Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Anterieur segment orgaancultuurplatform voor het volgen van open globe verwondingen en therapeutische prestaties

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62649

⸱

25 augustus 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

In dit artikel

Samenvatting

Open globe oogletsel kan onbehandeld blijven voor meerdere dagen in landelijke of militair-relevante scenario's, wat resulteert in blindheid. Therapeutica zijn nodig om verlies van gezichtsvermogen te minimaliseren. Hier beschrijven we een orgaancultuur open globe letselmodel. Met dit model kunnen potentiële therapieën voor het stabiliseren van deze verwondingen goed worden geëvalueerd.

Samenvatting

Open globe verwondingen hebben slechte visuele resultaten, vaak resulterend in permanent verlies van het gezichtsvermogen. Dit is deels te wijten aan een langdurige vertraging tussen letsel en medische interventie in landelijke omgevingen en militaire medische toepassingen waar oogheelkundige zorg niet direct beschikbaar is. Onbehandelde verwondingen zijn vatbaar voor infectie nadat het oog zijn waterdichte afdichting heeft verloren, evenals verlies van levensvatbaarheid van weefsel als gevolg van intraoculaire hypotensie. Therapieën om open globe-verwondingen tijdelijk te verzegelen, indien goed ontwikkeld, kunnen mogelijk de intraoculaire druk herstellen en infectie voorkomen totdat de juiste oogheelkundige zorg mogelijk is. Om de productontwikkeling te vergemakkelijken, wordt hier het gebruik van een open globe-letselplatform voor anterieure segmentorgaankweek beschreven voor het volgen van therapeutische prestaties gedurende ten minste 72 uur na het letsel. Varkens anterieur segmentweefsel kan worden gehandhaafd in op maat ontworpen orgaankweekschalen en worden gehouden op fysiologische intraoculaire druk. Prikletsels kunnen worden gecreëerd met een pneumatisch aangedreven systeem dat letselgroottes tot 4,5 mm in diameter kan genereren, vergelijkbaar met militair relevante letselmaten. Verlies van intraoculaire druk kan worden waargenomen gedurende 72 uur na het letsel, wat de juiste verwondingsinductie en verlies van de waterdichte afdichting van het oog bevestigt. Therapeutische prestaties kunnen worden gevolgd door toepassing op het oog na letselinductie en vervolgens het volgen van de intraoculaire druk gedurende meerdere dagen. Verder is het anterieure segmentletselmodel van toepassing op veelgebruikte methoden voor het functioneel en biologisch volgen van de fysiologie van het voorste segment, zoals het beoordelen van transparantie, oculaire mechanica, gezondheid van het hoornvliesepitheel en levensvatbaarheid van weefsel. Over het algemeen is de hier beschreven methode een noodzakelijke volgende stap in de richting van het ontwikkelen van biomateriaaltherapieën voor het tijdelijk afdichten van open globe-verwondingen wanneer oogheelkundige zorg niet direct beschikbaar is.

Inleiding

Open globe (OG) letsels kunnen leiden tot permanent verlies van gezichtsvermogen wanneer ze niet worden behandeld of op zijn minst gestabiliseerd na letsel1. Vertragingen komen echter veel voor in afgelegen gebieden waar toegang tot oogheelkundige interventie niet direct beschikbaar is, zoals in landelijke gebieden of op het slagveld in militaire scenario's. Wanneer behandeling niet direct beschikbaar is, is de huidige zorgstandaard om het oog te beschermen met een stijf schild totdat medische interventie mogelijk is. In de militaire geneeskunde is deze vertraging momenteel tot 24 uur, maar er wordt verwacht dat deze zal toenemen tot 72 uur in toekomstige gevechtsoperaties in stedelijke omgevingen waar luchtevacuatie niet mogelijk is2,3,4. Deze vertragingen kunnen nog langer zijn in landelijke, afgelegen civiele toepassingen waar de toegang tot oogheelkundige interventie beperkt is5,6. Een onbehandeld OG-letsel is zeer gevoelig voor infectie en verlies van intraoculaire druk (IOP) als gevolg van de waterdichte afdichting van het oog die wordt aangetast7,8. Verlies van IOP kan de levensvatbaarheid van het weefsel beïnvloeden, waardoor het onwaarschijnlijk is dat een medische interventie het gezichtsvermogen herstelt als de vertraging tussen letsel en therapeutisch te lang is9.

