In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Live cell imaging is vooral nodig om de cellulaire en moleculaire mechanismen te begrijpen die organelbewegingen, cytoskeletherschikkingen of polariteitspatronen in de cellen reguleren. Bij het bestuderen van de positionering van oöcytenkernen zijn livebeeldvormingstechnieken essentieel om de dynamische gebeurtenissen van dit proces vast te leggen. De Drosophila-eierkamer is een meercellige structuur en een uitstekend modelsysteem om dit fenomeen te bestuderen vanwege de grote omvang en beschikbaarheid van tal van genetische hulpmiddelen. Tijdens Drosophila mid-oogenese migreert de kern vanuit een centrale positie binnen de oöcyt om een asymmetrische positie aan te nemen die wordt gemedieerd door microtubuli-gegenereerde krachten. Deze migratie en positionering van de kern zijn nodig om de polariteitsassen van het embryo en de daaropvolgende volwassen vlieg te bepalen. Een kenmerk van deze migratie is dat het plaatsvindt in drie dimensies (3D), waardoor een noodzaak voor live beeldvorming ontstaat. Om de mechanismen te bestuderen die nucleaire migratie reguleren, hebben we een protocol ontwikkeld om de ontlede eierkamers te cultuleren en live beeldvorming uit te voeren gedurende 12 uur door time-lapse-acquisities met behulp van confocale microscopie met spin-schijf. Over het algemeen stellen onze omstandigheden ons in staat om drosophila-eierkamers lange tijd in leven te houden, waardoor de voltooiing van nucleaire migratie in een groot aantal monsters in 3D kan worden gevisualiseerd.
Inleiding
Sinds enkele jaren is de Drosophila-oöcyt een modelsysteem om nucleaire migratie te bestuderen. De Drosophila oöcyt ontwikkelt zich in een meercellige structuur genaamd de eikamer. Eikamers omvatten 16 kiemcellen (15 verpleegstercellen en de oöcyt) omgeven door een epitheellaag van folliculaire somatische cellen. De ontwikkeling van de eikamer is onderverdeeld in 14 stadia(figuur 1A),waarin de oöcyt zal groeien en reserves zal opbouwen die nodig zijn voor de vroege ontwikkeling van het embryo. Tijdens de ontwikkeling, bij microtubulireorganisatie en asymmetrisch transport van maternale determinanten, polariseert de oöcyt langs de antero-dorsale en dorso-ventrale assen. Deze assen bepalen de daaropvolgende polariteitsassen van het embryo en de volwassene die voortvloeien uit de bevruchting van deze oöcyt1. Tijdens oogenese neemt de kern een asymmetrische positie in de oöcyt in. In fase 6 is de kern gecentreerd in de cel. Bij een nog te identificeren signaal dat wordt uitgezonden door de achterste folliculaire cellen dat door de oöcyt wordt ontvangen, migreert de kern naar het snijpunt tussen de voorste en laterale plasmamembranen in fase 7 (Figuur 1B)2,3. Deze asymmetrische positie is nodig om de bepaling van de dorso-ventrale as te induceren.
Figuur 1: Drosophila melanogaster eierkamers. (A) Vaste ovariole van transgene vliegen die Fs(2)Ket-GFP uitdrukken die de nucleaire enveloppen en ubi-PH-RFP labelt die de plasmamembranen etiketteert. De ovariole bestaat uit het ontwikkelen van eierkamers in verschillende stadia. De rijping neemt toe langs de antero-posterieure as met het germarium aan de voorste punt (links) waar de kiemstamcel zich bevindt en het oudere stadium aan de achterste punt (rechts). (B) Z-projectie van levende eierkamer door het spinnen van schijf confocale microscopie in stadium 6 van oogenese (links), waarin de kern is gecentreerd in de oöcyt. De kern migreert om een asymmetrische positie in te nemen in stadium 7 (rechts) in contact met het voorste plasmamembraan (tussen de oöcyt en de verpleegkundige cel) en het laterale plasmamembraan (tussen de oöcyt en de folliculaire cellen). Deze positie zal de bepaling van de dorsale kant en dus de dorso-ventrale as van de eierkamer induceren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Al vele decennia wordt deze nucleaire migratie bestudeerd op vaste weefsels door immunostaining. Deze aanpak heeft met name aangetoond dat dit proces afhankelijk is van een dicht netwerk van microtubuli4,5. Meer recent hebben we een protocol ontwikkeld met voorwaarden die compatibel zijn met live beeldvorming van de oöcyt gedurende enkele uren, waardoor het mogelijk is om dit proces dynamisch te bestuderen6.
