echter ongeveer een derde in vergelijking met tag-vrije ribosomen. Kies daarom de methode voor ribosoomproductie op basis van de vraag of een hoge opbrengst belangrijk is voor de gegeven toepassing.

1. His-tagged ribosoom zuivering
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de E. coli RB1-stam, een geschenk van professor Wang (Columbia University, VS)¹⁸. Deze stam heeft een genomische insertie van een hexahistidine-tag op de C-terminus van 50S ribosomaal eiwit (L7 / L12), waardoor zuivering mogelijk is met behulp van een Ni-NTA zwaartekracht-flow kolom. De gebruikelijke opbrengst is ongeveer 0,5 ml ribosomen van 3,45 μM, wat voldoende is voor meer dan vijfhonderd zuivere reacties van 10 μl.

Dag 1:

1. Bereid bacteriekweekmedia en mediasupplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 1.
2. Bereid en steriliseer de benodigde materialen, inclusief pipetpunten, een Erlenmeyer van 5 L en een Erlenmeyer van 100 ml.
3. Bereid buffers en supplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 2. Filter steriliseer alle buffers met flessentopfilters (0,45 μm) en bewaar ze bij 4 °C.

Dag 2:

4. Pipetteer 5 ml hars naar een kolom en bereid de kolom voor zoals gespecificeerd in punt 1.4.
   OPMERKING: Vanwege het hogere volume van de hars duurt de restauratie en zuivering aanzienlijk langer. Gebruik een andere kolom voor ribosoomzuivering om kruisbesmetting te voorkomen en maak deze grondig schoon voor de zuivering.
5. Bereid een nachtkweek van E. coli RB1-stam door 35 ml LB-media te enten in een Erlenmeyer van 100 ml. Incubeer bij 37 °C tijdens het schudden bij 260 tpm.

Dag 3:
OPMERKING: Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.

6. Voeg 2 l LB-media toe aan een steriele kolf van 5 l, ent met 12 ml van de nachtcultuur en incubeer vervolgens gedurende 3-4 uur bij 37 °C terwijl u schudt bij 260 tpm.
   OPMERKING: Voer ook bacteriekrelingen uit in 4 x 500 ml culturen in 1 L verbijsterde kolven.
7. Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 3220 x g en 4 °C. Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik.

Dag 4:

8. Evenwicht tussen de in stap 3.1.4 voorbereide kolom. met 30 ml lysisbuffer.
9. Resuspend de pellet in 20 ml lysisbuffer met behulp van een serologische pipet.
10. Lyse de cellen met een 130 watt sonde sonicator (zie Tabel van materialen, probe tip diameter: 6 mm) op ijs met de volgende parameters: 11 x 20 s puls op; 20 s puls uit, 70% amplitude (zie stap 2.16 voor proceduredetails).
11. Verwijder onmiddellijk na het ultrasoonapparaat het celafval door centrifugeren gedurende 20 minuten bij 21130 x g bij 4 °C. Houd het lysaat op ijs.
12. Laad het supernatant in de kolommen en laat het passeren.
13. Was de kolom met de volgende mengsels van lysis- en elutiebuffers.
    1. Wassen 0: gebruik 30 ml lysisbuffer.
    2. Wassen 1: gebruik 30 ml 5 mM imidazool (29 ml lysisbuffer, 1 ml elutiebuffer).
    3. Wassen 2: gebruik 60 ml 25 mM imidazool (50 ml lysisbuffer, 10 ml elutiebuffer).
    4. Wassen 3: gebruik 30 ml 40 mM imidazool (22 ml lysisbuffer, 8 ml elutiebuffer).
    5. Wassen 4: gebruik 30 ml 60 mM imidazool (18 ml lysisbuffer, 12 ml elutiebuffer).
14. Eluteer de ribosomen met 7,5 ml van de elutiebuffer. Houd de eluted eiwitten te allen tijde op ijs.
15. Voeg 22 μL pure β-mercaptoethanol toe aan 45 ml ribosoombuffer.
    LET OP: β-mercaptoethanol is giftig. Neem veiligheidsmaatregelen en werk in een zuurkast.
16. Voeg het eluaat toe aan een centrifugaalfilter van 15 ml en concentreer tot 1 ml.
17. Voeg 15 ml ribosoombuffer toe aan het geconcentreerde monster en concentreer opnieuw tot 1 ml.
    OPMERKING: Herhaal de vorige stap twee keer.
18. Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik.
    OPMERKING: Een uitwisselingsronde/concentratie duurt ongeveer 60 minuten centrifugeren bij 3220 x g bij 4 °C.
19. Herstel tijdens de bufferuitwisseling de kolom zoals aangegeven in paragraaf 1.4.

Dag 5:

21. Bepaal de ribosoomconcentratie door de absorptie bij 260 nM te meten van een monster verdund 1:100 in ribosoombuffer. Een absorptiewaarde van 10 van de verdunde oplossing komt overeen met 23 μM onverdunde oplossing zoals eerder beschreven¹⁶.
22. Implementeer een eindvoorraadconcentratie van 3,45 μM. Om de concentratie aan te passen, verdunt u de ribosomen met ribosoombuffer of concentreert u ze verder door centrifugering bij 14000 x g in een centrifugaalfilter van 3 kDa 0,5 ml bij 4 °C.
    OPMERKING: Om een optimale systeemexpressie te bereiken, voert u een titratie van de ribosoomconcentratie uit (rubriek 5.2, aanvullende tabel 7).
23. Controleer de ribosoomsamenstelling met SDS-PAGE (figuur 3A) zoals gespecificeerd in rubriek 1.3.3. Verdun 2,5 μL van het monster met 7,5 μL water, meng met 10 μL 2x Laemmli-buffer en laad vervolgens 5 μL en 2,5 μL van de monsters op de gel.