Om de ontwikkeling van eenvoudig toe te passen therapieën voor het afdichten van OG-verwondingen mogelijk te maken totdat een oogheelkundige specialist kan worden bereikt, is eerder een benchtop OG-letselmodel ontwikkeld10,11. Met dit model werden snelle verwondingen gecreëerd in hele varkensogen, terwijl IOP werd opgevangen door druktransducers. Therapeutica kunnen vervolgens worden toegepast om hun vermogen te beoordelen om de OG-verwondingsplaats af te sluiten12. Omdat dit model echter hele varkensogen gebruikt, kan het alleen de onmiddellijke therapeutische prestaties beoordelen zonder een manier om de prestaties op langere termijn te volgen in het mogelijke 72-uursvenster waarin het therapeutisch de verwondingsplaats moet stabiliseren totdat de patiënt gespecialiseerde zorg bereikt. Als gevolg hiervan werd een anterieure segment orgaancultuur (ASOC) OG-letselmodel ontwikkeld en gedetailleerd in dit protocol als een platform voor het volgen van therapeutische prestaties op lange termijn13.

ASOC is een veel gebruikte techniek voor het onderhouden van avasculair weefsel van het voorste segment, zoals het hoornvlies, gedurende meerdere weken na enucleatie14,15,16,17. Het voorste segment wordt onder fysiologische IOP gehouden door vloeistof met fysiologische stroomsnelheden te perfuseren en het trabeculaire meshwork-uitstroomgebied, het weefsel dat verantwoordelijk is voor het reguleren van IOP, te behouden tijdens ASOC-opstelling18,19. Het ASOC-platform kan weefsel fysiologisch onderhouden, een OG-letsel induceren met behulp van een pneumatisch aangedreven apparaat, een therapeutisch apparaat toepassen en letselstabilisatie volgen gedurende ten minste 72 uur na het letsel13.

Hier biedt het protocol een stapsgewijze methodologie voor het gebruik van het ASOC-platform. Eerst wordt beschreven hoe het ASOC-platform moet worden opgezet en gefabriceerd. Vervolgens beschrijft het protocol hoe het voorste segment aseptisch kan worden ontleed en het trabeculaire netwerk kan worden onderhouden, gevolgd door het opzetten van voorste segmentweefsel in op maat gemaakte orgaankweekschalen. Vervolgens wordt beschreven hoe u open globe-verwondingen kunt creëren en onmiddellijk na het letsel therapeutisch kunt toepassen. Ten slotte biedt het protocol een overzicht van karakteriseringsparameters die mogelijk zijn voor gebruik met deze methode die functionele, mechanische en biologische eigenschappen van het oog beoordeelt en hoe goed het letsel werd gestabiliseerd. Over het algemeen biedt dit model een broodnodig platform om de productontwikkeling voor het stabiliseren en behandelen van openbolletsels te versnellen en de slechte prognose van het gezichtsvermogen na letsel te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voordat u dit protocol uitvoert, moet u zich ervan bewust zijn dat er wettelijke en ethische vereisten zijn voor het gebruik van dieren in onderzoek en training. Als levende dieren worden gebruikt voor de bron van oogweefsel, vraag dan goedkeuring aan de lokale ethische of wettelijke autoriteit (IACUC of ethische commissie, enz.) voordat u begint. Als er enige vraag is bij het verkrijgen van goedkeuring voor het gebruik van dieren, ga dan niet verder. We hebben eerder vastgesteld en gerapporteerd dat verse varkensogen die binnen 24 uur postmortem zijn verkregen en gebruikt, het dichtst bij in vivo fysiologie liggen en het goed deden voor deze studies (Animal Technologies, Tyler, TX, VS)10,13. Er werden geen levende dieren gebruikt in dit protocol, waarbij een weefselverkoper werd gebruikt om binnen 24 uur weefsel te verkrijgen.