Daarom hebben we voor het eerst kunnen beschrijven dat de kern tijdens zijn migratie voorkeurs- en karakteristieke trajecten heeft, een langs het voorste plasmamembraan (APM) en een andere langs het laterale plasmamembraan (LPM) van de oöcyt (figuur 2). Deze laatste resultaten onderstrepen het belang van live-imaging protocollen bij het bestuderen van dynamische processen zoals nucleaire migratie.
Figuur 2: Schematische weergave van de verschillende migratiepaden van de kern. In stadium 6 van de oogenese is de oöcyt een grote cel met een centrale kern. In dit stadium wordt de antero-posterieure polariteitsas ingesteld met een posterieure/laterale plasmamembraan van de oöcyt in contact met de folliculaire cellen en het voorste plasmamembraan (in geel) staat in contact met de verpleegkundige cellen2. We hebben eerder gemeld dat de kern kan migreren langs het voorste plasmamembraan (APM), langs het laterale plasmamembraan (LPM), of via het cytoplasma (STAD, rechtstreeks naar de antero-dorsale cortex)6. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
De oöcytkernmigratie is een fenomeen van ongeveer 3 h6, en tot nu toe is de gebeurtenis die het begin van de daadwerkelijke migratie veroorzaakt onbekend. Het begin van de migratie kan ook worden vertraagd door eiwitmutanten die worden gebruikt om dit mechanisme te bestuderen. Deze onbekende variabelen motiveerden ons om beelden te verwerven over lange periodes (10-12 uur). Het is daarom belangrijk om ervoor te zorgen dat de oöcyten in leven blijven. Naarmate de eierkamer zich ontwikkelt, verlengt deze langs de voorste-posterieure as van een bolvormige naar een elliptische vorm. Deze rek wordt aangedreven door de rotatie van folliculaire cellen, die plaatsvindt van stadium 1 tot stadium 8, loodrecht op de voorste-posterieure as7. Bovendien omringt een buisvormige spierschede met pulsatile eigenschap de eierkamers. Zijn fysiologische functie is om de ontwikkelende follikels naar de eileider onophoudelijk te duwen8. Om de bewegingen te beperken die na hun dissectie oscillaties van de eierkamers veroorzaken, hebben we een observatiemicrokamer ontworpen van 150 μm hoog (figuur 3A). Deze hoogte is marginaal hoger dan de grootte van een follikel in fase 10 en 11. Het beperkt de verticale bewegingen van het monster aanzienlijk met behoud van de rotatie van de eikamer, wat resulteert in beperkte defecten in de follikelontwikkeling. Vervolgens voeren we gedurende 12 uur live beeldvorming uit op ontleedde eierkamers door time-lapse-acquisities met meerdere standen met behulp van een confocale microscoop met spinschijf. Hier beschrijven we ons protocol voor het bestuderen van de oöcyt nucleaire migratie tussen fase 6 en 7.
Figuur 3: Schematische weergave van de observatiekamer. (A) (Bovenaanzicht) Precieze afmetingen van de aluminium glijbaan met de hoogten (A') en omtrek (A'') van de put die in het midden van de glijbaan is geboord. (B) (Onderste weergave) Een afdeklip die de put blokkeert, wordt met siliciumvet op de glijbaan afgedicht. (C) (Bovenaanzicht) Ontlede ovarioles ontwikkelen zich in een beeldvormingsmedium dat wordt bedekt door een gasdoorlatend membraan. Halocarbon olie wordt gebruikt om het membraan te stabiliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Om de nucleaire migratie te volgen en trajecten in de oöcyt nauwkeurig te beoordelen, zijn markers nodig voor zowel de nucleaire envelop als het plasmamembraan. Met dit doel zijn twee transgenen geselecteerd die een hoge signaal/ruisverhouding hebben en niet vervagen in de loop van live beeldvorming. Om het plasmamembraan te labelen, wordt het gebruik van een P[ubi-PH-RFP] dat codeert voor het Pleckstrin Homology (PH) domein van de Human Phospholipase C ∂1 (PLC∂1) gefuseerd met RFP aanbevolen. Dit PH-domein bindt aan het phosphoinositide PI(4,5)P2 verdeeld over het plasmamembraan van de oöcyt9. Voor de nucleaire enveloppe geeft de P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP eiwitvalstam waarbij GFP wordt ingevoegd in het gen dat codeert voor de Drosophila ß-importine een homogeen en intens signaalweer 10. Jonge vliegen (1-2 dagen oud) worden 24-48 uur voor eierstokdissectie in verse flesjes met droge gist geplaatst.