2. Tag-vrije ribosoom zuivering
   OPMERKING: Tag-vrije ribosoomzuivering wordt uitgevoerd met behulp van een FPLC-systeem(Table of Materials)en is gebaseerd op hydrofobe interactiechromatografie met behulp van 2 x 5 ml butylkolommen(Tabel met materialen). Hoewel ribosomen van elke stam kunnen worden gezuiverd, is het gebruik van de E. coli A19 (E. coli Genetic Resources bij Yale CGSC) stam voordelig vanwege de RNase I-deletie²². Voer de zuivering uit bij 4 °C in een koelcel of een koelkast. De gebruikelijke opbrengst is ongeveer 0,5 ml ribosomen van 10 μM, wat overeenkomt met meer dan vijfhonderd PURE-reacties van 10 μL.

Dag 1:

1. Bereid bacteriekweekmedia en mediasupplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 1.
2. Bereid en steriliseer de benodigde materialen, inclusief pipetpunten, een erlenmeyer van 5 l en een erlenmeyer van 100 ml.
3. Bereid buffers en supplementen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 2. Filter steriliseer alle buffers met flessentopfilters (0,45 μm) en bewaar ze bij 4 °C.

Dag 2:

4. Om een nachtkweek van de E. coli A19-stam te bereiden, ent u 35 ml LB-media in een Erlenmeyer van 100 ml. Incubeer bij 37 °C tijdens het schudden bij 260 tpm.

Dag 3:

5. Breng 2 L LB-media over in de steriele verbijsterde kolf van 5 L, ent met 30 ml van de nachtkweek en incubeer vervolgens gedurende 3-4 uur bij 37 °C terwijl u schudt bij 200 tpm.
6. Pellet de cellen door centrifugering bij 4000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspend de pellet in 25 ml suspensiebuffer en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.

Dag 4:

7. Voer stappen 3.2.8-3.2.12 parallel met stap 3.2.13-3.2.19 uit.
8. Ontdooi en lyse de cellen met behulp van een sonde sonicator van 130 watt (zie Materiaaltabel en diameter van de sondepunt: 6 mm) op ijs met de volgende parameters: 12 x 20 s puls op; 20 s puls uit, 70% amplitude (zie stap 2.16 procedure details).
9. Verwijder het celafval onmiddellijk door centrifugering bij 20000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
10. Adem het bovennatuurlijk en meet het volume. Voeg een gelijk volume suspensiebuffer (hoog zout) toe om de uiteindelijke concentratie ammoniumsulfaat aan te passen aan 1,5 M en meng goed.
11. Verwijder het neerslag door centrifugeren bij 20000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
12. Filtreer het supernatant met behulp van een polyethersulfonmembraanspuitfilter van 0,45 μm vóór FPLC-zuivering en verzamel het filtraat in een glazen fles van 100 ml. Houd het supernatant te allen tijde op 4 °C.
13. Stel het FPLC-systeem voor hydrofobe-interactiechromatografiezuivering in met behulp van een dubbele butylkolom (2 x 5 ml) als volgt. Voor deze opstelling verwijst één kolomvolume (CV) naar een volume van 10 ml.
14. Er zijn drie inlaten nodig: twee als bufferlijnen en één als monsterlijn. Vanwege de standaardinstellingen van de luchtreiniger is het handig om de lijnen A1 en B1 te kiezen voor respectievelijk buffer C en buffer D en lijn A2 als voorbeeldlijn. Pas een standaarddebiet van 4 ml/min toe, behalve voor pompwasbeurten (10 ml/min) of tenzij anders aangegeven.
    OPMERKING: Aangezien TCEP een kostbaar reagens is, voegt u het overeenkomstige bedrag pas na de equilibratiestap toe aan buffers C en D.
15. Voer een systeempompwassing uit in 20% ((v/v)) ethanol om het systeem te reinigen en mogelijke verontreiniging van eerdere zuiveringen te verwijderen. Stel handmatig een debiet van 0,2 ml/min in en monteer de kolom. Stop de stroom.
16. Voer een systeempompwassing uit met water. Was de kolom met 3 CV water.
17. Equilibratie: plaats inlaten A1 en A2 in buffer C en inlaat B1 in buffer D zonder TCEP. Voer een pompwassing uit en balanceer de kolom met 4 CV buffer C.
18. Voeg TCEP toe aan buffers C en D.
19. Bereid 15 ml buizen of heldere ronde fractiecollectorbuizen voor op de fractiecollector om 4-5 ml elutiefracties te verzamelen.
20. Laden: Plaats de inlaat A2 in de fles met het gefilterde monster. Laad ongeveer 90% van het monstervolume op de kolom. Verdun het monster met 20 ml TCEP-bevattende buffer C en laad 10 ml van het monster op de kolom. Herhaal de verdunningsstap ten minste tweemaal en laad zoveel mogelijk monster op de kolom. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de machine wordt aangezogen.
21. Wasstap 1: wassen met 3 CV buffer C om de ongebonden componenten te verwijderen.
22. Wassen stap 2: wassen met 5 CV van 80% buffer C en 20% buffer D.
23. Elutie: eluteer het product door 50% buffer C en 50% buffer D toe te passen, met een totaal elutievolume van 5 CV. Verzamel deze fractie in de collectorbuizen.
24. Wasstap 3: Eluteer alle sterk op elkaar inwerkende verontreinigingen met 100% buffer D met een totaal volume van 5 CV.
25. Analyseer het absorptiespectrum van de monsterfractie bij 260 of 280 nM(figuur 4). De eerste piek toont de niet-geabsorbeerde eiwitten die tijdens het laden worden elueerd en de eerste wasstap; de tweede piek toont verontreinigingen die tijdens de tweede wasstap zijn geë elueerd. De derde piek bewaakt het eindproduct en de laatste piek toont de sterk op elkaar inwerkende verontreinigingen. Pool alle monsterfracties die overeenkomen met de derde piek voor verdere verwerking. Houd de eluted eiwitten te allen tijde op ijs.
26. Leg de teruggewonnen fractie voorzichtig over 15 ml van de kussenbuffer in vier ultracentrifugatiebuizen van polycarbonaat. Voeg maximaal 15 ml van het monster toe aan 15 ml van de kussenbuffer. Zorg ervoor dat je het gewicht van de buis goed in balans brengt. Pellet de ribosomen door ultracentrifugatie bij 100000 x g bij 4 °C gedurende 16 uur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen scheuren aanwezig zijn in de ultracentrifugatiebuizen.
27. Reinig en reset de kolom als volgt. Een debiet van 5 ml/min werkt goed. Plaats alle inlaten in het water en voer een pompwas uit. Was de kolom met 2 CV water.
    1. Plaats de inlaat in een NaOH-oplossing van 0,5 M, voer een pompwas uit en was vervolgens de kolom met 3 CV NaOH.
    2. Plaats de inlaat in water, voer een pompwas uit en was de kolom vervolgens in 2 CV water.
    3. Plaats de inlaat in een azijnzuuroplossing van 0,1 M, voer een pompwas uit en was vervolgens de kolom met 3 CV azijnzuuroplossing.
    4. Pomp de kolom wassen en wassen met 2 CV water.
    5. Plaats alle inlaten in 20% ((v/v)) ethanol, voer een pompwasstap uit en bewaar de kolom in 20% ((v/v)) ethanol door deze te wassen met 3 CV van een 20% ((v/v)) ethanoloplossing.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat het systeem nooit droogloopt of lucht aanzuigt. Breng nooit buffer rechtstreeks aan op ethanol, of ethanol om te bufferen. Voeg tussendoor altijd een waterwasstap toe, omdat anders het risico bestaat dat de kolom verstopt. Zorg ervoor dat u voldoende monsterverzamelingsbuizen toevoegt.