OPMERKING: Voordat het weefsel binnenkomt, fabriceert u de orgaankweekschotels(Aanvullend Protocol 1),klemringen(Aanvullend Protocol 1),schotelstandaards(Aanvullend Protocol 1),gegevensverzameling van drukomvormers(Aanvullend Protocol 2)en pneumatisch prikplatform(Aanvullend Protocol 3). Steriliseer de gerechten, gereedschappen en benodigdheden en bereid de werkgebieden voor. Het is handig om een niet-steriel gebied te hebben om grove dissectie op de ogen uit te voeren, omdat ze meestal worden geleverd met bindweefsel, extra orbitaal weefsel bevestigd. Voer deze eerste stappen uit op een open, schoon werkoppervlak en breng de ogen vervolgens aseptisch over in een BSC II-kast voor microdissectie (kast # 1). Optimaal is de BSC II-kast die wordt gebruikt voor microdissectie gescheiden van de BSC II-kast (kast # 2) om de luchtstroom te minimaliseren en de werkruimte te maximaliseren. Stel de microdissectiekast in met een ontleedmicroscoop en een manier om het werkoppervlak (camera of oculairs die uit de kast steken) te visualiseren.

1. Sterilisatiestappen, benodigdheden (zie tabel met materialen voor meer informatie) en installatie

  1. Bereid en gassteriliseer de volgende items (1 kit voor elk oog): ASOC-schotel, klemring, twee vloeistofconnectoren met O-ringen, twee 18 G naaldnaven, vier schroeven, twee lengtes PE-100-slang (lengte van de afstand moet lang genoeg zijn om zich uit te strekken van de schotel in de incubator naar de spuitpomp en de gegevensverzameling van de drukomvormer), twee 18 G 90° gebogen naaldnaven, twee 3-weg kleppen.
  2. Bereid en autoclaaf de volgende kits.
    1. Bereid en autoclaaf de microdissectie-instrumentenset voor, met daarin een paar fijne tangen, een Vannas-schaar, een middelgrote tang, een grote schaar, wattenstaafjes en een scheermesje of scalpel.
    2. Bereid en autoclaaf de assemblage-instrumentenset voor, met één medium getande tang, één chirurgische schaar en één L-toets.
    3. Bereid en autoclaaf de dagelijkse kit (hoeveelheid: één per dag cultuur), met één L-sleutel om klemringen elke dag aan gerechten vast te maken als dat nodig is.
    4. Autoclaaf vier bekers van 100 ml voor het desinfecteren en opslaan van ogen en voorste segmenten.
    5. Autoclaaf de punctie objecten.
  3. Verzamel de volgende steriele voorwerpen: Petrischaaltje (1 schaal/oog), gaas (1-2/oog), schotelstandaard, 20 ml spuiten (1/oog), 10 ml spuiten (1/oog), nylon spuitfilters (1/oog).
  4. Bereid steriele media voor: DMEM met 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicine, 1x Antibioticum-Antimycotisch (AA; ongeveer 30-40 ml volledige media/oog).
  5. Bereid AA-PBS voor: PBS met 1x AA (~ 500 ml).
  6. Bereid het grove dissectiegereedschap voor: reinig en droog grote chirurgische scharen en tangen.
  7. Stel de niet-steriele dissectiewerkplek in: verzamel benodigdheden uit een gereedschapspakket voor grove dissectie, geucleeerde varkensogen ondergedompeld in PBS en op ijs, chirurgisch gordijn, bekerglas van 100 ml met PBS. Leg het chirurgische gordijn en de items die nodig zijn voor grove dissectie.
  8. Stel de steriele dissectiewerkplek in: verzamel benodigdheden uit microdissectie-instrumentenkit, steriel gaas, ontleedmicroscoop, betadineoplossing, steriel PBS, steriele media, vier gesteriliseerde bekers van 100 ml, steriele petrischaal. Aseptisch over te zetten naar BSC II kabinet #1. Stel de kast in voor het visualiseren van ogen op de ontleedmicroscoop.
  9. Stel de ASOC-assemblagewerkruimte in: verzamel gasgesteriliseerde kits (schotelkit en dekselkit), assemblage-instrumentenset, steriele media, schotelstandaards, steriele petrischalen, steriele spuiten en spuitfilters. Aseptisch over te zetten naar BSC II kabinet #2. Stel de kast in voor schotelmontage.
  10. Wanneer de ogen gestabiliseerd zijn en klaar zijn voor punctie (72 uur na de installatie), breng ze aseptisch over naar een BSC II-kast. Stel de OG-letselinductiewerkruimte in: pneumatisch aangedreven letselinductieapparaat (assemblage beschreven in Supplemental 3) en Lab Jack en cross-tracking vise om de ASOC-schotel vast te houden.