Voor deze live-imaging test is een 1 mm dik stuk aluminium, dat niet reactief is voor het monster, in de afmetingen van een microscopieschuif gesneden. Het heeft een gat met een diameter van 16 mm in het midden van de glijbaan dat is tegengeplaatst tot 0,85 mm. Deze counterbore heeft een extra gat met een diameter van 6 mm met een diepte van 150 μm (figuur 3A). Aan de onderkant van de aluminiumkamer wordt een afdeklip gelijmd met siliconenvet (inert voor het monster) (afbeelding 3B). Na het plaatsen van de monsters in de medium gevulde put wordt een membraan doorlaatbaar tot O2/CO2-uitwisseling over het medium geplaatst en omgeven door halokoolstofolie (figuur 3C).
Voor de dissectie wordt aanbevolen om roestvrijstalen tangen met een tipmaat van 0,05 x 0,02 mm en naalden met een diameter van 0,20 mm te gebruiken voor de scheiding van de ovarioles(figuur 4B, C). De migrerende kernen worden afgebeeld op een spin-schijf confocale omgekeerde microscoop CSU-X1 uitgerust met een camera. Multi-position beelden werden verkregen door time-lapse elke 15 minuten bij 24 °C. Een interval van 15 minuten maakt het mogelijk om multipositie-acquisities uit te voeren met beperkte fotobleaching van de fluorescerende eiwitten en fototoxiciteit voor de monsters. Bovendien zou een korter interval niet veel meer informatieve gegevens opleveren om de nucleaire trajecten te volgen. De films worden verwerkt en geanalyseerd via Fiji software11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Beeldvorming medium voorbereiding
- Bereid verse media voor op de dag van gebruik. Pipet 200 μL Schneider medium (met L-Glutamine en 0,40 g/L NaHCO3 aangevuld met 10% warmte-inactief foetale kalfsserum, 100 U/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine).
- Supplement met 30 μL insuline 10 mg/ml.
- Voeg 4 μL warmte-inactief foetale kalfsserum toe.
2. Voorbereiding observatiekamer
- Breng met een pipettip een kleine hoeveelheid siliconenvet aan rondom het gat aan de onderkant van de doorboorde glijbaan (afbeelding 4D).
- Plaats een afdeklip van 24 x 50 mm van 0,13-0,16 mm dikte.
- Oefen met het brede uiteinde van een pipetpunt druk uit op de afdeklip om de siliconen plat te maken om de afdeklip af te dichten en een siliconenringinterieur op de dia te maken(afbeelding 4F, G).
3. Eierstokdissectie
- Verdoof een vrouwelijke vlieg van het gewenste fenotype op een CO2-pad.
- Breng het vrouwtje over in 150 μL van het beeldvormingsmedium in een ontleedput (figuur 4H).
- Open een vrouw door zijn thorax met een tang te grijpen en de dorsale buikslolula te knijpen met een tweede paar tangen.
- Isoleer en maak het paar eierstokken los, dat gemakkelijk zichtbaar moet zijn bij het openen van de nagelriem.
- Verwijder voorzichtig de baarmoeder, eileider en spierschede(figuur 4I).
- Plaats een druppel van 10-15 μL van het beeldvormingsmedium en breng één eierstok over in de beeldvormingskamer (Figuur 4J,K).
4. De kamerisolatie van het ei
- Om de ovarioles te scheiden, houdt u het achterste uiteinde van de eierstok (naar de oudere stadia) met de naald. Plaag de ovarioles uit elkaar door voorzichtig aan het germarium te trekken met een andere naald.
- Verwijder de resterende spierschede op de eierkamers; de ene naald houdt de huls vast en de andere trekt aan de ovariole door de grotere kamers (stadium 9 of ouder).
- Laat de onverwarmde ovariole zinken en neem contact op met de hoeslip.
- Verwijder late stadia en de rest van de eierstokken uit de microkamer met behulp van een tang. Neem voorzichtig afstand van de ovarioles van de anderen met naalden om de verwerving te vergemakkelijken (Figuur 4L).
5. Sluiting observatiekamer
- Snijd een klein vierkantje (10 x 10 mm) doorlaatbaar membraan(afbeelding 4M,N).