Dag 5:

28. Gooi het supernatant weg en was elke pellet voorzichtig, zonder de doorschijnende pellet te verstoren, met 0,5 ml ijskoude ribosoombuffer. Herhaal deze stap twee keer.
29. Resuspend elk van de heldere pellets in 100 μL ribosoombuffer op ijs met behulp van een magnetische roerstaaf (3 mM diameter, 10 mM lengte) op een magnetische roerder met de laagst mogelijke snelheid. Verzamel de geresuspendeerde ribosomen en was de buisjes met nog eens 50 μL ribosoombuffer.
    OPMERKING: De doorschijnende pellet is moeilijk te zien. Was daarom de pellet voorzichtig van de zijkanten van de buis.
30. Bepaal de ribosoomconcentratie door de absorptie bij 260 nM van het monster verdund in een verhouding van 1:100 in ribosoombuffer te meten. Een absorptie van 10 van de verdunde oplossing komt overeen met 23 μM onverdunde oplossing zoals eerder beschreven¹⁶.
31. Implementeer een eindvoorraadconcentratie van 10 μM. Om de concentratie aan te passen, verdunt u de ribosomen met ribosoombuffer of concentreert u ze verder door centrifugeren bij 14000 x g in een 3 kDa centrifugaalfilter bij 4 °C.
    OPMERKING: Om een optimale systeemexpressie te bereiken, voert u ribosoomtitratie uit (rubriek 5.2, aanvullende tabel 7).
32. Controleer de ribosoomsamenstelling met SDS-PAGE (figuur 3A) zoals gespecificeerd in rubriek 1.3.3. Verdun 2,5 μL van het monster met 7,5 μL water, meng met 10 μL 2x Laemmli-buffer en laad vervolgens 5 μL en 2,5 μL van de monsters in de gel.

4. Energie oplossing

OPMERKING: De samenstelling voor de hier geïntroduceerde 2,5x energieoplossing is een voorbeeld van een oplossing die goed werkte voor een standaard TX-TL-reactie. Om de timing te optimaliseren, bereidt u de energieoplossing voor op dag 2. De bereiding van de aminozuuroplossing wordt in detail uitgelegd, gevolgd door de laatste bereidingsprocedure.