2. Dissectie van weefsel

  1. Bereid het varkensweefsel voor met behulp van een niet-steriele dissectiewerkplek.
    1. Koop enucleated varkensogen van een lokaal slachthuis, dierstudies of verkoper. Houd de ogen tijdens de levering op ijs ondergedompeld in PBS en gebruik het onmiddellijk na ontvangst.
    2. Snijd het extraorbitale weefsel weg en snijd het bindvlies af, waardoor alleen de corneosclerale schaal en oogzenuw overblijven. Voer de dissectie uit onder niet-steriele omstandigheden met een grote chirurgische schaar en tang in een grove dissectietool.
    3. Plaats de ogen terug in verse PBS op ijs totdat alle ogen die nodig zijn voor de experimentele opstelling voorlopig / grof zijn ontleed.
    4. Dompel de ogen gedurende 2 minuten onder in 10% betadine-oplossing in gesloten containers en breng aseptisch over op BSC II-kast #1. Voer alle volgende werkzaamheden uit onder steriele omstandigheden om verontreinigingen tijdens de installatie te minimaliseren.
  2. Ontleed steriel anterieure segmenten.
    1. Breng na 2 minuten in betadineoplossing de ogen over in drie seriële wasbeurten van steriele AA-PBS om overtollige betadineoplossing van het oculaire oppervlak te verwijderen met behoud van steriliteit van het oculaire weefsel. Houd na drie wasbeurten het weefsel in AA-PBS tot verder gebruik.
    2. Hemisect het oog met behulp van een scheermesje / scalpel en een gebogen schaar. Plaats het oog op een met AA-PBS doordrenkt gaas en maak een incisie met een steriel scheermesje of scalpel in de buurt van de evenaar van het oog (60/40 split met 40 aan de voorste kant). Gebruik een gebogen chirurgische schaar om het oog te zoomen om het voorste oog (hoornvlieshelft) te isoleren.
      OPMERKING: De snede rond het voorste segment moet continu zijn om gekartelde, ruwe randen in de sclera te voorkomen die vloeistoflekken veroorzaken na installatie in de orgaancultuur.
    3. Gebruik microscissors als schop om glasvochthumor uit het voorste segment te scheppen. Verwijder de lens uit het voorste segment met behulp van microscissors. Laat de voorste segmenten in AA-PBS tot verdere dissectiestappen.
      OPMERKING: Alle ogen die zullen worden ontleed, kunnen bij deze stap worden vastgehouden en één voor één door de rest van het dissectieproces worden genomen.
    4. Snijd met een ontleedmicroscoop de iris geleidelijk terug tot iriswortel, radiaal totdat trabeculair meshwork (TM) zichtbaar is. De TM is een gepigmenteerd weefsel dat bestaat uit vezels die omcirkeld zijn georiënteerd rond de corneosclerale schaal. Zorgvuldige sneden in de iris in de richting van de iriswortel zullen de diepte van de TM onder het weefsel blootleggen.
    5. Snijd 360° rond de iris op dezelfde diepte als de eerste snede in het weefsel om het hele TM-gebied bloot te leggen. Ruim eventuele resterende resterende irisbedekking TM indien nodig op.
    6. Trim de ciliaire lichaamsresten achter de TM, waardoor slechts een dunne band van weefsel achter het TM-gebied overblijft (ongeveer 1 mm).
    7. Plaats het ontleedde voorste segment (AS) in media totdat het verder wordt ingesteld in ASOC in BSC II-kast #2.
      OPMERKING: Alle ogen kunnen op dit punt worden vastgehouden voorafgaand aan de ASOC-installatie als een enkele gebruiker dissectie en orgaancultuurschaalassemblage uitvoert.

