Methodenartikel

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

DOI:

10.3791/62654

⸱

6 mei 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De potentiële functies van hepatocyt-achtige cellen (HLC's) afkomstig van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) zijn veelbelovend voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreeningtoepassingen. Hier wordt een efficiënte en reproduceerbare methode voor differentiatie van hESC's in functionele HCC's gegeven. De oprichting van een endoderm-afstamming is een belangrijke stap in de differentiatie naar HCC's. Met onze methode reguleren we de belangrijkste signaleringsroutes door continu Activin A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE), gevolgd door het genereren van hepatische voorlopercellen, en ten slotte HCC's met typische hepatocytmorfologie in een stapsgewijze methode met volledig gedefinieerde reagentia. De hESC-afgeleide HCC's die door deze methode worden geproduceerd, drukken stadiumspecifieke markers uit (waaronder albumine, HNF4α nucleaire receptor en natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide (NTCP)), en vertonen speciale kenmerken met betrekking tot volwassen en functionele hepatocyten (waaronder indocyaninegroene kleuring, glycogeenopslag, hematoxyline-eosinekleuring en CYP3-activiteit), en kunnen een platform bieden voor de ontwikkeling van HLC-gebaseerde toepassingen in de studie van leverziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lever is een zeer metabolisch orgaan dat verschillende rollen speelt, waaronder deoxidatie, opslag van glycogeen en afscheiding en synthese van eiwitten1. Verschillende pathogenen, geneesmiddelen en ertstrouw kunnen pathologische veranderingen in de lever veroorzaken en de functies ervan beïnvloeden2,3. Hepatocyten, als de belangrijkste functionele eenheid van de lever, spelen een belangrijke rol in kunstmatige leverondersteunende systemen en eliminatie van geneesmiddelentoxiciteit. De bron van primaire menselijke hepatocyten is echter beperkt in celgebaseerde therapie, evenals in onderzoek naar leverziekten. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe bronnen van functionele menselijke hepatocyten een belangrijke onderzoeksrichting op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Sinds 1998, toen hESC's4werden vastgesteld, zijn hESC's door onderzoekers op grote schaal overwogen vanwege hun superieure differentiatiepotentieel (ze kunnen differentiëren in verschillende weefsels in een geschikte omgeving) en hoge mate van zelfvernieuwbaarheid, en bieden zo ideale broncellen voor bioartificiële levers, hepatocyttransplantatie en zelfs leverweefseltechnologie5.

Momenteel kan de efficiëntie van de leverdifferentiatie sterk worden verhoogd door het endoderm te verrijken6. In de afstammingsdifferentiatie van stamcellen in endoderm zijn niveaus van de transformerende groeifactor β (TGF-β) signalerings- en WNT-signaleringsroutes de belangrijkste factoren in de knoop van de endodermvormingsfase. Activering van een hoog niveau van TGF-β en WNT-signalering kan de ontwikkeling van endoderm7,8bevorderen . Activine A is een cytokine behorend tot de TGF-β superfamilie. Daarom wordt Activine A veel gebruikt bij endoderm inductie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en hESC's9,10. GSK3 is een serine-threonine eiwitkinase. Onderzoekers hebben ontdekt dat CHIR99021, een specifieke remmer van GSK3β, typische WNT-signalen kan stimuleren en stamceldifferentiatie onder bepaalde omstandigheden kan bevorderen, wat suggereert dat CHIR99021 potentieel heeft voor het induceren van stamceldifferentiatie in endoderm 11,12,13.

Hier rapporteren we een efficiënte en reproduceerbare methode om de differentiatie van hESC's in functionele HCC's effectief te induceren. De sequentiële toevoeging van Activin A en CHIR99021 produceerde ongeveer 89,7±0,8% SOX17 (DE marker)-positieve cellen. Na verder gerijpt te zijn in vitro, drukten deze cellen leverspecifieke markers uit en oefenden hepatocyt-achtige morfologie uit (gebaseerd op hematoxyline-eosinekleuring (H & E)) en functies, zoals opname van indocyaninegroen (ICG), glycogeenopslag en CYP3-activiteit. De resultaten tonen aan dat hESC's met succes kunnen worden gedifferentieerd in volwassen functionele HLC's door deze methode en een basis kunnen vormen voor leverziektegerelateerd onderzoek en in vitro geneesmiddelenscreening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stamcelonderhoud

OPMERKING: Het hieronder beschreven celonderhoudsprotocol is van toepassing op de hES03-cellijn die in een aanhangend monolaag wordt onderhouden. Voor alle volgende protocollen in dit manuscript moeten cellen worden behandeld onder een biologische veiligheidskast.