- Breng het membraan voorzichtig aan op het beeldvormingsmedium om eventuele luchtbellen te verdrijven (figuur 4O).
- Sluit de kamer hermetisch af met een dunne laag halokoolstofolie rond de put op de contour van het membraan(figuur 4P,Q).
6. Beeldvorming
- Plaats de beeldvormingsopstelling op de diahouder van de omgekeerde microscoop met behulp van een 40x objectief (HCX PL Apo, 1.25NA, olie-onderdompeling).
- Zoek en bewaar posities van verschillende fase 6-oöcyten waarin de kern klaar is om te migreren.
- Stel de 488 en 561 nm lasers in. Gebruik bij een gemeten uitgangslaservermogen van 150 mW respectievelijk 30% van het laservermogen en 300 ms en 500 ms blootstelling.
- Zet het experiment op. Neem een time-lapse van 12 uur met een interval van 15 min-41 secties met een interval van 1 μm gecentreerd op de kern.
OPMERKING: Volgens de hierboven beschreven belichtingstijd maakt deze instelling het mogelijk om één positie in ongeveer 45 s te verwerven. Aangezien er vertraging is als gevolg van positieverandering, wordt aanbevolen om in deze omstandigheden maximaal 12 posities in te stellen.
7. Beeldanalyse
- Verwerk de films op de software Fiji, met behulp van de plug-in Orthogonal view en volg handmatig de kernen.
Figuur 4: Stap voor stap microkamer montage foto's. (A, B, C) Voorbereiding van de benodigde gereedschappen: het ontleden van putplaat, tang, naalden, beeldvormende media, siliciumvet, doorlatend membraan en de aluminiumschuif. (D) Aanbrengen van het siliciumvet aan de achterkant van de aluminium glijbaan met een pipetpunt. (E) Een glazen afdeklip wordt op het siliciumvet gelijmd om de bodem van de kamer te creëren. (F,G) Druk op de afdeklip met de bredere extremiteit van een pipetpunt om een verbinding in de kamer te creëren. (H,I) Dissectie van de eierstokken van de vlieg in de beeldvormende media. (J) Pipetten van een druppel beeldvormingsmedia in de microkamer. (K,L) Scheiding van de ovarioles in de microkamer met behulp van naalden. (M,N,O) Doorlatend membraan gesneden in een vierkant van 10 x 10 mm en over de druppel van het medium in de microkamer geplaatst. (P,Q) Afdichting van de microkamer met halocarbonolie. De monsters zijn klaar om in beeld te worden genomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vóór de migratie is de kern dynamisch en oscilleert rond een centrale positie gedurende een periode die is gedefinieerd als pre-migratie. Deze kleine bewegingen weerspiegelen een evenwicht van duwende en trekkende krachten die het evenwicht in het midden van de oöcyt handhaven. Door de trajecten van de kernen te kwantificeren, hebben we aangetoond dat de APM- en LPM-trajecten vergelijkbare verhoudingen hadden. We definiëren de aard van het traject door het eerste contact tussen de kern en het plasmamembraan
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Andere protocollen beschrijven hoe drosophila-eierkamers ex vivo kunnen worden voorbereid en gekweekt voor live-imaging assay12,13. De nieuwigheid van dit protocol is het gebruik van een beeldvormingskamer die is gebouwd met behulp van een uitgeholde aluminium schuif, een afdeklip en een O2/ CO2 doorlatend membraan. Het belangrijkste voordeel van deze opstelling is om de beweging in Z te beperken zonder druk uit te oefenen op het mo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
We zijn Jean-Antoine Lepesant en Nicolas Tissot zeer dankbaar die het protocol oorspronkelijk ontwikkelden en enkele grafische elementen van figuur 3 met ons deelden. We danken Fanny Roland-Gosselin die de foto's van figuur 4 heeft gemaakt. We danken ook andere lableden voor nuttige discussies die hebben bijgedragen aan de verbetering van deze techniek en Nathaniel Henneman voor zijn opmerkingen die hebben bijgedragen aan het verbeteren van dit manuscript. We erkennen de ImagoSeine kernfaciliteit van het Instituut Jacques Monod, lid van France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Franse ministerie van Onderzoek (MESRI). Antoine Guichet en Fred Bernard werden ondersteund door de ARC (Grant PJA20181208148), de Association des Entreprises contretre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) en door een Emergence grant van IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
Referenties
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168(2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