3. Het opzetten van voorste segmenten in orgelcultuurschalen

  1. Plaats een enkele AS in een petrischaaltje met AS omgekeerd (cup up). Gebruik een wattenstaafje, maak het nat in de media en dep voorzichtig in het midden van het hoornvlies om pigment te verwijderen. Gebruik een tang om het oog vast te houden en hetzelfde wattenstaafje veeg het wattenstaafje rond de sclera om extra pigment te verwijderen.
  2. Keer de AS om en plaats het bovenste onderste deel van de schaal over het verhoogde gebied, centreer het hoornvlies over het verhoogde gebied in het gerecht. Plaats de klemring bovenop de nieuw geplaatste AS.
  3. Plaats vier schroeven in de bijbehorende gaten om de ring op zijn plaats te houden met de AS onder de ring. Draai de schroeven voorzichtig met de hand vast met de L-toets.
    OPMERKING: De aanscherpingsstap zal dagelijks tijdens het experiment plaatsvinden, dus het doel van de eerste aanscherping hier is om ervoor te zorgen dat de media niet lekken terwijl wordt voorkomen dat de klemring wordt verbroken.
  4. Plaats met een steriele petrischaalset de bovenkant over de schaal en keer de opstelling om. Bevestig de schotelstandaard. Bevestig de vloeistofconnectoren met O-ringen aan schroefdraadpoorten aan de onderkant van de schotel.
  5. Bevestig aan één vloeistofconnector een 18 G 90° gebogen naaldnaaf, een lengte van de slang, een naaldnaaf van 18 G, een nylon spuitfilter, een driewegklep en een spuit van 20 ml gevuld met media.
  6. Bevestig aan de tweede vloeistofconnector een 18 G 90 ° graden gebogen naaldnaaf, lengte van de slang, een naaldnaaf van 18 G, een driewegklep en het vatgedeelte van een steriele spuit van 10 ml (dit zal fungeren als een reservoir om vloeistof en bellen van de ASOC op te vangen).
  7. Met driewegkleppen die op de juiste manier openstaan voor de spuiten, duwt u de media voorzichtig door het systeem met behulp van de fluidics-connectorpoort die in stap 3.5 is geïdentificeerd om de AS op te blazen, de media in de slang en uiteindelijk het reservoir te vullen.
    OPMERKING: Als er media in de ASOC-schotel lekken, wordt de AS niet stevig genoeg vastgezet met de klemring.
  8. Verwijder bubbels door de media voorzichtig in de schaal te duwen en de schaal om te keren om de bubbels eruit en in het reservoir te duwen.
  9. Plaats de schaal en ga rechtop staan. Plaats het onderste gedeelte van een petrischaaltje onder de voeten van de standaard, zorg ervoor dat u de slang niet verstrikt.