1. Aminozuuroplossing
   OPMERKING: Bereid de aminozuuroplossing in bulk. Het bereiden van de hoeveelheid aminozuurvoorraadoplossingen die nodig is voor een eindvolume van ten minste 2000 μL zal de weegfout voor de anders zeer kleine hoeveelheden verminderen. De totale concentratie van de aminozuuroplossing wordt beperkt door de oplosbaarheid van de aminozuren en de respectieve concentraties van de stamoplossing. Bereid voor het standaard PURE-systeem een oplossing met een eindconcentratie van 3,25 mM. Gebruik de berekeningstabel voor aminozuuroplossingen (aanvullende tabel 3) als sjabloon. Gebruik cysteïne in de zoutvorm om voldoende oplosbaarheid te garanderen. Vermijd het gebruik van KOH-gebaseerde aminozuurbereidingsmethoden. Het is mogelijk om de exacte hoeveelheden aminozuren direct af te wegen in de uiteindelijke aminozuuroplossing zonder een stamoplossing voor alle aminozuren te bereiden. Dit is echter uitdagender en minder precies.
   1. Bereid stamoplossingen voor elk aminozuur zoals beschreven in aanvullende tabel 3, behalve voor Tyrosine.
      OPMERKING: Vanwege de verschillende oplosbaarheid van de aminozuren in water, verschillen de respectieve voorgestelde concentraties van de stamoplossing.
   2. Minimale massa [mg] geeft de geschatte minimummassa die nodig is om een voldoende hoeveelheid voorraadoplossing te verkrijgen voor het totale doelvolume, als referentie.
      OPMERKING: De minimale massa wordt berekend met een overschot van 10%.
   3. Voor een eenvoudigere bereiding van de oplossingen, weeg niet de exacte hoeveelheid aminozuur, maar pas in plaats daarvan, voor de beschikbare massa, de hoeveelheid water aan om de gewenste concentratie te bereiken. Bereken de benodigde hoeveelheid gedeoniseerd water (water om toe te voegen [μL]) op basis van de werkelijk ingevulde massa (lichtgele cellen) en de gewenste concentratie met behulp van de spreadsheet in aanvullende tabel 3.
   4. Verdoedig de aminozuurvoorraadoplossingen door vortexing totdat alle neerslag is opgelost. De individuele aminozuurvoorraadoplossingen kunnen gedurende enkele weken bij -20 °C worden bewaard.
      OPMERKING: Sommige aminozuren zijn moeilijk op te lossen in water; het proces kan enige tijd duren.
   5. Weeg de exacte hoeveelheid tyrosine af die nodig is om een eindconcentratie van 3,25 mM rechtstreeks in de buis voor de aminozuuroplossing te verkrijgen.
      OPMERKING: Tyrosine is zeer moeilijk op te lossen in water. Voeg het direct toe in plaats van een voorraadoplossing te bereiden.
   6. Voeg de overeenkomstige hoeveelheden aminozuurvoorraadoplossingen en water toe zoals aangegeven in het laatste volume om [μL] kolom (lichtblauwe cellen) toe te voegen en vortex de oplossing goed. Bewaar de voltooide aminozuuroplossing bij -80 °C tot verder gebruik.
2. Bereiding van de energieoplossing
   OPMERKING: In totaal bevat de 2,5x energieoplossing 0,75 mM van elk aminozuur, 29,5 mM magnesiumacetaat, 250 mM kaliumglutamaat, 5 mM ATP en GTP elk, 2,5 mM CTP, UTP en TCEP, respectievelijk 8,75 mg / ml tRNA van E. coli MRE 600, 50 mM creatinefosfaat, 0,05 mM folinezuur, 5 mM spermidine en 125 mM HEPES. Nieuwe gebruikers bereiden de energieoplossing in kleine hoeveelheden van 200 μL. Bewaar de afzonderlijke oplossingen bereid volgens aanvullende tabel 4 bij -20 °C of -80 °C voor later gebruik.
   1. Ontdooi alle in aanvullende tabel 5 genoemde waterige oplossingen op ijs.
   2. Bereid ondertussen de voorraadoplossingen voor de resterende componenten die in aanvullende tabel 4 zijnvermeld. Bewaar alle oplossingen na de bereiding op ijs.
      OPMERKING: Voeg 500 μL RNase en DNase-vrij water rechtstreeks toe aan de injectieflacon om de gelyofiliseerde tRNA's op te lossen. Meng goed door zachtjes te vortexen; beperk pipetteren om te voorkomen dat RNases worden geïntroduceerd.
   3. Voeg de berekende volumes(aanvullende tabel 5)van voorraadoplossingen en water toe en meng goed met behulp van een vortex. Houd de oplossing te allen tijde op ijs.
   4. Meet de pH van de oplossing door 1 μL op een pH-strip te pipetteren om ervoor te zorgen dat de pH van de oplossing neutraal is.
   5. Gebruik de energieoplossing bij 50-100 μL per buis op ijs en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik. Tijdens het aliquoteren, vortex de belangrijkste voorraad vaak om te voorkomen dat de componenten neerslaan.
      OPMERKING: Voer optioneel een activiteitstest uit van de nieuw gemaakte energieoplossing tegen commerciële energieoplossingen, bijvoorbeeld Oplossing A in PURExpress. Als een aanzienlijk lagere prestatie van het systeem met de energieoplossing wordt waargenomen, kan het optimaliseren van de ionenconcentraties, met name magnesiumionen, door titratie (5-20 mM) voordelig zijn.