  1. Bereid 1x mTesR stamcelkweekmedium voor door 5x aanvullend medium te verdunnen tot mTesR basismedium.
  2. Bereid 30x hESC-gekwalificeerd Matrigel medium voor door 5 ml hESC-gekwalificeerde Matrigel met 5 ml DMEM/F12 op het ijs te verdunnen. Bewaren bij -20 °C.
  3. Bereid 1x hESC-gekwalificeerd Matrigel-medium voor door 33,3 μL 30x hESC-gekwalificeerde Matrigel te verdunnen met 1 ml DMEM/F12.
  4. Verlaag steriele 6 goed, met weefselkweek behandelde platen met 1 ml 1x hESC-gekwalificeerde Matrigel ruim van tevoren en bewaar 's nachts bij 4 °C. Laat voor gebruik minstens 30 minuten op kamertemperatuur (RT) staan.
  5. Ontdooi de cryopreserved hESCs in een 37 °C waterbad gedurende 3 minuten zonder te schudden. Breng vervolgens onmiddellijk de cellen over door ze in een centrifugebuis van 15 ml te gieten met een voorverwarmd 37 °C mTesR-medium van 4 ml, 2 keer zachtjes op en neer.
  6. Centrifugeer de hESC's bij RT op 200 x g gedurende 2 min.
  7. Aspireer het supernatant en resuspend de cellen voorzichtig in 1 ml mL mTesR-medium.
  8. Aspireer het DMEM/F12-medium uit de plaat en zaai de cellen in een put van 6-putplaat met een dichtheid van 1 x 105 cellen in 2 ml mTesR.
  9. Incubeer in een CO2-incubator van 5% en onderhoud de cellen door dagelijks te vervangen door voorverwarmd mTesR-medium. Passage de cellen op ongeveer 70-80% samenvloeiing of wanneer de celkolonies contact beginnen te maken.

2. Stamcelpassage en differentiatie

  1. Voor passagingcellen het medium aspireren en de cellen incuberen met 1 ml per put enzymoplossing (bijv. Accutase gedurende 5 minuten bij 37 °C. Breng vervolgens de cellen over door ze te pipetten naar een centrifugebuis van 15 ml met 4 ml DMEM/F12 voorverwarmd tot 37 °C.
  2. Centrifugeer de cellen bij RT gedurende 2 min op 200 x g.
  3. Aspireer het medium en resuspend de celkorrel voorzichtig in 1 ml mL mTesR-medium.
  4. Bereid 24-put platen voor door vooraf te coaten met 250 μL 1x hESC-gekwalificeerd Matrigel medium. Zaad hESC's zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 1 - 1,5 x 105 cellen per put in 500 μL mTesR medium.
  5. Laat cellen 24 uur incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator.

3. DE-formatie

  1. Bereid voorraadoplossingen voor van 100 μg/ml Activine A met DPBS die 0,2% BSA en 3 mM CHIR99021 met DMSO bevatten.
  2. Bereid fase I differentiatie basismedium voor door RPMI-medium aan te vullen met 1x B27.
  3. Voeg Activine A toe aan een eindconcentratie van 100 ng/ml en CHIR99021 aan een eindconcentratie van 3 μM in een geschikt volume voorverwarmd basismedium voor differentiatiefase I.
  4. Aspireer mTesR-medium uit de cellen en vervang door fase I-differentiatiemedia met toegevoegde differentiatiefactoren (bijv. 0,5 ml per put van een plaat met 24 put).
  5. Laat cellen 3 dagen incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator, waarbij fase I-media dagelijks worden vervangen door vers toegevoegde differentiatiefactoren (dag 0-2).
    OPMERKING: Na 3 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen markers van DE-cellen uitdrukken, zoals FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 en FOXA1 (minimaal 80% van SOX17 nodig om door te gaan).