4. Starten van anterieure segment orgaancultuur

  1. ASOC is nu klaar voor incubatie. Plaats de ASOC-schaal in de celkweekincubator (37 °C, 5% CO2). Zorg ervoor dat de hoogte van de ASOC-schotel in de incubator boven de drukomvormers bekend is en dat er rekening mee wordt gehouden om de IOP nauwkeurig te berekenen(Aanvullend Protocol 4).
  2. Leid de buisleidingen naar buiten door de onderkant van de 37 °C, 5% CO2 couveusedeur, zodat ze het openen en sluiten van de deur niet verstoren. Bevestig de spuit van 20 ml aan de spuitpomp die is ingesteld op 2,5 μl/min.
  3. Plaats de buisleiding met het reservoir bij het drukomvormerinstrument. Sluit de 3-weg klep aan de zijkant aan op de opstelling van de drukomvormer terwijl pbs door de lijn stroomt om te voorkomen dat luchtbellen de buisleidingen binnendringen.
    OPMERKING: Leeg de PBS uit de reservoirs nadat het systeem is ingesteld om de kans op reservoirbesmetting met microbiële groei voor de duur van de orgaankweek te verminderen.
  4. Start IOP-gegevensverzameling door er eerst voor te zorgen dat er een microSD-kaart aanwezig is voor het opslaan van gegevensbestanden. Schakel vervolgens de instelling van de drukomvormer in om te beginnen met het verzamelen van gegevens.
    OPMERKING: Details voor het instellen van de gegevensverzamelingsinrichting voor drukomvormers zijn opgenomen in Aanvullend Protocol 2.

5. Dagelijks onderhoud van ASOC

  1. Nadat de ASOC 24 uur de tijd heeft gehad om te balanceren, haalt u de schotels uit de 37 °C, 5% CO2 incubator en plaatst u ze in de BSC II-kast.
    OPMERKING: Bij het verzamelen van drukgegevens zien deze tijdsperioden eruit als pieken omdat de ASOC's uit de incubator worden verwijderd (hoogteverandering) en in de kast worden aangepast.
  2. Controleer op lekken onder elk schaaltje op de petriplaat. Controleer indien aanwezig op strakke vloeistofverbindingen onder de schotel en draai deze indien nodig opnieuw aan. Controleer op lekken in het afschotelblad met behulp van een steriele L-sleutel om de schroeven in de klemring aan te draaien.
    OPMERKING: Het AS-scleraweefsel zal de dikte met 24 uur comprimeren en verminderen en de klemring moet worden aangedraaid.
  3. Aspirateer de media goed uit het gerecht.
    OPMERKING: Het trabeculaire gaaswerk filtert vloeistof uit de media die in de ASOC worden gepompt. Daarom zullen media aanwezig zijn in de ASOC-schotel langs de randen.
  4. Herhaal stap 3.7 en 3.8 om opgesloten luchtbellen te verwijderen.
  5. Vul spuiten op de spuitpompen, zorg ervoor dat de spuitpompen werken en bevestig de uitlijning van kleppen voor perfusie in de ASOC. Breng de ASOC-schaal terug naar de incubator van 37 °C, 5% CO2.
    OPMERKING: Optimaal moeten deze stappen dagelijks worden uitgevoerd. Het gebruik van een startvolume van 20 ml media, het asoc-schotelputvolume en een pompsnelheid van 2,5 μl/min moeten echter voldoende zijn om het systeem enkele dagen ongestoord te laten werken.

6. OG-letselinductie met pneumatisch aangedreven lekinrichting

OPMERKING: De constructie van de pneumatische prikinrichting wordt beschreven in Aanvullend Protocol nr. 3. OG-letsels worden geïnduceerd nadat IOP is gestabiliseerd, wat normaal gesproken na 3 dagen in cultuur optreedt. Aanvaardbare IOP-waarden zijn 5-20 mmHg op basis van fysiologische IOP, die kan worden bepaald door de IOP-gegevensbestanden te evalueren of LED-indicatoren in het drukmeetsysteem in te stellen zoals beschreven in aanvullend protocol 2.