5. OnePot PURE reactie

1. DNA sjabloon
   OPMERKING: Eiwitten gecodeerd stroomafwaarts van de T7-promotor kunnen worden uitgedrukt in PURE uit lineair of circulair DNA. Door een lineair DNA-sjabloon te genereren met behulp van extensie PCR, kunnen vervelende kloonstappen worden weggelaten. De lineaire sjablonen voor deze studie werden gegenereerd door PCR zoals hieronder beschreven, met behulp van een high-fidelity DNA polymerase(Table of Materials). Primersequenties, smelttemperaturen en de thermocycler-instellingen die in dit onderzoek worden gebruikt, worden gespecificeerd in aanvullende tabel 6. De voorbereiding van het DNA-sjabloon is niet opgenomen in het dagschema.
   1. Stel een PCR-reactie in zoals aanbevolen door de polymeraseleverancier.
      OPMERKING: Geoptimaliseerde parameters voor een high-fidelity DNA polymerase(Tabel van materialen)zijn weergegeven in aanvullende tabel 6.
   2. Het doelgen (bijv. eGFP) versterken als een lineaire sjabloon van een plasmide of genoom met behulp van genspecifieke primers (500 nM) (voor de parameters, zie aanvullende tabel 6).
   3. De versterking genereert korte uitbreidingen om gloeisequenties te bieden voor de volgende extensie-PCR-stappen.
   4. Controleer de amplicon op een agarose gel voor de juiste maat en zuiverheid.
   5. Gebruik het versterkte DNA als sjabloon voor de volgende uitbreidingsstappen. Stel een reactie in van ten minste 50 μL.
   6. Voer 10 PCR-versterkingscycli uit met de extensieprimers (2,5 nM). Voeg na het voltooien van de versterkingscycli onmiddellijk de uiteindelijke primers (500 nM) toe aan dezelfde reactie en voer 30 cycli uit om het uitgebreide PCR-product te versterken. De smelttemperaturen en primersequenties vindt u in aanvullende tabel 6.
   7. Zuiver de DNA-fragmenten met behulp van een DNA-zuiveringskit en eluteer het DNA in nucleasevrij water in plaats van EDTA-bevattende elutiebuffer.
   8. Controleer het lineaire sjabloon op een agarose-gel voor de juiste maat en zuiverheid.
   9. Meet de DNA-concentratie in ng/μL met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.
2. De PURE-reactie instellen
   OPMERKING: De uiteindelijke reactiesamenstelling is 1x energieoplossing, tag-vrije ribosomen of His-tag ribosomen, OnePot PURE-eiwitten en DNA-sjabloon. De verhouding van het reactievolume bestaat uit 40% energieoplossing, 30% eiwit- en ribosoomoplossing en 30% DNA en water. Typische reactievolumes variëren tussen 5 μL en 25 μL. Kwantificeer de expressie van een fluorescerend eiwit continu op een plaatlezer. Gebruik een Groene Lys in vitro Translation Labeling System, dat fluorescerend gelabeld Lysine-residu opneemt in nieuw gesynthetiseerde eiwitten, om de expressie van niet-fluorescerende eiwitten op een SDS-PAGE-gel te verifiëren. Een voorbeeld reactiesjabloon wordt gegeven in Aanvullende tabel 7 om te helpen bij het opzetten van een PURE celvrije expressiereactie. Cellen in geel geven gebruikersinvoerwaarden aan en cellen in oranje geven extra reagentia aan die optioneel aan de reactie moeten worden toegevoegd. Houd de volumeverhoudingen van de componenten nauwkeurig om de juiste ionenbalans te garanderen. Om bijvoorbeeld een hogere eiwitconcentratie te bereiken, verhoogt u de concentratie van de OnePot-eiwitoplossing; verhoog echter niet het volume eiwitoplossing dat aan de reactie wordt toegevoegd.
   1. Vul de concentratie [ng/μL] en lengte [basenparen] van het DNA in de overeenkomstige gele cellen in de spreadsheet in. Gebruik 2-10 nM DNA voor de reactie.
   2. Vul het gewenste totale reactievolume in μL in.
   3. Haal de benodigde reagentia uit de vriezer en ontdooi ze op ijs.
      OPMERKING: Het opnieuw invriezen van de componenten is mogelijk zonder dat de functionaliteit afneemt. Minimaliseer echter het aantal vries-dooicycli en de tijdmonsters worden zoveel mogelijk op ijs opgeslagen.
   4. Pipetteer de berekende hoeveelheden water, DNA en energieoplossing naar één kant van de PCR-buis of een hoek van een put op de 384-putplaat. Voeg de benodigde hoeveelheid extra reagens aan dezelfde kant toe. Minimaliseer het aantal monsters per experiment om verdamping van het monster en experimentele starttijdvertekening te voorkomen.
      OPMERKING: Het is cruciaal om de energiecomponent fysiek gescheiden te houden van de eiwitcomponenten om voortijdig verbruik van de energiebronnen en lagere opbrengsten te voorkomen.
   5. Pipetteer de berekende hoeveelheden eiwit en ribosoomoplossing naar de andere kant van een PCR-buis of de tegenovergestelde hoek van de 384-putplaat.
      OPMERKING: Gebruik waar mogelijk mastermixen om de impact van pipetteerfouten te verminderen. Na de eerste tests kunnen de ribosoom- en eiwitoplossingen worden gemengd en als één oplossing worden opgeslagen.
   6. Draai gedurende een korte tijd (30 s) om de reactiecomponenten samen te voegen. Om verdamping tijdens plaatlezerexperimenten te voorkomen, voegt u 35 μL vloeibare was toe en sluit u de plaat af met een transparante kit (zie Tabel met materialen).
   7. Incubeer gedurende minimaal 3 uur bij 37 °C.
   8. Voor uitlezing op een plaatlezer meet u elke 2 minuten de fluorescentie-intensiteit op de vereiste golflengte (representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3B).
   9. Voer de volgende stappen uit voor monsters met het label Green Lys.
   10. Incubeer na de celvrije expressie het monster met 0,16 μg/μL RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C om de fluorescerende achtergrond van de Green Lys-etiketteerkit te verwijderen.
       OPMERKING: Gebruik RNase A, omdat andere typen RNases de achtergrond niet goed genoeg verwijderen.
   11. Visualiseer de eiwitexpressie door SDS-PAGE uit te voeren zoals gespecificeerd in paragraaf 1.3.3. Was de onbevlekte gel voorzichtig in gedeïoniseerd water en beeld het af op een fluorescerende imager met een excitatiegolflengte van 488 nm.
   12. Kleur vervolgens de gel met behulp van conventionele Coomassie-kleuringsmethoden. Voor de geschikte parameters, zie punt 1.3.3.
       OPMERKING: Voer een titratie uit van de eiwitoplossing met de aanbevolen ribosoomconcentratie en titreer daarna, indien nodig, ribosomen met de optimale OnePot-eiwitconcentratie. Gebruik de commerciële PURExpress ΔRibosome kit als een positieve controle. Oplossing A, Factor Mix en de ribosoomoplossing komen overeen met respectievelijk de bereide energie, de OnePot-eiwitoplossing en de gezuiverde ribosomen.

Resultaten

Het bovenstaande protocol is ontworpen om het opzetten van het PURE-celvrije TX-TL-systeem in elk laboratorium te vergemakkelijken. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de drie verschillende delen van het PURE-systeem: het OnePot-eiwit, ribosoom en energieoplossing. Een gedetailleerd dagschema, dat de workflow optimaliseert, wordt weergegeven in tabel 1. De workflow is geoptimaliseerd voor de zuivering van His-tagged ribosomen en tijdframes kunnen enigszins verschillen als tagvrije ribosoomzuivering wordt uitgevoerd. Eén preparaat levert een voldoende hoeveelheid PURE voor minimaal vijfhonderd reacties van 10 μL. Bovendien zijn de bereide oplossingen meer dan een jaar stabiel bij -80 °C en zijn ze bestand tegen meerdere vries-dooicycli.