4. Differentiatie van leverprogenitorcellen

  1. Bereid fase II differentiatie basismedia voor door knock-out serumvervanging (KOSR) op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 20% in Knock Out DMEM.
  2. Bereid fase II differentiatiemedium met 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x niet-essentiële aminozuuroplossing (NEAA), 100 μM 2-mercaptoethanol en 1x penicilline/streptomycine (P/S) voor op het juiste volume KOSR/knock-out DMEM.
  3. Op dag 3 van differentiatie het medium aspireren en vervangen door stadium II-medium (bijv. 0,5 ml per put van een plaat van 24 put). Incubeer vervolgens gedurende 24 uur.
  4. Op dag 4 van differentiatie het medium aspireren en vervangen door stadium II-medium (bijv. 1 ml per put van een plaat met 24 put).
  5. Vervang het medium om de andere dag (vervang medium op dag 6).
    OPMERKING: Na 8 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen geschikte markers van leverprogenitorcellen uitdrukken, zoals HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimaal 80% van HNF4α nodig om verder te gaan).

5. Hepatocyt differentiatie

  1. Bereid 10 μg/ml hepatocytgroeifactor (HGF), 20 μg/ml Oncostatine (OSM) voorraadoplossingen met DBPS (met 0,2% BSA) en filter met een filtermembraan van 0,22 μm.
  2. Bereid fase III differentiatie basismedium (HepatoZYME-SFM (HZM) medium aangevuld met 10 μM hydrocortison-21-hemisuccinaat en 1x P/S).
  3. Voeg HGF toe aan een eindconcentratie van 10 ng/ml en OSM aan een eindconcentratie van 20 ng/ml aan het juiste volume voorverwarmd fase III differentiatiemedium.
  4. Op dag 8 van differentiatie, aspireer fase II medium uit cellen en vervang door stadium III medium (bijv. 1 ml per put van een 24 put plaat).
  5. Laat cellen 10 dagen incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator en verander de media van fase III om de andere dag met vers toegevoegde differentiatiefactoren (dag 8-18).
    OPMERKING: Na 18 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen karakteristieke markers van hepatocyten uitdrukken, zoals AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Het percentage albuminepositieve cellen is meestal meer dan 90%.

6. RNA-isolatie, cDNA-synthese en RT-qPCR-analyse

  1. Aspireer medium uit cellen en voeg de juiste hoeveelheid RNAiso Plus reagens toe (bijv. 0,3 ml per put van een plaat van 24 well). Verzamel het supernatant in een buis van 1,5 ml en laat 5 minuten bij RT staan.
  2. Voeg 60 μL chloroformreagens toe en laat het 5 minuten bij RT staan. Centrifugeer vervolgens op 12.000 x g gedurende 15 min.
  3. Verzamel het supernatant van 125 μL en breng het over naar een andere centrifugebuis. Voeg 160 μL isopropanol toe, meng goed en ga 10 minuten bij RT staan.
  4. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 10 min.
  5. Verwijder het supernatant, voeg 75% ethanol toe aan het neergeslagene en centrifugeer gedurende 5 minuten op 7.500 x g.
  6. Voeg na het drogen bij RT 40 μL MET DEPC behandeld water toe om op te lossen. Voor qPCR, reverse transcriberen 2 μg van totale RNA met een omgekeerde transcriptie kit volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Voer RT-qPCR uit met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
  8. Normaliseer genexpressie ten opzichte van niet-geïnduceerde stamcellen en bepaal de vouwvariatie na normalisatie naar GAPDH.