  1. Bereid de BSC II-kast voor op OG-letselinductie zoals beschreven in stap 1.10. Sluit het prikplatform aan op een persluchtleiding. Bevestig het steriele prikobject aan de klauwplaat.
    OPMERKING: Een luchtcompressor kan worden gebruikt om het apparaat van stroom te voorzien, maar tank perslucht of ingebouwde laboratoriumleidingen kunnen voldoende zijn als de druk groter is dan 50 psi.
  2. Stel de drukregelaar op het lekplatform in op 50 psi voor voldoende lekkracht op objecten met een diameter tot 4,5 mm. Plaats de cross-tracking vise op de laboratoriumaansluiting voor het prikplatform om de ASOC-schotel vast te houden tijdens de inductie van het letsel.
  3. Verwijder de ASOC-opstelling van 37 °C, 5% CO2-incubator en plaats in de cross-tracking vise loodrecht op het prikplatform (figuur 2) nadat u het deksel hebt verwijderd en opzij hebt gezet. Houd het voorste segment perfuserend, maar sluit de 3-weg kleppoort af naar de drukomvormer om schade aan de transducer door overdruk te voorkomen.
  4. Verleng de zuigerarm tot de maximale afstand en plaats de hoornvliestop binnen 1 mm van het prikobject. Trek de zuigerarm in en breng het voorste segment 1 cm dichter bij het prikobject.
    OPMERKING: Deze afstand is geoptimaliseerd voor zeer efficiënte letselinductie zonder de ASOC-schotel te raken.
  5. Vuur het prikapparaat af door het in te schakelen en het magneetventiel te openen met de tweede schakelaar op het apparaat. Als u het apparaat wilt intrekken, drukt u nogmaals op de tweede schakelaar om het prikapparaat uit het oog te verwijderen. Controleer de juiste letselinductie door visuele inspectie en media die uit de verwondingsplaats lekken.
  6. Verwijder asoc gerecht van de vise; plaats het deksel terug op de schotelassemblage en open de vloeistofleiding naar de drukomvormer. Plaats de ASOC terug in de 37 °C, 5% CO2 incubator.
    OPMERKING: Op dit punt kan therapeutisch worden toegepast op de AS om de werkzaamheid ervan voor het afdichten van OG-verwondingen te beoordelen.

7. Asoc uit de cultuur verwijderen

OPMERKING: Afhankelijk van de eindpuntanalyse (zie representatieve resultaten voor mogelijke eindpuntmethoden), moet de AS in de ASOC-schotel opgeblazen blijven, terwijl andere methoden AS-weefsel vereisen dat uit de kweekkamer wordt geïsoleerd. De onderstaande methodologie beschrijft hoe AS uit de orgelcultuurschalen te halen en de rest van de opstelling te verwijderen.

  1. Haal de ASOC-schalen uit de incubator 37 °C, 5% CO2. Sluit de 3-wegklep naar de spuit en het reservoir en koppel de slang los van het systeem. Gooi de spuit, het reservoir en het filter weg. Plaats de 3-weg kleppen, slangen en naaldnaven in een aparte container voor wassen en steriliseren.
  2. Koppel de naaldnaven los van de vloeistofaansluitingen aan de onderkant van de schaal. Onthread de fluidic connectoren en o-ringen. Plaats alle items in een container om te wassen en te steriliseren.
  3. Verwijder de vier schroeven van de klemring met behulp van de L-toets. Verwijder voorzichtig de klemring.
  4. Verwijder met een tang de AS uit de schotel en plaats deze, afhankelijk van eindpuntanalyse en beeld, in fixeerf of geschikt biologisch gevaarlijk afval.