Adequate overexpressieniveaus voor alle stammen zijn cruciaal voor de functionaliteit van de uiteindelijke eiwitoplossing. Figuur 1 toont een succesvolle overexpressie in alle 36 individuele stammen die vervolgens worden gebruikt voor het OnePot-eiwitpreparaat. Variatie in de bandintensiteiten van de over-uitgedrukte eiwitten trad hoogstwaarschijnlijk op als gevolg van een bias in het laden van volumes op de SDS-PAGE-gel. De verwachte eiwitgroottes zijn samengevat in tabel 2. GlyRS en PheRS bestaan uit twee subeenheden van verschillende molecuulgewichten; de overige 34 eiwitten bestaan uit één subeenheid. De sleutel tot de eenvoud en tijdseffectiviteit van dit protocol is de coculturing- en co-zuiveringsstap(figuur 2). De OnePot-eiwitoplossing werd bereid door de verhouding van de EF-Tu-stam ten opzichte van alle andere expressiestammen te verhogen. De totale samenstelling van de uiteindelijke eiwitten werd geanalyseerd door SDS-PAGE(figuur 3A). Uit de gels (lanes 2, 3) valt op dat EF-Tu (43,3 kDa) zoals verwacht in een hogere concentratie aanwezig is dan de andere eiwitten. Hoewel de gel een goede eerste indicatie geeft van eiwitexpressieverhoudingen, is het moeilijk om te bepalen of en op welk niveau elk individueel eiwit tot expressie is gebracht. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om de overexpressie in elke stam te bevestigen voordat u cocultureert, zoals hierboven weergegeven.

Het E. coli-ribosoom is een complexe moleculaire machine die bestaat uit meer dan 50 individuele eiwitsubeenheden²³. Een representatief absorptiespectrum bij 260 nm voor tagvrije ribosoomzuivering is weergegeven in figuur 4; de derde piek is kenmerkend voor een succesvolle ribosoomelutie. Voor beide ribosoomzuiveringsmethoden werd het verwachte looppatroon op de SDS-PAGE-gel (figuur 3A)¹⁸ waargenomen. We hebben wel verontreinigingen waargenomen voor beide zuiveringen, zij het in kleine hoeveelheden (<10%). Met name waren verschillende verontreinigingen aanwezig in de tag-free (lanes 5, 6) en His-tagged (lanes 11, 12) ribosomen als gevolg van de variatie in de methode. Ter referentie van de gebruiker zijn de SDS-PAGE-gels voor de gecombineerde systemen ook inbegrepen (rijstroken 8, 9 en 14, 15).

Ten slotte worden de prestaties van de geprepareerde systemen (figuur 3) met behulp van de verschillende ribosoomvarianten vergeleken. De tijdsbanen van in vitro eGFP-expressie laten zien dat beide PURE-systemen functioneel zijn en fluorescerende eGFP produceren. De OnePot-eiwitoplossing in combinatie met de His-tagged ribosomen, met behulp van de ribosoomconcentratie geoptimaliseerd door titratie, leverde echter slechts een derde van het expressieniveau van de niet-gelabelde ribosoomversie op (figuur 3B). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen toen drie eiwitten van verschillende grootte werden uitgedrukt en gelabeld met behulp van het Green Lys tRNA in vitro labeling systeem(Figuur 3C). Zoals te zien is op de fluorescerende gel, werden producten over de volledige lengte met succes tot expressie gebracht in beide systemen; slechts ongeveer de helft van het expressieniveau werd echter bereikt met het His-tag ribosoomsysteem. Naast de fluorescentie-etikettering zijn de verwachte banden voor alle drie de eiwitten te onderscheiden op een Coomassie-gekleurde gel(figuur 3D). De resultaten tonen aan dat het geïntroduceerde expressiesysteem, dat binnen een week in een laboratorium met standaardapparatuur kan worden bereid, kan worden gebruikt voor de in vitro expressie van eiwitten die stroomafwaarts van de T7-promotor zijn gecodeerd uit lineaire sjablonen.