7. Immunofluorescentievalidatie van differentiatie

  1. Bereid 1x PBST wasbuffer voor door 0,1% Tween-20 aan PBS toe te voegen.
  2. Aspireer medium uit aanhangcellen en was kort met PBS bij RT op een shaker.
  3. Aspireer PBS en incubeer cellen met 500 μL ijskoud methanol per put van een 24-put plaat om de cellen 's nachts op -20 °C te fixeren.
  4. Verwijder de methanol en was de cellen 3 keer met PBS op een shaker gedurende 10 minuten elke keer bij RT.
  5. Blokkeer cellen met 500 μL van 5% BSA bereid in PBS gedurende 1-2 uur bij RT op een shaker.
  6. Verdun primair antilichaam om 1: 200 in dezelfde oplossing die wordt gebruikt voor blokkering.
  7. Incubeer de vaste cellen in 300 μL primaire antilichaamoplossing 's nachts bij 4 °C op een shaker.
  8. Was de cellen na de nachtelijke incubatie telkens 3 keer met PBST gedurende 10 minuten op RT op een shaker.
  9. Bereid secundaire antilichaamoplossing voor in blokkeringsoplossing om 1:1000.
  10. Incubeer in 300 μL secundaire antilichaamoplossing beschermd tegen licht gedurende 1 uur bij RT op een shaker.
  11. Aspireer secundaire antilichaamoplossing en was cellen 3 keer met PBST gedurende 10 minuten elke keer bij RT op een shaker.
  12. Incubeer cellen met 300 μL van 1 μg/ml DAPI gedurende 3-5 minuten en was vervolgens tweemaal met PBST.
  13. Voeg na het aspireren van PBST een geschikte hoeveelheid PBS toe voor het maken van foto's onder een fluorescentiemicroscoop.

8. Westerse vlekanalyse

  1. Bereid 1x TBST wasbuffer door 0,1% Tween-20 toe te voegen aan Tris-buffered zoutoplossing (TBS).
  2. Bereid SDS-PAGE elektroforesebuffer en western transferbuffer voor met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Los het totale celeiwit (40 μg) op op een polyacrylamidegel van 10% natriumdodecylsulfaat en voer in SDS-PAGE elektroforesebuffer bij een constante stroom van 15 mA gedurende ongeveer 2 uur.
  4. Breng de gel over op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij een constante stroom van 300 mA gedurende 2 uur bij lage temperatuur.
    OPMERKING: De looptijd en overdrachtstijd kunnen variëren, afhankelijk van de gebruikte apparatuur en het type en percentage van de gel.
  5. Blokkeer het membraan met 3% BSA bereid in TBST gedurende 1 uur bij RT op een shaker.
  6. Incubeer 's nachts bij 4 °C op een shaker in primaire antilichaamoplossing (1:1000 verdunning).
  7. Was na de nachtelijke incubatie het blaasmembraan 3 keer met TBST gedurende 15 minuten per keer bij RT op een shaker.
  8. Incubeer in secundaire antilichaamoplossing (1:2000 verdunning) gedurende 2 uur bij RT op een shaker.
  9. Gooi secundaire antilichaamoplossing weg en was het membraan 3 keer met TBST, telkens gedurende 15 minuten, bij RT op een shaker.
  10. Visualiseer immunoreactieve banden met behulp van een chemiluminescentiereagens gevolgd door autoradiografie. Gebruik β-actine als beladingsregelaar.

9. Indocyanine groene opname

  1. Bereid 200 mg/ml indocyanine groene stamoplossing in DMSO.
  2. Bereid een werkoplossing voor door fase III differentiatiemedium aan te vullen met indocyanine groene oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/ml.
  3. Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 1-2 uur.
  4. Aspireer medium en was de cellen 3 keer met PBS.
  5. Fotografeer onder een microscoop.

10. Periodieke Acid-Schiff (PAS) kleuring en Hematoxyline-Eosine (H&E) kleuring

  1. Aspireer medium uit aanhangcellen en was kort twee keer met PBS.
  2. Voor celfixatie aspireren PBS en incuberen cellen met ijskoude methanol bij -20 °C 's nachts.
  3. Visualiseer glycogeenopslag door PAS-kleuring en observeer binucleated cellen door H & E-kleuring met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Maak foto's met een fluorescentiemicroscoop.

11. Test voor CYP-activiteit

  1. Meet cyp450-activiteit met behulp van in de handel verkrijgde celgebaseerde assays (P450-Glo-assays) volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Gebruik drie onafhankelijke herhalingen om te testen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het schematische diagram van HLC-inductie van hESC 's en representatieve bright-field beelden van elke differentiatiefase zijn weergegeven in figuur 1. In fase I werden Activine A en CHIR99021 gedurende 3 dagen toegevoegd om stamcellen te induceren om endodermcellen te vormen. In fase II differentieerden de endodermcellen zich in hepatische voorlopercellen nadat ze gedurende 5 dagen met differentiatiemedium waren behandeld. In stadium III waren vroege hepatocyten gerijpt en gedifferentieerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een stapsgewijze methode die HCC's uit hESC's in drie fasen induceert. In de eerste fase werden Activin A en CHIR99021 gebruikt om hESC's te differentiëren in DE. In de tweede fase werden KO-DMEM en DMSO gebruikt om DE te differentiëren in hepatische voorlopercellen. In de derde fase werden HZM plus HGF, OSM en hydrocortison 21-hemisuccinaatnatriumzout gebruikt om leverfappende voorlopercellen te blijven differentiëren in HCC's.