8. IOP data analyse

  1. Sluit de microSD-kaart aan op een computer om het .txt bestand met gegevens van de meest recente experimentele run te verwijderen.
    OPMERKING: Het bestand heeft een naam in de code die de microcontroller bestuurt en moet voor elk experiment worden bijgewerkt (zie Aanvullend Protocol 2).
  2. Importeer de gegevens in een spreadsheet.
  3. Organiseer de gegevens in 12 kolommen: tijd (in min) en mV-signaal voor elk van de 11 drukomvormerkanalen. De eerste tien kanalen komen overeen met tien ASOC-experimentele opstellingen. Het laatste transducersignaal is voor een sensor die open is voor lucht als een regelkanaal om te bevestigen dat het mV-signaal niet is veranderd als gevolg van veranderingen in het ingangssignaal. Plot controlekanaal versus tijd om te bevestigen mV-signaal was overal consistent.
  4. Zet de mV-signalen voor tien kanalen om in mmHg met behulp van helling-interceptvergelijkingen die worden gegenereerd uit de initiële kalibratie van elke sensor (zie Aanvullend Protocol 4).
  5. Plot tijd (converteren naar dagen om gegevensinterpretatie te vereenvoudigen) versus elk van de tien kanalen om te bepalen hoe de IOP fluctueerde gedurende het experimentele tijdsverloop.
  6. Bepaal de gemiddelde IOP-waarden op belangrijke punten in de gegevens om de waarden tussen elk gemakkelijker te vergelijken en hoe ze worden gewijzigd voor en na og-letselinductie. Gemiddelde 2-3 uur gegevens voor elk interval van 24 uur om de IOP op elke dag van ASOC te bepalen.
    OPMERKING: Representatieve IOP-resultaten worden weergegeven in figuur 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beelden gemaakt via Optical Coherence Tomography (OCT) worden getoond voor OG-gewonde ogen om te illustreren hoe een succesvolle blessure-inductie eruit ziet. Figuur 3 toont beelden voor controle en OG gewond AS-weefsel onmiddellijk na verwonding en 72 uur later. Er worden twee weergaven getoond: dwarsdoorsnedebeelden door de verwondingsplaats en top-down maximale intensiteitsprojectie (MIP's) om het oppervlak van het beeld te visualiseren. Controleogen vertonen geen merkbare verstoring in h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn kritieke stappen met het ASOC OG-letselplatform die moeten worden benadrukt om de kans op succes bij het gebruik van de methodologie te verbeteren. Ten eerste is tijdens de voorste segmentdissectie het behoud van het trabeculaire maaswerk essentieel, maar een uitdaging om correct te doen. Als de TM wordt verstoord, zal het oog de fysiologische druk niet handhaven en niet voldoen aan de criteria om in aanmerking te komen voor experimenteel gebruik. Het wordt aanbevolen om het dissectieproces eerst onder normale om...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben. De meningen in dit artikel zijn die van de auteur(s) en weerspiegelen niet het officiële beleid of standpunt van het US Army Medical Department, Department of the Army, Department of Defense of de Amerikaanse overheid.

Dankbetuigingen

Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Defensie via een interagency-overeenkomst (# 19-1006-IM) met het tijdelijke corneareparatie-acquisitieprogramma (United States Army Medical Materiel Development Agency).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connectorMcMaster-Carr51525K431
10-32 Socket cap screw, ½"McMaster-Carr92196A269
10 mL-spuitBD302995
20 mL-spuitBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
L-sleutel met bolle kopMcMaster-Carr5020A25
BetadineFisher ScientificNC1696484
BD Intramedic PE 160-buisFisher Scientific14-170-12E
WattenstaafjesPuritan25-8061WC
DMEM-mediumATCC30-2002
FBSATCC30-2020
Fijne pincettenWorld Precision Instruments15914
GaasCovidien8044
GentamicineGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
Hoge temperatuur siliconen O-ring, 2 mm breed, 4 mm IDMcMaster-Carr5233T47
Grote pincettenWorld Precision Instruments500365
Grote chirurgische schaarWorld Precision Instruments503261
Pincetten met middelgrote tandenWorld Precision Instruments501217
Nagel (punctievoorwerp)McMaster-Carr97808A503
Nylon spuitfiltersFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Petrischaal (100 mm)FisherFB0875713
Polycarbonaat, drieweg, stopkraan met mannelijke luer lockFisherNC9593742
VeiligheidsmesjeFisher12-640
Roestvrijstalen 18 G 90 graden hoekverdeelnaaldMcMaster-Carr75165A81
Roestvrijstalen 18 G rechte ½'’ verdeelnaaldMcMaster-Carr75165A675
Steriele 100 mL bekers met dekselsVWR15704-092
Vannas schaarWorld Precision InstrumentsWP5070

Referenties

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954(2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218(2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98(2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546(2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251(2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18(2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732(2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496(2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541(2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Open oogletseltherapeutische prestatievolgingintraoculaire drukgezondheid van het corneale epitheelvarkenoogmodeloptische coherentietomografieweefsellevensvatbaarheidinductie van punctieletselbiomateriaaltherapeutica
Anterieur segment orgaancultuurplatform voor het volgen van open globe verwondingen en therapeutische prestaties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.