Figuur 1: Representatieve resultaten voor de overexpressietest voor alle expressiespanningen van het PURE-systeem. Het aantal zuivere eiwitten en de grootte zijn samengevat in tabel 2. Eiwitnummers 21, 24 en 27 zijn gemarkeerd met een ster voor een betere visualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: OnePot eiwitzuivering. De schematische weergave en bijbehorende foto's van alle stappen die betrokken zijn bij de productie van de OnePot-eiwitoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Prestaties van de bereide systemen met behulp van de verschillende ribosoomvarianten. (A) Coomassie blauw gekleurde SDS-PAGE-gels van de OnePot-eiwitoplossing (lanes 2, 3), tagvrije ribosomen zonder eiwitoplossing (lanes 5, 6) en met eiwitoplossing (lanes 8, 9), His-tagged ribosomen zonder eiwitoplossing (lanes 11, 12) en met eiwitoplossing (lanes 14, 15). Per monster werden twee verschillende concentraties geladen. (B) Vergelijking van eGFP-expressie van His-tagged ribosomen en tag-free ribosomen. De fluorescentie-intensiteit van in vitro eGFP-expressie wordt in de loop van de tijd gecontroleerd voor een PURE-reactie met behulp van tagvrije ribosomen (1,8 μM, blauw) en His-tagged ribosomen (0,62 μM, rood). De concentraties van de lineaire sjabloon en de OnePot-eiwitoplossing waren respectievelijk 4 nM en 2 mg / ml. Panelen (C) en (D) tonen de SDS-PAGE gel van eiwitten gesynthetiseerd in OnePot met tag-vrije (1,8 μM, blauw, lanes 3, 4, 5) en His-tag ribosomen (0,62 μM, rood, lanes 6, 7, 8) gelabeld met een GreenLys in vitro labeling kit (C) en gekleurd met Coomassie blauw (D), respectievelijk. De zwarte pijlen geven de verwachte banden van gesynthetiseerde eiwitten aan: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). De lineaire sjabloon- en OnePot-eiwitoplossingsconcentraties waren respectievelijk 4 nM en 1,6 mg / ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Absorptiespectra bij 260 nm. Representatieve resultaten van absorptiespectra bij 260 nm tijdens hydrofobe interactiezuivering van tagvrije ribosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Een dagelijks tijdschema voor de bereiding van alle OnePot PURE-oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: PURE eiwitlijst Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Reagentia. De tabel geeft een overzicht van concentraties, volumes en andere specifieke details van de reagentia en componenten die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Buffers. De spreadsheet bevat de exacte buffersamenstellingen voor eiwit-, tag-vrije ribosoom- en His-tag ribosoomzuiveringen, evenals de concentraties van de stamoplossingen die worden gebruikt voor de bereiding ervan. Daarnaast berekent het de benodigde hoeveelheden componenten op basis van het buffervolume. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Aminozuurberekeningen. De spreadsheet bevat de aminozuren en hun aanbevolen concentratie van stamoplossingen die nodig zijn voor de energieoplossing. Het berekent de hoeveelheid water die aan elk aminozuur moet worden toegevoegd op basis van de werkelijk gewogen massa en berekent ook het volume van de aminozuuroplossing die aan het uiteindelijke aminozuurmengsel moet worden toegevoegd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Voorraadoplossingen voor de energieoplossing. De tabel geeft een overzicht van de concentraties en volumes van voorraadoplossingen die nodig zijn voor de energieoplossing en geeft verdere details aan, inclusief opslagomstandigheden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Energieoplossing. De tabel bevat de componenten van de energieoplossing en hun aanbevolen concentraties. Bovendien berekent het hun vereiste volumes die aan de uiteindelijke oplossing moeten worden toegevoegd op basis van hun voorraadoplossingsconcentraties en het volume van de energieoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 6: PCR. De tabel geeft sequenties en concentraties van de primers die worden gebruikt voor de extensie-PCR en geeft smelttemperaturen en thermocyclerstappen aan die zijn geoptimaliseerd voor een high-fidelity DNA-polymerase. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 7: ZUIVERE reactie. De spreadsheet toont een voorbeeldopstelling van een PURE-reactie. Het vermeldt de gebruikte concentraties en volumes van de componenten voor een PURE-reactie met behulp van tag-vrije ribosomen of His-tag ribosomen. Bovendien berekent het de volumeverhoudingen voor eiwit- en ribosoomtitraties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige, tijd- en kosteneffectieve methode om een veelzijdig PURE-expressiesysteem²⁰ te bereiden op basis van de standaardsamenstelling¹⁵. Door gebruik te maken van het protocol samen met de bijgeleverde dagschema's(tabel 1),kunnen alle componenten in 1 week worden bereid en leveren ze hoeveelheden op die voldoende zijn voor maximaal vijfhonderd 10 μL PURE-reacties. Aangezien de eiwitten die in dit protocol worden gebruikt overexpressie hebben van plasmiden met een hoge kopie en een lage toxiciteit voor E. colihebben, worden goede expressieniveaus waargenomen voor alle vereiste eiwitten(figuur 1). Dit maakt de eenvoudige aanpassing van stammen, en dus ook eiwitsamenstelling in coculturen, mogelijk door simpelweg de verhoudingen van de inentingstammen te wijzigen²⁰. Naast de ribosomale eiwitten bleek de concentratie EF-Tu van fundamenteel belang voor de expressieopbrengst⁶. Veranderingen in de concentratie van de andere eiwitcomponenten hadden daarentegen een relatief lage invloed op de robuustheid van het PURE-systeem^7,24. Door de inentingsverhouding van EF-Tu aan te passen ten opzichte van alle andere componenten, kan daarom een vergelijkbare samenstelling als de standaard PURE-samenstelling worden bereikt en kan een PURE-systeem met een vergelijkbaar rendement^{van 20} worden bereikt. Bij het bereiden van de eiwitoplossing is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle stammen goed groeien en het gecodeerde eiwit na inductie overexpressie(figuur 1).

Ribosoomfunctie is de sleutel tot de algehele prestaties van het PURE-systeem²⁴. In dit protocol worden twee verschillende methoden voor het bereiden van de ribosoomoplossing gedemonstreerd, d.w.z. tag-free en His-tagged ribosoomzuivering. De tagvrije ribosoomzuivering is gebaseerd op hydrofobe interactiechromatografie gevolgd door centrifugering met een sucrosekussen, waarvoor toegang tot een FPLC-zuiveringssysteem en een ultracentrifuge¹⁵vereist is. Daarentegen vereist de methode met behulp van His-tagged ribosomen¹⁸ en zwaartekrachtstroomaffiniteitschromatografiezuivering geen gespecialiseerde apparatuur en kan deze in de meeste laboratoria worden uitgevoerd. Deze laatste methode brengt dus voordelen met zich mee zoals eenvoud en toegankelijkheid. We zagen echter een significant lagere syntheseopbrengst bij gebruik van de His-tagged ribosomen in de OnePot PURE in vergelijking met de tagvrije variant(figuur 3). Op basis van het type toepassing kan deze lagere opbrengst acceptabel zijn.

De energieoplossing biedt de componenten met een laag molecuulgewicht en tRNA's die nodig zijn om in vitro TX-TL-reacties van brandstof te voorzien. Dit protocol biedt een recept voor een typische energieoplossing, die eenvoudig kan worden aangepast op basis van de behoeften van de gebruiker. Samen met tRNA, NTP en creatinefosfaat zijn de overvloed en concentratie van Mg²⁺ ionen cruciaal geweest voor de algehele prestaties van het PURE-systeem^8,omdat ze kritische cofactoren zijn voor transcriptie en translatie. In sommige gevallen kan de titratie van ionen daarom de algehele PURE-prestaties aanzienlijk verbeteren. DNA-integriteit is cruciaal voor PURE-prestaties. Dus, sequentie die het promotorgebied, de ribosoombindingsplaats en het doelgen verifieert en ervoor zorgt dat een adequate DNA-concentratie (<2 nM) zal helpen bij het oplossen van problemen die zich kunnen voordoen tijdens het opzetten van een PURE-reactie.