Bij het gebruik van het protocol moet rekenin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. 81870432 and 81570567 to X.L.Z.), (No. 81571994 to P.N.S.); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2020A1515010054 aan P.N.S.), de Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). We willen prof. Stanley Lin van shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolSigmaM7522Voor differentiatie van hepatische progenitor
488 gelabelde geit tegen muis IgGZSGB-BIOZF-0512Voor IF, tweede antilichaam
488 gelabelde geit tegen konijn IgGZSGB-BIOZF-0516Voor IF, tweede antilichaam
AccutaseStem Cell Technologies7920Voor celpassage
Activine ApeproTech120-14EVoor definitieve endodermvorming
Anti - Albumine (ALB)Sigma-AldrichA6684Voor IF en WB, primair antilichaam
Anti - Human Oct4AbcamAb19587Voor IF, primair antilichaam
Anti - α-Fetoproteïne (AFP)Sigma-AldrichA8452Voor IF en WB, primair antilichaam
Anti -SOX17Abcamab224637Voor IF, primair antilichaam
Anti-Hepatocyte Nucleaire Factor 4 alpha (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164Voor IF, primair antilichaam
B-27 SupplementGibco17504-044Voor definitieve endodermvorming
BSABeyotimeST023-200gVoor celblokkering
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Voor definitieve endodermvorming
DAPIBeyotimeC1006Voor nucleaire kleuring
DEPC-waterBeyotimeR0021Voor RNA-oplossing
DM3189MCEHY-12071Voor definitieve endodermvorming
DMEM/F12Gibco11320-033Voor celcultuur
DMSOSigma-AldrichD5879Voor differentiatie van hepatische progenitor
DPBSGibco14190-144Voor celcultuur
GlutaMAXGibco35050-061Voor differentiatie van hepatische progenitor
H&E kleuringskitBeyotimeC0105SVoor H&E kleuring
Hepatocyte groeifactor (HGF)peproTech100-39Voor hepatocytendifferentiatie
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021Voor hepatocytendifferentiatie
Hydrocortison-21-hemisuccinaatSigma-AldrichH4881Voor hepatocytendifferentiatie
IndocyanineSangon BiotechA606326Voor Indocyanine kleuring
Knock Out DMEMGibco10829-018Voor differentiatie van hepatische progenitor
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Voor differentiatie van hepatische progenitor
Matrigel hESC-gekwalificeerdCorning354277Voor celcultuur
MEM NeAAGibco11140-050Voor differentiatie van hepatische progenitor
mTesR 5X SupplementStem Cell Technologies85852Voor celcultuur
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851Voor celcultuur
Oncostatin (OSM)peproTech300-10Voor hepatocytendifferentiatie
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901Voor CYP450-activiteit
PAS kleuringskitSolarbioG1281Voor PAS kleuring
Pen/StrepGibco15140-122Voor celdifferentiatie
Peroxidase-geconjugeerd geit anti-muis IgGZSGB-BIOZB-2305Voor WB, tweede antilichaam
Primair Antilichaam Verdunningsbuffer voor Western BlotBeyotimeP0256Voor primaire antilichaamverdunning
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Voor cDNA-synthese
RNAiso PlusTaKaRa9109Voor RNA-isolatie
RPMI 1640Gibco11875093Voor definitieve endodermvorming
MelkroomSangon BiotechA600669Voor tweede antilichaamvoorbereiding
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Voor RT-PCR-analyse
Torin2MCEHY-13002Voor definitieve endodermvorming
TweenSigma-AldrichWXBB7485VVoor bereiding van wasbuffer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763(2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212(2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

Gerelateerde artikelen