Het PURE-systeem is een minimaal TX-TL-systeem en specifieke toepassingen kunnen dus extra aanpassingen vereisen²⁵. Deze kunnen het opnemen van verschillende RNA-polymerasen^9,26,chaperones¹³en eiwitfactoren zoals EF-P of ArfA⁸omvatten. Hoewel de expressiestammen voor deze eiwitten in de coculturen kunnen worden opgenomen, kan het afzonderlijk toevoegen aan het voorbereide systeem een betere controle van de vereiste eiwitniveaus bieden. Bovendien is de opname van blaasjes essentieel voor de productie van membraaneiwitten^10,11. Oxiderende in plaats van reducerende omgevingen en een disulfidebindingisomerase vergemakkelijken een goede vorming van disulfidebindingen, die bijvoorbeeld nodig zijn voor secretoire eiwitten¹².

Het is essentieel om ervoor te zorgen dat eventuele extra componenten de reactie niet verstoren. De belangrijkste factoren om op te letten bij het opzetten van een reactie of het toevoegen van andere componenten staan hieronder vermeld. Zorg ervoor dat er geen incompatibele buffers worden gebruikt of dat de ionenconcentraties worden verstoord. Vermijd oplossingen die glycerol, hoge concentraties kalium, magnesium, calciumionen, osmolyten, pyrofosfaat, antibiotica of EDTA bevatten, zoveel mogelijk. Het vervangen van een elutiebuffer door water tijdens DNA-zuivering kan bijvoorbeeld nuttig zijn, omdat EDTA een veel voorkomend additief is in deze buffer. Het leveren van de oplossingen met extra negatief geladen moleculen zoals NTP of dNTP vereist aanpassing van de magnesiumconcentratie 8 , omdat de negatief geladen^moleculenzich gedragen als chelaatvormers en positief geladen moleculen binden. Een neutrale pH is ideaal voor de reactie. Dienovereenkomstig moeten alle componenten worden gebufferd tot de overeenkomstige pH; dit is vooral belangrijk voor zeer zure of basisch moleculen zoals NTP's. Ten slotte zijn temperatuur en volume belangrijke parameters voor de reactie. Om een goede opbrengst te bereiken, moet men een temperatuur rond 37 ° C implementeren, omdat temperaturen onder 34 ° C de opbrengst aanzienlijk zullen verminderen²⁷.

Het is relevant op te merken dat voordat men de OnePot PURE voorbereidt, men rekening moet houden met de doeltoepassing en de bijbehorende vereisten, zoals volume, zuiverheid, gemak van wijziging en opname of weglating van componenten. Voor veel toepassingen zal het systeem een uitstekende keuze zijn, maar andere kunnen opbrengsten, aanpasbaarheid en andere factoren vereisen, die het OnePot-systeem niet kan bieden. Hoe dan ook, het geïntroduceerde protocol zal gunstig zijn voor de voorbereiding van elk zelfgemaakt systeem, omdat alle kritieke stappen voor een dergelijke voorbereiding hier worden samengevat.

Een van de belangrijkste voordelen van het OnePot-systeem is de compatibiliteit met het in de handel verkrijgbare PURExpress-systeem, dat de mogelijkheid biedt om de functionaliteit en integriteit van alle componenten afzonderlijk te testen door achtereenvolgens elke PURExpress-component te vervangen door zijn OnePot-equivalent. De voordelen van het OnePot PURE-systeem, zoals tonijnbaarheid en eenvoudige, snelle en kosteneffectieve bereiding, zullen celvrije TX-TL toegankelijk maken voor meer laboratoria over de hele wereld en bijdragen aan het uitbreiden van de implementatie van dit krachtige platform in celvrije synthetische biologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x Tris/Glycine/SDS buffer	Bio-Rad Laboratories	1610732
15 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0309
384-well Black Assay Plates	Corning	3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels	Bio-Rad Laboratories	4561096
50 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate	Nunc	260252
Azijnzuur, 99,8 %	Acros	222140010
Äkta purifier	GE Healthcare		zuivering van tag-vrije ribosomen
AMICON ULTRA 0,5 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC900324
Aminozuren	Sigma-Aldrich	LAA21-1KT
Ammoniumchloride	Sigma-Aldrich	09718-250G
Ammoniumsulfaat	Sigma-Aldrich	A4418
Ampicillin	Condalab	6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard	ThermoFisher	LC5928
Breathe-Easy sealing membrane	Diversified Biotech	Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate	Beckman	355631	zuivering van tag-vrije ribosomen
Chill-out Liquid Wax	Bio-Rad Laboratories	CHO1411
Creatinefosfaat	Sigma-Aldrich	27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped)	Zymo	ZYM-D4034-200TS
DTT	SantaCruz Biotech	sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns	Bio-Rad Laboratories	7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes	VWR International / Eppendorf	525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap	Falcon	352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass	Scilabware	9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System	Promega	L5001	optioneel
Folinezuur	Sigma-Aldrich	PHR1541
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757-1L
HEPES	Gibco	15630-056
HiTrap Butyl HP Column	GE Healthcare	28411005	zuivering van tag-vrije ribosomen
IMAC Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-0921-07
Imidazool	Sigma-Aldrich	I2399
InstantBlue	Expedeon	ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)	Alfa Aesar	B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer	Sigma-Aldrich	S3401-1VL
Lysogenicum bouillon (LB) media	AppliChem	A0954
Magnesiumacetaat	Sigma-Aldrich	M0631
Magnesiumchloride	Honeywell Fluka	63020-1L
Nikkelsulfaat	Alfa Aesar	15414469
NTP	ThermoFisher	R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	ThermoFisher	F530S
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P5405-1KG
Kaliumglutamaat	Sigma-Aldrich	49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	NEB	E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit	NEB	E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent	Bio-Rad Laboratories	5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units	ThermoFisher	564-0020
RNaseA oplossing	Promega	A7973
SealPlate film	Excel Scientific	Z369659-100EA
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	6203
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)fosfin -hydrochloride)	Sigma-Aldrich	646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman	355631
Trichloroazijnzuur	Sigma-Aldrich	T0699
Tris base	ThermoFisher	BP152-500
tRNA	Roche	10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80	Beckman		zuivering van tag-vrije ribosomen
Whatman GD/X syringe filters	GE Whatman	WHA68722504
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100mL